CC BY
5Научная статья
https://doi.org/10.36233/0372-9311-255
Сравнительный анализ структуры и экспрессии регуляторного гена vasH системы секреции 6-го типа токсигенных и нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae
Заднова С.ПЛ Плеханов Н.А., Спирина А.Ю., Крицкий А.А.
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов, Россия
Аннотация
Цель работы — сравнительный анализ структуры регуляторного гена vasH системы секреции 6-го типа и его экспрессии в токсигенных и нетоксигенных штаммах Vibrib cholerae О1 серогруппы El Tor биовара. Материалы и методы. В работе использовали 35 штаммов, выделенных от больных и из внешней среды с 1970 по 2017 г. на территории России и Украины. Анализ структуры гена vasH и аминокислотной последовательности белка проводили с применением программ UGENE 1.32, MEGA X, BioEdit v. 7.0.9.0. Относительный уровень экспрессии vasH изучали методом 2-ЛЛС'.
Результаты. Установлено, что у токсигенных типичных штаммов и геновариантов V. cholerae О1 El Tor биовара (генотип ctxA+tcpA+) структура гена vasH и аминокислотная последовательность белка VasH идентична референс-штамму V. cholerae N16961 О1 El Tor биовара. У изолятов, не имеющих гены ctxA и tcpA (ctxA-tcpA-), последовательность vasH является вариабельной, у ctxA-tcpA+ (за исключением одного штамма) — не отличается от референсного. Изученные токсигенные типичные штаммы и геноварианты имеют схожий относительный уровень экспрессии гена vasH. У изолятов, не содержащих гены ctxA и tcpA, экспрессия данного гена сопоставима с токсигенными, а у ctxA-tcpA+ штаммов в среднем в 3,1 раза выше, чем у ctxA-tcpA-, и в 2,14-2,60 раза больше, чем у токсигенных.
Заключение. На модели токсигенных и нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor биовара, изолированных в разные периоды текущей пандемии холеры на территории России и Украины, подтверждены данные зарубежных исследователей о наличии интактного гена vasH у токсигенных и вариабельного у изолятов, не имеющих гены ctxA и tcpA. В то же время показано, что у 99% изученных ctxA-tcpA+ штаммов структура vasH идентична токсигенным. Экспрессия гена vasH обнаружена у всех изученных штаммов, при этом наибольшей она была у ctxA-tcpA+. Выявлено всего два нетоксигенных штамма, предположительно синтезирующих функционально неактивный белок VasH.
Ключевые слова: Vibrio cholerae, система секреции 6-го типа, структура и экспрессия регуляторного гена vasH Этическое утверждение. Исследование проводилось при добровольном информированном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» (протокол № 16 от 21.02.2022).
Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Для цитирования: Заднова С.П., Плеханов Н.А., Спирина А.Ю., Крицкий А.А. Сравнительный анализ структуры и экспрессии регуляторного гена vasH системы секреции 6-го типа токсигенных и нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2022;99(6):682-691. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-255
Original article
https://doi.org/10.36233/0372-9311-255
Comparative analysis of the structure and expression of the vasH regulatory gene of type VI secretion system in toxigenic and non-toxigenic Vibrio cholerae strains
Svetlana P. Zadnova®, Nikita A. Plekhanov, Alina Yu. Spirina, Andrey A. Kritskiy
Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe'; Saratov, Russia
© Коллектив авторов, 2022
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Abstract
Objective. The comparative analysis of the structure of the regulatory gene vasH of the type VI secretion system and its expression in toxigenic and non-toxigenic V. cholerae O1, biovar El Tor strains.
Materials and methods. We used 35 strains isolated from patients and from the environmental samples in the territory of Russia and Ukraine between 1970 and 2017. Analysis of the structure of the vasH gene and the amino acid sequence of the protein was carried out using Ugene 1.32, Mega X, and Bioedit v. 7.0.9.0. The relative level of vasH expression was studied by 2-ллс'.
