CC BY
50
© Коллектив авторов, 1997 УДК 616.15-085.357:616.71 -018.46
П. В. Сергеев, А. С. Духанин, Н. Е. Кушттскш
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ НА ПУРИНЕРГИЧЕСКУЮ РЕЦЕПТОРНУЮ СИСТЕМУ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И ЛИМФОБЛАСТАХ КОСТНОГО МОЗГА
НИИ клинической онкологии, Российский государственный медицинский университет, Маской
Клетки иммунной системы содержат рецепторы к целому ряду биологически активных веществ, включая инсулин, гормон роста, кортикостероиды, эстрогены, андрогены, ацетилхолин, адреналин, пурины, эндорфи-ны и энкефалины. Среди большого числа агентов гормональной природы, избирательно модулирующих иммунологические функции, особое внимание исследователей на протяжении многих лет привлекают глюкокортико-идные гормоны. Это обусловлено, с одной стороны, участием глюкокортикоидов (ГК) в адаптационных процессах [2—4], их способностью непосредственно влиять на функции иммунокомпетентных клеток [9], с другой — сложностью и множественностью механизмов действия кортикостероидных гормонов [6].
Молекулярные механизмы ингибирования функциональной активности лимфоидных клеток ГК включают: ингибирование путей передачи сигнала внутри лимфоидных клеток, опосредованных через систему вторичных мессенджеров; регуляцию экспрессии и экспозиции на поверхность клеток мембранных рецепторов к лимфокинам; блокирование транскрипции генов, кодирующих интерлейкины и колониестимулирующие факторы в лимфоидных клетках.
В регуляции иммунитета принимает активное участие также и пуринергическая система. Эндогенные физиологически активные вещества — лиганды пуриновых рецепторов (аденозин) и фармакологические препараты (теофиллин, 8-хлораденозин) способны вмешиваться в лимфопоэз. Пурины участвуют в синтезе РНК, ДНК, белка и некоторых ключевых коферментов; с их помощью формируются субклеточные структуры и осуществляется регуляция разнообразных ферментативных реакций [11, 13]. Присутствующие на всех типах лимфоидных клеток и сопряженные с аденилатциклазой (АЦ) рецепторы аденозина (А,- и А,-подтипы) принимают участие в регуляции их пролиферации, диффе-ренцировки и созревания. Аденозин оказывает биологическое действие широкого спектра. К основным его эффектам можно отнести вазодилатацию, бронхокон-стрикцию, иммунодепрессию. В условиях стресса, например при гипоксии, внутриклеточная концентрация аденозина резко возрастает. Аденозин проникает через плазматическую мембрану вероятнее всего по механизму простой диффузии; при этом его уровень в плазме крови возрастает до 1—3 мкМ. Именно в этих концентрациях реализуется иммуносупрессорное действие аденозина. В то же время генетически детерминиро-
P. V. Sergeyev, A. S. Dukhanin, N. E. Kushlinsky
COMPARATIVE ANALYSIS OF GLUCOCORTICOID EFFECTS ON PURINERGIC RECEPTORS IN PERIPHERAL LYMPHOCYTES AND BONE MARROW LYMPHOBLASTS
Research Institute of Clinical Oncology, Russian State Medical Vni versity, Masco) v
Immune system cells contain receptors to a number of biologically active agents including insulin, growth hormone, endorphines and encephalines. Over the last years many studies were focused on glucocorticoid hormones as selective modulators of immunity functions. This was mainly due to glucocorticoid (GC) contribution to adaptation processes [2-4] and ability to influence immunocompetent cell functioning [9] on the one hand, and to the complex and multiple mechanisms of action of corticosteroid hormones [6] on the other hand.
Molecular mechanisms of inhibition of lymphoid cell functional activity by GC include: inhibition of signal pathways inside lymphoid cells mediated by secondary messengers; regulation of cell surface expression and exposure of membrane lymphokine receptors; block of transcription of genes coding interleukines and colony stimulating factors in lymphoid cells.
Purinergic system also makes a large contribution to the immunity regulation. Endogenous physiologically active substances such as purine receptor ligands (adenosine) and pharmacological agents (theophillin, 8-chloradenosine) can interfere with lymphopoiesis. Purines participate in synthesis of RNA, DNA, protein and some key coenzymes: they assist in formation of sub-cellular structures and regulation of various enzymatic reactions [11, 13]. Adenosine receptors (A, and A2 sub-types) that are present on all lymphoid cells and are conjugated with adenylate cyclase (AC) take part in regulation of lymphoid cell proliferation, differentiation and maturation. Adenosine produces a variety of biologic effects, including vasodilatation, bronchoconstriction and immunodepression. Adenosine intracellular concentration increases sharply under stress, e. g. in hypoxy. Adenosine penetrates plasmatic membrane most likely by simple diffusion and its plasmatic level increases to
1-3 mcM. It is at these concentrations that adenosine produces immunosuppression effect. Genetically determined decrease in the key purine metabolism enzyme, adenosine desaminase, leads to adenosine elevation and underlies congenital immunodeficiency [1].