Results. The The structure of the vasH gene and the amino acid sequence of VasH protein in toxigenic typical strains and genovariants of V. cholerae O1, El Tor biovar (genotype ctxA+tcpA+) have been shown to be identical to the reference V. cholerae n16961 O1, El Tor biovar strain. The vasH sequence is variable in isolates lacking ctxA and tcpA genes (ctxA-tcpA-), and does not differ from the reference in ctxA-tcpA+ (with the exception of one strain). The studied toxigenic typical strains and the genovariants have a similar relative level of expression of the vasH gene. In isolates that do not contain the ctxA and tcpA genes, the expression of this gene is comparable to toxigenic strains, and is 3.1 times higher in ctxA-tcpA+ strains than that of ctxA-tcpA- and 2.14-2.6 times higher than that of toxigenic ones.
Conclusion. The analysis of toxigenic and non-toxigenic V. cholerae O1, biovar El Tor strains isolated in Russia and Ukraine in different periods of the current cholera pandemic confirmed the data of foreign researchers on vasH gene being intact in toxigenic isolates and variable in isolates lacking ctxA and tcpA genes. Meanwhile, the structure of vasH gene has been shown to be identical to that of toxigenic ones in 99% of the studied ctxA-tcpA+ strains. The expression of the vasH gene has been detected in all studied strains, being the highest in ctxA-Ttc-pA+ strains. Only two non-toxigenic strains presumably synthesizing the functionally inactive VasH protein have been identified.
Keywords: Vibrio cholerae, type VI secretion system, structure and expression of vasH regulatory gene
Ethics approval. The study was conducted with the informed consent of the patients. The research protocol was approved by the Ethics Committee of the Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe" (protocol No. 16, February 21, 2022).
Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.
Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.
For citation: Zadnova S.P., Plekhanov N.A., Spirina A.Yu., Kritskiy A.A. Comparative analysis of the structure and expression of the vasH regulatory gene of type VI secretion system in toxigenic and non-toxigenic Vibrio cholerae strains. Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology = Zhurnal mikrobiologii, épidemiologii i immunobiologii. 2022;99(6):682-691.
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-255
Введение
Возбудителями холеры — особо опасной инфекционной болезни с диарейным синдромом — являются токсигенные штаммы Vibrio cholerae, содержащие гены ctxAB и tcpA-F, кодирующие основные факторы патогенности: соответственно, холерный токсин, вызывающий развитие профузной диареи, и токсин-корегулируемые пили адгезии, необходимые для первого этапа инфекционного процесса — прикрепления вибрионов к эпителиоци-там кишечника [1]. С 1961 г. продолжается седьмая пандемия холеры, вызванная типичными токсиген-ными штаммами V. cholerae О1 серогруппы El Tor биовара. Постоянно происходящие эволюционные преобразования El Tor вибрионов привели к появлению в 1990-х гг. генетически изменённых штаммов (геновариантов) V. cholerae О1 El Tor биовара с повышенной вирулентностью [2]. Геноварианты быстро вытеснили на эндемичной территории типичные штаммы и явились причиной ряда крупных вспышек холеры в разных странах [3-5]. Типичные штаммы V. cholerae О1 El Tor биовара неоднократно завозились и на территорию России, а с 1993 г. все единичные случаи и вспышки холеры были вызваны геновариантами [6, 7].
Механизмы быстрого распространения геновариантов и замещения типичных штаммов до конца не установлены. В ряде работ показано, что гено-варианты не только являются гипервирулентными, но и способны быстро адаптироваться при смене среды обитания [8-10]. Как известно, важная роль в повышении вирулентных и адаптационных свойств холерного вибриона принадлежит недавно обнаруженной системе секреции 6-го типа (T6SS, от англ. Type 6 secretion system) [11]. T6SS представляет собой контактзависимую макромолекулярную структуру, напоминающую шприц, с помощью которой грамотрицательные бактерии, включая V. cholerae, транслоцируют внутрь соседних клеток-мишеней токсичные белки-эффекторы. Холерный вибрион использует T6SS для уничтожения прокариотических и эукариотических клеток: бактерий разных видов, макрофагов, фагоцитирующих амёб, инфузорий, нематод. Активная экспрессия белков-эффекторов повышает выживаемость V. cholerae как in vivo, так и in vitro и даёт ему возможность эффективно конкурировать с бактериями, составляющими микробиом кишечника человека, а также с постоянными обитателями открытых водоёмов при его нахождении в составе биоплёнки во внешней среде [12, 13].