There is much evidence of the fact that individual cell receptor systems are not isolated signal systems. They work together by interacting with each other and regulating each other. The recent foreign publications refer to such interactions as “cross-talk’ [7, 8, 10]. It is of much interest to find points of “intersection” in
ванное снижение активности одного из ключевых ферментов метаболизма пуринов — аденозиндезаминазы — приводит к повышению содержания аденозина и является причиной врожденного иммунодефицита [1].
В настоящее время появляется все больше свидетельств того, что отдельные рецепторные системы клетки не являются некими изолированными друг от друга сигнальными системами. Они работают “сообща”, взаимодействуя и регулируя друг друга. В зарубежной литературе последних лет [7, 8, 10] появился даже специальный термин — “cross-talk”, что в дословном переводе означает “переговоры” друг с другом различных рецепторных систем. С этой точки зрения интересным и важным представляется определение точек “пересечения” в механизмах действия соединений, обладающих внутриклеточным и мембранным типом рецепции.
Как было отмечено, ГК и агонисты пуриновых рецепторов оказывают сходное иммуносупрессирующее действие на лимфоидные клетки, однако взаимоотношение пуринергической и глюкокортикоидной рецепторных систем до настоящего времени мало изучено и требует детального рассмотрения.
Целью настоящей работы явилось исследование влияния ГК на механизмы передачи сигнала в пуринергической рецепторной системе лимфоидных клеток.
Объектом исследования служили лимфобласты костного мозга и лимфоциты периферической крови человека.
Материалы и методы. Работа выполнена на лимфобластах костного мозга больных острым лимфобластным лейкозом, проходящих курс лечения в 14-м гематологическом отделении детской ГКБ № 1 (Москва). Диагноз устанавливали на основе клинико-лабораторных исследований в соответствии с классификацией опухолевых заболеваний крови и лимфоидной ткани ВОЗ (1976). Обследовано 32 больных (10 девочек и 22 мальчика) в возрасте от 1 года до 9 лет. Исследование проводили дважды: первый раз во время биопсии костного мозга, проводимой с диагностической целью, второй раз — в динамике после курса гормональной терапии (2 мг преднизолона на 1 кг массы тела в течение 10 дней).
Лимфоциты периферической крови были получены от здоровых доноров и больных бронхиальной астмой.
Выделение лимфобластов из пунктата костного мозга. Пунктат костного мозга (0,5—1,5 мл) помещали в HEPES-буфер (NaCl 140 мМ, KCI 5 мМ, MgS04 1 мМ, Glu 5 мМ, Na2HP04 1 мМ, СаСЬ
1 мМ, HEPES 10 мМ). Полученную суспензию фильтровали через капроновую сетку и отмывали в том же буфере, центрифугируя при 800 g 10 мин. Затем концентрацию клеток доводили до 10—20 млн/мл, подсчитывая их число в камере Горяева.
Изучение специфического связывания лигандов пуриновых рецепторов с лимфоидными клетками. В пробы, содержащие по 120 мкл суспензии клеток, вносили 10 мкл раствора меченого NECA в HEPES-буфере до конечных концентраций 0,1—5 мкМ и 10 мкл избытка немеченого аденозина в случае лимфобластов или 10 мкМ 3,7-ди-метил-1-пропаргилксантипа (DMPX, селективный антагонист Аг-тнпа аденозниовых рецепторов) в случае лимфоцитов. Конечная концентрация аденозина и DMPX в среде инкубации составляла 3- Ю-5 М. Пробы инкубировали в течение 30 мин при температуре 37 °С. Специфическое связывание 3H-NECA вычисляли как разницу между количеством связанного клетками NECA в отсутствие и в присутствии немеченого аденозина или DMPX. Конкурентный анализ связывания 3H-NECA клетками в присутствии различных немеченых лигандов А2-рецепторов (аденозип, NECA, 5’-М-метилкарбоксамидоаденознн, 2-фенпламиноадепознп) и цитостатиков (6-меркаптопурин — 6-МП, азатнопрнн — АЗТ) проводили по описанной выше схеме. Конечная концентрация аденозина, NECA, 5’-Ы-метилкарбоксамидоаденозина, 2-фешшаминоаденозина в среде инкубации 3- 10-5 М. По окончании
mechanisms of action of compounds with intracellular and membrane reception.
As mentioned above, GC and purine receptor agonists produce similar immunosuppressive effects on lymphoid cells, however, the relationship of purinergic and glucocorticoid receptor systems is not yet clear and requires comprehensive study.
The purpose of this study was to analyze GC effects on mechanisms of signal transmission in the lymphoid cell purinergic receptor system.
Human bone marrow lymphoblasts and peripheral lymphocytes were the study object.