ORIGINAL RESEARCHES
Первые сведения о T6SS V. cholerae получены при изучении штамма V52 O37 серогруппы, у которого данная система активна в лабораторных условиях [11]. В дальнейшем была исследована структура и функция генов T6SS у некоторых типичных токсигенных штаммов (N16961, C6706, A1552) V. cholerae 01 El Tor биовара, холерных вибрионов 0139 серогруппы, ряда нетоксигенных штаммов V. cholerae 01 El Tor биовара и вибрионов non01/ non0139 серогруппы. В то же время функционирование T6SS у геновариантов V. cholerae 01 El Tor биовара изучено на единичных модельных штаммах [13-21].
Согласно данным литературы, гены, кодирующие белки T6SS V. cholerae, входят в состав одного большого и нескольких дополнительных (Aux-1, Aux-2, Aux-3, Aux-4, Aux-5) кластеров, расположенных на первой и второй хромосомах V. cholerae [11, 15, 19, 21]. При этом токсигенные штаммы V. cholerae 01 и 0139 серогрупп содержат одинаковый набор — большой кластер и три дополнительных (Aux-1, Aux-2, Aux-3). У неток-сигенных штаммов V. cholerae 01 El Tor биовара и штаммов non01/non0139 серогруппы состав и структура генов T6SS являются вариабельными [19, 22].
На большом кластере находятся гены, кодирующие структурные компоненты T6SS системы, а также ген vasH (VCA0117), ответственный за биосинтез регуляторного белка VasH, который непосредственно контролирует транскрипцию генов, кодирующих эффекторные белки, расположенные на дополнительных кластерах [11, 23]. В штаммах V. cholerae, лишённых гена vasH, T6SS является неактивной [23, 24]. Учитывая важную роль белка VasH в функционировании T6SS, цель нашей работы состояла в проведении сравнительного анализа структуры регуляторного гена vasH системы секреции 6-го типа и его экспрессии в токсигенных и нетоксигенных штаммах V. cholerae 01 серогруппы El Tor биовара.
Материалы и методы
Штаммы бактерий
В работе использовали 35 штаммов V. cholerae 01 серогруппы El Tor биовара: токсигенные типичные и геноварианты, содержащие гены ctxA и tcpA (генотип ctxA+tcpA+); нетоксигенные, не имеющие ген ctxA, но включающие ген tcpA (ctxA-tcpA+), и нетоксигенные, лишённые гена tcpA (ctxA-tcpA-). Штаммы выделены от больных и из внешней среды с 1970 по 2017 г. на территории России и Украины. Исследование проводилось при добровольном информированном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом Российского научно-исследовательского противочумного
института «Микроб» (протокол № 16 от 21.02.2022). Штаммы хранились в лиофильно высушенном состоянии в «Государственной коллекции патогенных бактерий» (РосНИПЧИ «Микроб», Саратов). Для работы бактерии выращивали на пластинах LB агара при 37оС в течение 18-24 ч.
Анализ структуры гена vasH и аминокислотной последовательности белка VasH
Изучение структуры регуляторного гена vasH проводили путём сравнения нуклеотидных последовательностей полных геномов исследуемых штаммов, представленных в NCBI GenBank, с последовательностью референс-штамма V. cholerae N16961 О1 серогруппы El Tor биовара с использованием программ «UGENE v. 1.32» и «MEGA X» («Megasoftware»). Аминокислотную последовательность белка VasH устанавливали с применением freeware-программы «BioEdit v. 7.0.9.0» («BioEdit»).
Изучение экспрессии гена vasH
Для изучения экспрессии гена vasH штаммы выращивали 4 ч с аэрацией в LB-бульоне при 37оС. Относительный уровень экспрессии гена vasH определяли методом 2-AACt с использованием полимераз-ной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени [25]. Для выделения тотальной РНК применяли набор «SV Promega Total RNA Isolation System» («Promega»), для синтеза кДНК на матрице РНК — набор реагентов «Реверта-L» («АмплиСенс»). Для ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени c интеркалирующим красителем использовали комплект реагентов «Thermo Scientific Luminaris Color HiGreen qPCR Master Mix» («Thermo Fisher Scientific») согласно инструкции производителя. Нормализацию полученных данных осуществляли относительно гена домашнего хозяйства recA (VC0543). Последовательности олигонуклеотид-ных праймеров к гену recA рассчитаны ранее [26], к гену vasH взяты из литературных источников [23]. В качестве штамма-калибратора, значение экспрессии целевого гена vasH которого было принято за единицу, был произвольно выбран штамм V. cholerae M818. Эксперимент проводили в 3 повторах.
Статистический анализ
Статистический анализ полученных экспериментальных данных осуществляли при помощи программ «Microsoft Excel» (стандартный пакет программ «Microsoft Office 2010») и «Statistica 6.0» («Statsoft») путём вычисления среднего арифметического, стандартной ошибки среднего арифметического и доверительного интервала. Достоверность различия между средними величинами оценивали при помощи критерия Стьюдента, различия считали статистически значимыми приp < 0,05.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Результаты
Изучение структуры гена vasH
На первом этапе работы было проведено сравнительное исследование нуклеотидной последовательности гена vasH у токсигенных штаммов V. cholerae 01 El Tor биовара. Произвольно были выбраны 5 типичных штаммов (М1062, М888, М893, 818, М1011) и 13 геновариантов (М1270, М1275, М1293, Р17644, М1327, М1344, М1429, RND18826, Р-18899, L3226, 89, М1509, 3265/80), выделенных, соответственно, в 1970-1972 и 1993-2014 гг. В результате анализа установлено, что у всех взятых в исследование токсигенных штаммов структура гена vasH идентична референс-штамму V. cholerae N16961 01 El Tor биовара (таблица).
Далее были изучены нетоксигенные штаммы V. cholerae, изолированные с 1981 по 2017 г. от больных, а также из открытых водоёмов при проведении мониторинговых исследований на холеру. Неток-сигенные штаммы включали две группы: изоляты первой содержали ген tcpA, кодирующий токсин-ко-регулируемые пили адгезии (ctxA-tcpA+), у второй данный ген отсутствовал (ctxA-tcpA-). Наличие и структура мобильных элементов с генами патоген-ности и эпидемичности в данных штаммах изучена
ранее [27]. При анализе нетоксигенных штаммов установлено, что клинические и водные ctxA-tcpA+ изоляты, как и токсигенные штаммы, имели ин-тактный ген vasH. Исключение составил штамм V. cholerae 866 (Ялта, 1996), у которого в начале гена в позиции 55 был делетирован нуклеотид (С) (таблица). У штаммов, не имеющих гены ctxA и tcpA, структура гена vasH была вариабельной, выявлено 6-18 единичных нуклеотидных замен. Несмотря на присутствие значительного количества однонуклеотидных полиморфизмов, они в большинстве были синонимичными. Несинонимичные замены выявлены у 4 штаммов (М1332, 433, 132, М1526). У штамма V. cholerae М1337 (Астрахань, 2000), кроме однонуклеотидных полиморфизмов, в позиции 1341-1352 обнаружена делеция 12 нуклео-тидов (таблица).
Аминокислотная последовательность белка VasH
Согласно данным литературы, белок VasH включает 530 аминокислот и функционально разделён на три участка: N-терминальный регуляторный (1-187), воспринимающий сигналы внешней среды; центральный (193-414) и С-терминальный (485525) с ДНК-связывающим НТН (496-512) доменом.
Структура и относительный уровень экспрессии гена vasH в штаммах V. cholerae O1 El Tor биовара Structure and relative level of expression of the vasH gene in strains of V. cholerae O1 El Tor biovar
№ Штамм V. cholerae Mесто; год; источник выделения штамма Структура гена vasH* Относительный уровень экспрессии гена vasH Relative level of vasH gene expression
No. V. cholerae strain The site, year and source of isolation strains vasH* gene structure
Токсигенные типичные штаммы | Toxigenic typical strains
1. M1062SSAB01 Россия, Астрахань; 1970; человек инт
2 M888LRBH01 Russia Astrakhan; 1970; Patient int
3. M893SSAA01
4. M818LAHM01 Россия, Балаково; 1970; человек инт
Russia, Balakovo; 1970; patient int
5. M1011SSAC01 Россия, Уфа; 1972; человек инт
Russia, Ufa; 1972; patient int
Токсигенные генетически изменённые штаммы | Toxigenic altered strains
6. M1270VXCC01 Россия, Набережные Челны; 1993; человек Russia, Naberezhnye Chelny; 1993; patient инт int 0,51 ± 0,02
7. M1275LRAF01 Россия, Дагестан; 1993; человек Russia, Dagestan; 1993; patient инт int 0,40 ± 0,025
8. M1293JFFW01 Россия, Дагестан; 1994; человек Russia, Dagestan; 1994; patient инт int 0,14 ± 0,015
9. R17644JRTW01 Россия, Ачинск; 1997; человек Russia, Achinsk; 1997; patient инт int 1,0 ± 0,04
10. M1327LRFE01 Россия, Дагестан; 1998; человек Russia, Dagestan; 1998; patient инт int 0,63 ± 0,01
11. M1344NEDY01 Россия, Казань; 2001; человек Russia, Kazan; 2001; patient инт int 0,34 ± 0,015
12. M1429LAEM01 Россия, Белорецк; 2004; человек Russia, Beloretsk; 2004; patient инт int 0,29 ± 0,025
0,23 ± 0,015 0,4 ± 0,02 0,05 ± 0,001 1,0**
Не определяли Not identified
6а6
ORIGINAL RESEARCHES
Окончание таблицы | End of the Table
№ No.