Materials and Methods. The study was performed on bone marrow lymphoblasts of patients with acute lymphoblastic leukemia managed at the 14th Hematology Department of Clinical Pediatric Hospital No. 1 (Moscow). The diagnosis was made basing on clinical laboratory findings in accordance with the WHO Classification of Hematology and Lymphoid Malignancies (1976). There were 32 patients (10 girls and 22 boys) of age ranging from 1 to 9 years included in the study. Two evaluations were made: first after diagnostic bone marrow biopsy and then after a hormonal therapy cycle (prednizolone at
2 mg per kg body weight for 10 days).
Peripheral blood lymphocytes were taken from healthy donors and patients with bronchial asthma.
Lymphoblast extraction from bone marrow bioptic specimens. The bone marrow bioptic specimens (0.5-1.5 ml) were transferred to HEPES buffer (NaCl 14fl mM, KCI 5 mM, MgS04 1 mM, Glu 5 mM, Na2HP04 1 mM, CaCl2 1 mM, HEPES 10 mM). The resultant suspension was filtered through a nylon filter and washed in the same buffer by centrifugation at 188 g for 10 min. Cell concentration was increased to 10-10 million per ml, the measurement being performed using a Goryaev chamber.
Study of specific binding of purine receptor ligands with lymphoid cells. 10 mcl labeled NECA solution in HEPES buffer up to end concentration 0.1-5 mcM and 10 mcl non-labeled adenosine excess in cases of lymphoblasts or 10 mcM 3.7-dimethyl-l-propargyl xanthine (DMPX, selective antagonist of A2 adenosine receptors) in case of lymphocytes were transferred to specimens containing 120 mcl cell suspension each. Adenosine and DMPX end concentrations in the incubation medium were 3x1 O'5 M. The specimens were incubated 30 min at 37°C. 3H-NECA specific binding was calculated as the difference between amounts of cell bound NECA in the absence and presence of non-labeled adenosine or DMPX. Analysis of competitive 3H-NECA cell binding in the presence of various non-labeled A2 receptor ligands (adenosine, NECA, 6’-N-methylcarboxamide adenosine, 2-phenylamine adenosine) and cytostatics (6-mercap-topurine, 6-MP; azathioprine, AZT) was performed according the above-described procedure. End concentrations of adenosine, NECA, 5’-N-methylcarboxamide adenosine, 2-phenylamine adenosine in incubation medium were 3xl0-5 M. On incubation cessation aliquots (100 mcl) were rapidly transferred onto GFC Whatman filters and washed two times with 2 ml HEPES buffer (/ = 4°C). The filters were dried at room temperature and placed in vials with scintillation liquid to measure labeled NECA by liquid radiometry.
Binding of 3H-phenylisopropyl adenosine (3H-PIA) with lymphoid cell A]-receptors was effected in the same way as that of 3H-NECA and Aj-receptors using 3H-PIA as a specific ligand (end concentration 0.1-5 nM). Non-specific 3H-P1A binding was defined as binding in the presence of 2-chloradenosine (end concentration 3x1 O'8 M). Specimens were incubated 30 min at 37°C. 3H-PIA specific binding was calculated as the difference between amounts of cell-bound PIA in the absence or presence of non-labeled 2-chloradenosine.
Intracellular cAMP was determined by radioligand technique using standard Amersham kits.
Determination of 3H-thymidine uptake in bone marrow lymphoblast DNA. DNA biosynthesis intensity in the lymphoblasts was assessed by 3H-thymidine uptake in cell DNA by routine methodology.
Evaluation of 5’-nucIcotidase (5’-iN) activity in bone marrow lymphoblasts. 5’-N activity was evaluated by generation of inorganic phosphate (Pj) as a result of 5’-AMP hydrolysis [5].
Statistical management of data was performed with a PC/486 using an application package “Pharmacological Basic Statistics”. Calculation
инкубации аликвоты проб (100 мкл) быстро переносили на фильтры GF/C ‘'Whatman'' н дважды отмывали 2 мл HEPES-буфера (/= 4ПС). Фильтры высушивали при комнатной температуре и помещали во флаконы с сцинтплляцпоппой жидкостью для определения содержания меченого NECA методом жидкостной радиометрии.
Связывание 3Н-феппл11зопроппладепозипа (3Н-ФИА) с А|-рецеп-торами лимфоидных клеток проводили так же, как и 3H-NECA с А2-рецепторами, по специфическим лигандом служил 3Н-ФИА (конечная концентрация 0,1—5 пМ). Неспецифическое связывание 3Н-ФИА определяли как связывание в присутствии 2-хлораденозина (конечная концентрация 3 10-s М). Пробы инкубировали в течение 30 мин при температуре 37 °С. Специфическое связывание 3Н-ФИА вычисляли как разницу между количеством связанного клетками ФИА в отсутствие и в присутствии немеченого 2-хлораденозина.
Внутриклеточное содержание цАМФ определяли радиолигандным методом с помощью стандартных наборов фирмы “Amersham".