Штамм V. cholerae V. cholerae strain
Место; год; источник выделения штамма The site, year and source of isolation strains
Структура гена vasH* vasH* gene structure
Относительный уровень экспрессии гена vasH Relative level of vasH gene expression
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20. 21. 22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
RND18826AYOM01 Р-18899ь™101 L3226JDVX01
89NDXR01
M1509NEDZ01 3265/80JRQL01
М1395шв™
56MWRD01 866MWRF01 85NEDU01
Р18778NIFI01 М1501LRAE01 М1518ш;™1 М1524LQZS01 2613PYCA01
124PYCD01
М1332PYCE01 М1337NEEB01 Р-18748NIFH01 M1526VUAA01
132VUAC01 433NEDW01
3178PYCH01
Россия, Тверь; 2005; человек Russia, Tver; 2005; patient
Россия, Мурманск; 2006; человек Russia, Murmansk; 2006; patient
Россия, Москва; 2010; человек Russia, Moscow; 2010; patient
Украина, Ялта; 2010; внешняя среда Ukraine, Yalta; 2010; environmental sample
Россия, Москва; 2012; человек Russia, Moscow; 2012; patient
инт int
инт int
инт int
инт int
инт int
Россия, Москва; 2014; человек инт
Russia, Moscow; 2014; patient int
Нетоксигенные ctxA-tcpA+ штаммы | Non-toxigenic ctxA-tcpA+ strains
Россия, Астрахань; 1981; внешняя среда инт Russia, Astrakhan; 1981; environmental sample
Украина, Мариуполь; 1995; внешняя среда инт
Ukraine, Mariupol; 1995; environmental sample int
Украина, Ялта; 1996; внешняя среда ДС55 Ukraine, Yalta; 1996; environmental sample
Украина, Бердянск; 1999; человек инт
Ukraine, Berdyansk; 1999; patient int
Россия, Ростов; 2005; человек инт
Russia, Rostov; 2005; patient int
Россия, Элиста; 2011; человек инт
Russia, Elista; 2011; patient int
Россия, Элиста; 2012; внешняя среда инт
Russia, Elista; 2012; environmental sample int
Россия, Элиста; 2013; внешняя среда инт
Russia, Elista; 2013; environmental sample int
Россия, Элиста; 2015; внешняя среда инт
Russia, Elista; 2015; environmental sample int
Россия, Элиста; 2017; человек инт
Russia, Elista; 2017; patient int
0,72 ± 0,015 1,09 ± 0,035 0,07 ± 0,001 0,16 ± 0,015 0,49 ± 0,02 0,6 ± 0,03
2,13 ± 0,085
0,88 ± 0,06
0,77 ± 0,005
0,30 ± 0,01
1,72 ± 0,03
1,75 ± 0,045
0,64 ± 0,025
Не определяли Not identified
0,50 ± 0,03 0,93 ± 0,01
Штаммы, не имеющие гены ctxA и tcpA | Strains lacking ctxA and tcpA genes
Россия, Челябинск; 2000; человек 3/18 Russia, Chelyabinsk; 2000; patient
Россия, Астрахань; 2000; человек 0/8; Д1341-1352
Russia, Astrakhan; 2000; patient
Россия, Сочи; 2004; человек 0/13 Russia, Sochi; 2004; patient
Россия, Элиста; 2012; внешняя среда 1/6 Russia, Elista; 2012; environmental sample
Россия, Элиста; 2013; внешняя среда 1/9 Russia, Elista; 2013; environmental sample
Россия, Сочи; 2015; внешняя среда 3/18 Russia, Sochi; 2015; environmental sample
Россия, Элиста; 2017; внешняя среда 0/8 Russia, Elista; 2017; environmental sample
0,50 ± 0,005 0,71 ± 0,045 0,24 ± 0,005 0,21 ± 0,025 0,36 ± 0,035
Не определяли Not identified
0,07 ± 0,001
Примечание. В надстрочном индексе штаммов указан сокращённый код доступа в GenBank; инт — нуклеотидная последовательность идентична референс-штамму V. cholerae N16961 О1 El Tor биовара; * — цифры через черту (/) показывают количество несинонимичных замен/общее количество замен; ** — штамм-калибратор.