Определение включения !Н-тимцдина в ДНК лимфобластов костного мозга. Интенсивность биосинтеза ДНК в лимфобластах оценивали по включению 3Н-тимидина в ДНК клеток по общепринятой методике.
Определение активности фермента 5'-нуклеотидазы (5'=Н) в лимфобластах костного мозга. Активность 5'-Н оценивали по образованию неорганического фосфата (Фн) в результате гидролиза 5'-АМФ [5].
Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью пакета прикладных программ “Pharmacological Basic Statistics” на Pci 486. Расчет доверительных интервалов экспериментальных значений и оценку достоверности различий между ними проводили с использованием непараметрического парного критерия Вилкоксо-на —Манна — Уитни (при обработке данных опытов in vivo) и г-критерия Стыодента (в опытах in vitro) при уровне значимости р - 0,05 и р = 0,01.
Результаты. Специфического связывания меченого ФИА с лимфобластами не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии А,-типа мест связывания в этих клетках. Анализ специфического связывания 3H-NECA лимфобластами в координатах Скэтчарда представлен на рис. 1. Непрямолинейная форма графика позволила предположить существование двух типов мест связывания лиганда, что подтвердилось в дальнейших исследованиях с применением селективных лигандов А2-рецепторов 5'-К-метилкарбоксамидоаденозина и
2-фениламиноаденозина. Установлено, что лимфобласты содержат два типа мест связывания NECA: высокоаффинные, соответствующие по своим параметрам А2А-подтипу аденозиновых рецепторов, и низкоаффинные, часто обозначаемые в литературе как А2В-рецеп-торы аденозина [12].
С помощью конкурентного анализа изучено относительное сродство различных лигандов к двум подтипам А2-рецепторов лимфобластов. Были использованы аденозин, NECA, два структурных аналога аденина АЗТ и цитостатик 6-МП. Для А2А-подтипа мест связывания относительное сродство убывает в ряду: аденозин, NECA, АЗТ, 6-МП. Для А,в-подтипа мест связывания получен следующий ряд: NECA, аденозин, 6-МП, АЗТ.
Для оценки активации системы вторичных мессенджеров в ответ на связывание лигандов с рецепторами аденозина нами было исследовано изменение содержания цАМФ под действием пуриновых лигандов. Влияние 6-МП на уровень цАМФ максимально при концентрации 10‘5 М, соответствующей терапевтической дозе препарата. Повышение содержания цАМФ, индуцированное АЗТ, было достоверно ниже. Полученные данные свидетельствуют о том, что на лимфобластах
Рис. 1. Специфическое связывание 3H-NECA лимфобластами костного мозга в координатах Скэтчарда.
По оси абсцисс — концентрация связанного лиганда, пмоль/106 клеток; по оси ординат — отношение количества связанного 3H-NECA и концентрации свободного 3H-NECA, пмоль/мкМ • 106 клеток.
1 — высокоаффинные места связывания; 2 — низкоаффинные места связывания.
Fig. 1. Scatcher plot of specific 3H-NECA binding to bone marrow lymphoblasts.
Numbers on the x axis demonstrate concentration of bound ligand, pmol per 106 cells; numbers on the у axis show ratio of bound to free 3H-NECA, pmol/mcMx106 cells.
1, high-affinity binding sites; 2, low-affinity binding sites.
of confidence intervals and analysis of differences were carried out using the Wilcoxon-Mann-Whitney test for non-parametric pairs (for in vivo findings) and Student’s t-test (for in vitro findings) at p =
0.05 and p = 0.01.
Results. No specific binding of labeled PIA with lymphoblasts was discovered which is evidence of the absence of A, binding sites on these cells. Fig.l is a Statchard plot of specific binding of 3H-NECA with lymphoblasts. The non-linearity of the curve suggests that there were two types of ligand binding sites which was confirmed by further study using selective A2-receptor ligands 5’--N-methylcarboxamide adenosine and 2-phenylamine adenosine. Lymphoblasts were found to have two types of NECA binding sites, i. e. high affinity sites corresponding to AM adenosine receptor subtype, and low affinity ones often referred to as A2B adenosine receptors [12].
We studied relative affinity of various ligands to lymphoblast A2-receptor subtypes by concurrent analysis using adenosine, NECA and two structural adenosine analogs AZT and a cytostatic 6-MP. For the A2a binding site subtype the relative affinity was descending in the following order : adenosine, NECA, AZT, 6-MP. For the A2B subtype the order was NECA, adenosine, 6-MP, AZT.
To evaluate activation of the second manager system in response to ligand binding to adenosine receptors we studied changes in cAMP content under the effect of purine ligands. The 6-MP effect on cAMP was maximal at a concentration 10~5 M, i.e. therapeutic dose. The AZT-induced elevation of cAMP was significantly less. These findings suggest that there are two A2 receptor
Таблица
Параметры специфического связывания 3H-NECA лимфобластами костного мозга до и после воздействия глюкокортикоидных препаратов (M±mt)
Parameters of 3H-NECA specific binding to bone marrow lymphoblasts before and after glucocorticoid therapy (M+SD)
Table
Высокоаффинные участки связывания Низкоаффинные участки связывания
Кд, мкМ Вmax, ПМОЛЬ/106 КЛвТОК Кд, мкМ Bmax, пмоль/106 клеток
Контроль / Control 0,53 + 0,15 0,25 ±0,05 6,5+ 1,8 1,5 ±0,3
Лимфобласты после инкубации с преднизолоном in vitro (1 мкМ, 8 ч) Lymphoblasts after incubation with prednisolone (1 mcM, 8 h) 0,47 ±0,17 0,32 ±0,015* p < 0,05 5,8 ±0,9 2,85 ±0,13* p < 0,01
Лимфобласты после курса гормональной терапии (преднизолон) Lymphoblasts after a hormone therapy cycle (prednisolone) 0,57 ±0,13 0,28 ± 0,04 p > 0,05 6,4 ± 1,4 2,2 ±0,21* p < 0,05
Experimental conditions Cd, mcM Bmax, pmol/106 cells Cd, mcM Bmax, pmol/106 cells
High-affinity binding sites Low-affinity binding sites Cd, mcM
'Статистические различия по отношению к контролю/statistical differences with the control..
присутствуют два подтипа А2-рецепторов аденозина, активация которых вызывает увеличение уровня цАМФ.
Исследование мембранного этапа взаимодействия глюкокортикоидной и пуриновой систем включало изучение влияния ГК на активность одного из мембранных ферментов метаболизма пуринов 5’-Н. Кортизол и пред-низолон достоверно повышали активность 5’-Н в лимфобластах. Максимум активирующего влияния наблюдался через 4 ч и составил 2,1 и 2,5 раза соответственно.
В дальнейших экспериментах оценивали влияние лигандов пуриновых рецепторов на включение 3Н-тими-дина в ДНК лимфобластов. Показано, что аденозин и 6-МП угнетают включение 3Н-тимидина в лимфобласты. Кортизол и преднизолон также снижают включение тимидина. При изучении совместного влияния ГК и аденозина или 6-МП обнаружено, что ГК потенцируют эффект аденозина и 6-МП.
Для определения молекулярного механизма взаимодействия глюкокортикоидной и пуринергической систем исследовали число аденозиновых рецепторов и их сродство к лиганду после инкубации лимфобластов с ГК in vitro (см. таблицу). Под действием кортизола и преднизолона увеличивается количество как А2А-, так и А2В-подтипа мест связывания. Константы диссоциации достоверно не изменяются.
В другой серии экспериментов оценивали параметры связывания меченого NECA на лимфобластах после курса гормональной терапии. Количественные и качественные изменения аденозиновых рецепторов после терапии преднизолоном примерно соответствуют тем, которые наблюдали после инкубации in vitro. Интересно, что соотношение А2Д- и А2В-подтипов рецепторов после воздействия ГК достоверно не изменяется. Можно предположить, что этот параметр является физиологической константой, отражающей состояние гомеостаза лимфобластов.
В задачу второй части работы входило изучение влияния ГК на пуринергическую систему лимфоцитов.
types on lymphoblasts whose activation leads to increase in cAMP.
The study of membrane stage of glucocorticoid and purine system interaction included evaluation of GC effect on activity of a membrane enzyme of purine metabolism, 5’-N. Cortisol and prednisolone increased activity of 5’-H in lymphoblasts in a statistically significant manner. Maximum activating effect (2.1- and 2.5-fold, respectively) was observed at 4 hours.
Further experiments were carried out to assess purine receptor ligands on 3H-thymidine uptake in lymphoblast DNA. Adenosine and 6-MP were discovered to inhibit 3H-thymidine uptake by lymphoblasts. Cortisol and prednisolone also decreased the thymidine uptake. Analysis of the GC and adenosine or 6-MP joint effect demonstrated GC to potentiate the effect of adenosine and 6-MP.
To determine molecular mechanism of glucocorticoid and purinergic systems we studied the number of adenosine receptors and their affinity to the ligand after lymphoblast incubation with GC in vitro (see the table). Cortisol and prednisolone increased the number of binding sites of both A2A and A2B subtypes, constants of dissociation failing to demonstrate statistically significant changes.
In another experimental series we evaluated parameters of labeled NECA binding on lymphoblasts after a hormonal therapy cycle. Quantitative and qualitative changes in adenosine receptors after prednisolone therapy were similar to those after in vitro incubation. There was no statistically significant change in ratio of A2A-and A2B-receptor subtypes under the effect of GC. This parameter may be considered a physiological constant reflecting lymphoblast homeostasis.