Note. In the superscript, the GenBank accession number is specified; int — nucleotide sequence is identical to the reference strain of V. cholerae N16961 O1, biovar El Tor; * — numbers separated with a slash (/) show the ratio of non-synonymous substitutions to total number of substitutions; ** — calibrator strain.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Белок VasH активен только при взаимодействии с альтернативной о54 субъединицей (белок RpoN), связывание с которой происходит в центральном домене, где расположены Walker A (220-229) и Walker B (286-296) мотивы. Мутанты с делетиро-ванными НТН или Walker доменами синтезируют функционально неактивный белок VasH [11, 23, 24].
Изучение последовательности аминокислот в VasH белке у взятых в анализ штаммов V. cholerae 01 El Tor биовара показало, что у всех токсиген-ных изолятов она идентична референс-штамму (таблица). У нетоксигенных ctxA-tcpA+ штаммов, за исключением V. cholerae 866, последовательность аминокислот в VasH также была идентична референсному. Делеция одного нуклеотида в начале гена в штамме 866 привела к изменению всей аминокислотной последовательности белка (рисунок). Вполне вероятно, что синтезируемый данным штаммом белок-регулятор VasH будет функционально неактивным.
У штаммов Р-18748 и 3178, имеющих только синонимичные замены, аминокислотная последо-
вательность VasH белка идентична референсному. В штамме М1337 в результате делеции большого участка гена значительно изменена карбоксильная область белка, затронувшая и НТН домен (рисунок). Подобные изменения приводят к биосинтезу белка, не способного взаимодействовать с генами-мишенями [23].
Несинонимичные однонуклеотидные полиморфизмы в штаммах V. cholerae M1526, 132, М1332 и 433 вызвали замены аминокислот в различных участках белковой молекулы VasH. В штамме М1526 в регуляторной аминотерминальной области вместо аспарагиновой кислоты включён гистидин (H116D). У штамма V. cholerae 132 в линкерной области между Walker A и Walker B доменами выявлен лизин (A267L). В штаммах М1332 и 433 в начале регуляторного N участка присутствует изолейцин (I14V), а не валин, как у референсного, а в линкерной области между о54-связывающим и НТН доменами произошла смена аминокислот S447P и V449A. Однако, по данным литературы, указанные замены не влияют на функциональные свойства белка VasH [23].