The purpose of the second part of this study was to evaluate GC effect on lymphocyte purinergic system. The following parametric values were obtained for 3H-PIA binding to peripheral lymphocytes: dissociation constant 41.1+6.9 nM, receptor capacity 67.3 + 7.0 fmol per 10r’ cells. Unlike lymphoblasts, lymphocytes did not
Параметры связывания 'Н-ФИА лимфоцитами периферической крови составили: константа диссоциации 41,1 ±6,9 нМ, рецепторная емкость 67,3 ± 7,0 фмоль на Ю6 клеток. В отличие от лимфобластов на лимфоцитах обнаружены участки связывания А,-типа. С использованием меченого NECA выявлен один тип мест связывания на лимфоцитах, соответствующий по своим параметрам А2А-подтипу аденозиновых рецепторов. С помощью конкурентного анализа определено относительное сродство аденозина, 6-МП и АЗТ к участкам связывания NECA на лимфоцитах. В терапевтических концентрациях азатиоприн, но не 6-МП, способен взаимодействовать с А2А-подтипом пуриновых рецепторов.
цАМФ-ответ лимфоцитов на аденозин сходен с реакцией лимфобластов: добавление аденозина вызывает быстрое повышение концентрации цАМФ в клетках. Кортизол достоверно потенцирует аденозинстимулиро-ванный подъем уровня цАМФ в лимфоцитах. Потенцирующий эффект кортизола имеет обратимый характер. После отмывки клеток и помещения их в среду, не содержащую ГК, эффект кортизола не сохраняется независимо от времени преинкубации с гормоном.
Для выяснения молекулярного механизма повышения под действием кортизола аденозинстимулированного уровня цАМФ был проведен анализ совместного действия кортизола и коклюшного токсина (КТ). КТ используется в экспериментальной практике для инактивации Огрегуляторного белка. Действие КТ характеризуется латентным периодом и необратимо. В то же время КТ самостоятельно повышает базальный уровень цАМФ в лимфоцитах в 3,5 раза.
При изучении сочетанного действия кортизола и КТ на уровень цАМФ установлено, что при совместном действии КТ и кортизола содержание цАМФ в лимфоцитах было достоверно ниже, чем при действии только КТ. Следовательно, кортизол препятствует влиянию КТ на ингибирующий регуляторный белок аденилат-циклазной системы лимфоцитов. Можно предположить, что ГК и КТ имеют одну мишень действия — Gj-белок.
На основании результатов собственных исследований и данных литературы нами предлагается следующая схема влияния ГК на пуринергическую систему лимфоидных клеток.
Лимфобласты костного мозга: на мембране клеток отсутствуют ингибирующие АЦ А,-рецепторы аденозина (рис. 2, а). А,-рецепторы представлены двумя подтипами: высокоаффинные А2А-рецепторы и низкоаффинные А2В-рецепторы, обладающие избирательным сродством к цитостатику 6-МП. Стимуляция обеих субпопуляций рецепторов приводит к повышению внутриклеточного уровня цАМФ и опосредует иммуносу-прессирующее действие агонистов А2-рецепторов на лимфобласты. Регуляторное влияние глюкокортикоид-ных гормонов на аденозиновые рецепторы лимфобластов по механизму реализации относится к типичным геномным эффектам стероидов. С помощью внутриклеточной системы рецепции ГК индуцируют синтез de novo белковых молекул А2-рецепторов аденозина; ингибитор транскрипции актиномицин D отменяет этот эффект. Наблюдается увеличение концентрации как вы-
have A, binding sites. Only one type of binding sites was found on lymphocytes labeled using NECA which corresponded to the A2A subtype of adenosine receptors. By competitive analysis we determined relative affinity of adenosine, 6-MP and AZT to NECA binding sites on lymphocytes. Azathioprine at therapeutic concentrations rather than 6-MP was able to interact with purine receptors of the A2A subtype.
Lymphocyte cAMP response to adenosine was similar to the lymphoblast reaction: adenosine induced elevation of cell cAMP. Cortisol potentiated the adenosine-enhanced elevation of cAMP in lymphocytes in a statistically significant manner. The cortisol potentiation effect was reversible. The effect was not observed after the cells were washed and transferred to a GC-free medium irrespective of time of preincubation with the hormone.
To study molecular mechanism of the adenosine-enhanced elevation of cAMP we analyzed joint effect of cortisol and pertussis toxin (PT). The PT is used in experimental study to inactivate G, regulatory protein. The PT produces a latent and irreversible effect. The PT also induces a 3.5-fold increase in lymphocyte cAMP basal level.
Lymphocyte cAMP content showed a more pronounced decrease under the joint effect of GC and PT as compared to the effect of PT alone. Therefore cortisol interfered with PT action on inhibitory effect of regulatory protein of lymphocyte adenylate cyclase system. The supposition may be made that GC and PT have a common target, i. e. G, protein.
Basing on our experimental findings and the published data we propose the following mechanism of GC effect on lymphoid purinergic system.
Bone marrow lymphoblasts. There were no AC inhibitors A, on cell membranes (fig. 2, a). A2 are present as two subtypes: high-affinity AM and low-affinity A2B with selective preference of 6-MP. Stimulation of both receptor subpopulations leads to increase in intracellular cAMP and mediates A2 agonists’ immunosuppressive effects on lymphoblasts. Mechanism of the regulation of lymphoblast adenosine receptors by GC belongs to typical steroid genome effects. By means of the intracellular reception system GC induce de novo synthesis of A2 protein molecules while actinomycin D, a transcription inhibitor, eliminates this effect. There is an increase in cell membrane concentration of both high-affinity and low-affinity adenosine receptors. The supposition may be made that reciprocal potentiation of action of these two drugs occurs as a result of associated polychemotherapy with 6-MP and prednisolone. Since lymphoblasts are immature cells with rapid autogenesis, GC genome effects manifest themselves rather soon which accounts for their cytolytic action. At the same time GC also produce a mediated effect on lymphoblast purin-ergic receptor system. GC increase activity of a key purine metabolism enzyme, 5’-N, which inhibits AMP transformation into adenosine which results in elevation of adenosine premembrane local concentration.
О О
ООО О О
О Q Аденозин / AdenosineaQ Q
О О ^ АМФ/АМРлф?
ГК/GC
Q О Q 6-МП/6-МР
I
MPHK/mRNA
Рис. 2. Пути влияния ГК на пуринергическую систему лимфобластов (а) и лимфоцитов (Ь).
Fig. 2. Pathways of GC regulatory effects on lymphoblast (a) and lymphocyte (b) purinergic systems.
соко-, так и низкоаффинных рецепторов аденозина на мембране клеток. Можно предположить, что при одновременном применении 6-МП и преднизолона в составе курса полихимиотерапии происходит взаимное потенцирование действия этих препаратов. Так как лимфобласты — незрелые быстроделящиеся клетки, геномные эффекты ГК проявляются достаточно быстро, что обеспечивает их цитолитический эффект. В то же время отмечается и опосредованное влияние глюкокортико-идных гормонов на пуринергическую рецепторную систему лимфобластов. На уровне плазматической мембраны клеток ГК повышают активность одного из ключевых ферментов пуринового обмена 5'-Н, катализирующего превращение АМФ в аденозин. Следствием этого является увеличение примембранной локальной концентрации аденозина.
Лимфоциты: влияние ГК на пуринергическую систему лимфоцитов имеет характерные особенности (рис. 2, Ь). В отличие от лимфобластов костного мозга на мембране лимфоцитов представлены два типа аденозиновых рецепторов: А, и А2А. Сопряжение А,- и А2Л-рецепторов аденозина с эффекторной молекулой — АЦ — осуществляется через различные типы регуляторных О-белков. Ингибирующее действие А,-рецепторов на АЦ опосредуется С;-белком, чувствительным к КТ. Стимуляция АЦ через А2А-рецепторы обусловлена С5-белком. Базальный уровень цАМФ в лимфоцитах определяется соотношением функциональной активности А,/А2-ре-цепторов. Геномный эффект ГК-гормонов в лимфоцитах выражается инициацией транскрипции генов, ко-
Lymphocytes. GC effect on lymphocyte purinergic system has certain peculiarities (fig. 2, b). Unlike bone marrow lymphoblasts the lymphocyte membrane bears two types of adenosine receptors, i. e. A, and A2. Conjugation of the A, and A2 with the effector molecule AC is mediated by a variety of regulatory proteins G,. Inhibition of AC by A, is mediated by G„ a PT sensitive protein. Stimulation of AC via A2 is mediated by a protein Gs. Lymphocyte basal cAMP level depends on ratio of functional activities of A, and A2. GC genome effect in lymphocytes is manifested by transcription initiation of genes coding A2. We found that changes in A, content on lymphocyte membrane under the effect of GC was not statistically significant. The ability to block A, conjugation with AC via G; is a characteristic membranotropic action of GC. This effect lasts about 30 min and is not due to effects on the genome. Trans-membrane signal passage via A, is blocked. Functional ratio A,/A2 shifts towards A2. As a result GC potentiate the adenosine-mediated elevation of cAMP and the inhibition of lymphocytes by adenosine.
Conclusion. This paper is the first to outline potential points of “intersection” of purinergic and glucocorticoid system functioning in lymphoid cells.
1. GC is shown to shift the lymphoid cell surface ratio A,/A, towards A2 by regulation of the transcription at the genome level both in vitro and in vivo.
2. Lymphoblast GC increase 5’N activity.
Cortisol can block transmembrane signal passing
via A, in lymphocytes. It was discovered for the first
дирующих рецепторы аденозина А,-типа. По нашим данным, ГК достоверно не изменяют содержание А,-рецепторов на мембране лимфоцитов. Особенностью мембранотропного действия ГК на лимфоциты является их способность блокировать сопряжение А,-рецепторов с АЦ на уровне Gi-регуляторных белков. Подобный эффект развивается быстро, в течение 30 мин, и не обусловлен влиянием на геном. Наблюдается блокада передачи трансмембранного сигнала, идущего через А,-рецепторы. Функциональное соотношение А,/А2-рецеп-торов при этом смещается в пользу А2-типа. В результате ГК потенцируют аденозинопосредованное повышение уровня цАМФ и ингибирующее действие аденозина на лимфоциты.
Заключение. В данной работе впервые обозначены возможные точки “пересечения” в функционировании глюкокортикоидной и пуринергической рецепторных систем в лимфоидных клетках:
1. Показана способность ГК изменять соотношение А,/А2-рецепторов аденозина на поверхности лимфоидных клеток в пользу А2-типа путем регуляции транскрипции на уровне генома как in vitro, так и in vivo.
2. Обнаружено, что в лимфобластах глюкокортико-идные гормоны повышают активность фермента 5’-Н.
В лимфоцитах показана возможность блокады под действием кортизола передачи трансмембранного сигнала через А,-аденозиновые рецепторы. Впервые с помощью КТ выявлена молекулярная мишень действия ГК на уровне мембраны — Gi-регуляторный белок, опосредующий ингибирующие влияния на АЦ.
Активация пуринергической системы и запуск аде-нозин-индуцированного пути подавления лимфоидного роста является одним из механизмов иммунодепрес-сивного действия ГК.
Показано наличие двух подтипов А2-аденозиновых рецепторов на лимфобластах костного мозга (низкоаффинные и высокоаффинные, А2В и А2А соответственно). А2В-подтип рецепторов характеризуется повышенной тропностью к цитостатику 6-МП. Взаимодействие 6-МП с данным подтипом аденозиновых рецепторов, приводящее к повышению внутриклеточного уровня цАМФ, является примером одного из механизмов им-мунодепрессивного влияния этого цитостатика.
Установлено, что глюкокортикоидные гормоны способны увеличивать количество А2-рецепторов в лимфобластах на уровне генома клеток. Описанное взаимодействие глюкокортикоидной и пуринергической рецепторных систем может быть использовано при составлении более эффективных схем полихимиотерапии, применяемых для лечения острого лимфобластного лейкоза.
time in experiments with PT that the regulator protein G, (AC inhibition mediator) was a molecular target of GC on cell membrane.
Activation of the purinergic system and actuation of the adenosine-induced inhibition of lymphoid growth is one of the mechanisms of GC immunodepressive effect.
There are two subtypes of A2 adenosine receptors on bone marrow lymphoblasts (with low and high affinity, i.e. A2B and A2A, respectively). The A2B demonstrates marked preference to 6-MP. The 6-MP interaction with the A2B leading to cAMP elevation is an example of the cytostatic immunodepressive activity.
GC are shown to increase the number of A2 in lymphoblasts at the cell genome level. The above described interaction of the glucocorticoid and purinergic receptor systems may be utilized to develop more efficient schedules of polychemotherapy for acute lymphoblastic leukemia.
ЛИТЕРА ТУРА/REFERENCES
1. Дмитриенко И. Jl. Пуриновый обмен и его регуляция в лимфоцитах. — Киев, 1991.
2. Корнева Е. А. Иммунофизиология. — Санкт-Петербург, 1993.
3. Сергеев П. В. Стероидные гормоны. — М., 1984.
4. Сергеев П. В., Ляппия Л. П., Духанин А. С., Чернов В. М. //Всесоюз. симпозиум «Биохимия опухолевой клетки»: Тезисы докладов. — Минск, 1990. — С. 89—90.
5. Суханова Г. А., Потапова Г. В., Нарбутович С. А. //Вопр. мед. химии.— 1993.—Т. 39, № 2. — С. 13—15.
6. Brann D. W., Hendry L. В., Mahesh V. В. //J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. — 1995.— Vol. 52, N 2. — P. 113—133.
7. Caldenhoven E., Liden J., Wissink S. et al. //Mol. Endocronol. — 1995.— Vol. 9, N 4.— P. 401—412.
8. Chalbos D., Philips A., Rochefort H. //Semin. Cancer. Biol. — 1994, — Vol. 5, N 5.— P. 361—368.
9. Daynes R. A., Araneo B. A., Hennehold J. et al. IIS. invest. Dermatol.— 1995. — Vol. 105, N 1, Suppl. — P. 14S—19S.
10. Kraus W. L., Weis К. E. Katzenellenhogen B. S. //Molec. cell. Biol. —1995, —Vol. 15, N 4. — P. 1847—1857.
11. Shimcgi S., Okajima Kondo Y. //Biochem. J. — 1994. — Vol. 299.— P. 845—851.
12. Stiles G.L., Olah М. E. //Annu. Rev. Physiol. — 1992. — Vol. 54.— P. 211—227.
13. Szondy Z. //Biochem. J. — 1994. — Vol. 304. — P. 877—885.
Поступила 29.05.97 / Submitted 29.05.97