10 20 30 40 50
ref MSQWLAFATQ LVGVRKSHQL ALQFVDLLTQ GLDLSDSLLL LPSSDGRLLV
132 MSQWLAFATQ LVGVRKSHQL ALQFVDLLTQ GLDLSDSLLL LPSSDGRLLV
Р-18748 MSQWLAFATQ LVGVRKSHQL ALQFVDLLTQ GLDLSDSLLL LPSSDGRLLV
866 MSQWLAFATQ LVGVRKSHSL RCNLLIC*LK A*I*VIAFCC CHRRMGVYLC
M1337 MSQWLAFATQ LVGVRKSHQL ALQFVDLLTQ GLDLSDSLLL LPSSDGRLLV
260 270 280 290 300
ref AAIPEHLLES ELFGYCKGAF SGADSDKQGL IAQANGGTLF LDEIGDMPLT
132 AAIPEHLLES ELFGYCRGAF SGADSDKQGL IAQANGGTLF LDEIGDMPLT
Р-18748 AAIPEHLLES ELFGYCKGAF SGADSDKQGL IAQANGGTLF LDEIGDMPLT
866 RRSLSIYWKV NCLVTAKGHF LERTAINRDL SHKRMVARYF WMRSAICRSP
M1337 AAIPEHLLES ELFGYCKGAF SGADSDKQGL IAQANGGTLF LDEIGDMPLT
410 420 430 440 450
ref LKQYDFPGNV RELKHLIEFG CAQTADGTQV EASCFAHRLQ TLPCLAPEAT
132 LKQYDFPGNV RELKHLIEFG CAQTADGTQV EASCFAHRLQ TLPCLAPEAT
Р-18748 LKQYDFPGNV RELKHLIEFG CAQTADGTQV EASCFAHRLQ TLPCLAPEAT
866 LSSTTSREMC VS*NI*LSLA ARKQRMVRRW KLVALPIVYK PYPVLRLKRR
M1337 LKQYDFPGNV RELKHLIEFG CAQTADGTQV EASCFAHRLQ TLPCLAPVAV
460 470 480 490 500
ref PVAVSVETEN VDLEPSVALA GEPNFAVIHD LKQAVSQFEA LIISERLNRF
132 PVAVSVETEN VDLEPSVALA GEPNFAVIHD LKQAVSQFEA LIISERLNRF
Р-18748 PVAVSVETEN VDLEPSVALA GEPNFAVIHD LKQAVSQFEA LIISERLNRF
866 R*PFLSKLRT WTLNPRLRWL ENRILRLSMI *NRRSVSLKR *SSVSV*TAL
M1337 SVETENVDLE PSVALAGEPN FAVIHDLKQA VSQFEALIIS ERLNRFAGDR
510 520 530
ref AGDRAKAAKS LGIPKRTLAY KCLKLEIKTP *
132 AGDRAKAAKS LGIPKRTLAY KCLKLEIKTP *
Р-18748 AGDRAKAAKS LGIPKRTLAY KCLKLEIKTP *
866 LAIARKRRKV SVSLSVPWPT SA*NWRSKPH .
M1337 AKAAKSLGIP KRTLAYKCLK LEIKTP*... .
Фрагменты аминокислотной последовательности белка VasH некоторых штаммов V. cholerae. ref — референс-штамм V. cholerae N16961 О1 El Tor биовара. Жирным шрифтом выделены изменённые участки. Fragments of the amino acid sequence of VasH protein of some Vibrio cholerae strains. ref — reference strain V. cholerae N16961 O1, El Tor biovar. Altered regions are highlighted in bold.
Уровень экспрессии гена vasH
Заключительный этап работы был посвящён определению у взятых в анализ штаммов относительного уровня экспрессии гена vasH. В результате значительные отличия между типичными штаммами V. cholerae О1 El Tor биовара и геновариан-тами по экспрессии данного гена не выявлены. У типичных штаммов среднее значение относительного уровня экспрессии гена vasH составило 0,42, у геновариантов — 0,5 (таблица). У изолятов, не имеющих гены ctxA и tcpA, экспрессия vasH также была невысокой (среднее значение 0,35). В то же время выявлено статистически достоверное (p < 0,05) различие в уровне экспрессии vasH у штаммов с генотипом ctxA-tcpA+. Они отличались повышенным уровнем экспрессии данного гена (среднее значение 1,07). Среди штаммов данной группы выявлены три (М1395, Р18778, М1501), которые имели наиболее высокий уровень экспрессии гена vasH по сравнению с другими взятыми в работу штаммами (выделены жирным шрифтом в таблице).
Обсуждение
В ранее проведённой работе при сравнительном протеомном масс-спектрометрическом сканировании бактериальных лизатов клеток типичного штамма V. cholerae М1062 О1 El Tor биовара и генова-рианта М1509, выращенных в LB-бульоне при 37оС, у последнего было обнаружено присутствие 2 белков T6SS [28]. Отсутствие биосинтеза белков T6SS в лабораторных условиях у типичного токсигенного штамма согласуется с данными литературы. У указанных штаммов T6SS активна только in vivo или при культивировании в определённых условиях — повышенная осмолярность среды с содержанием 300 мМ NaCl, сниженная до 26оС температура [17]. Обнаружение экспрессии белков T6SS у генова-рианта позволило высказать предположение, что у данных штаммов изменился механизм регуляции T6SS и она стала активной при культивировании штаммов в лабораторных условиях. Проверку данной гипотезы мы начали с изучения структуры и экспрессии глобального регуляторного гена vasH. В результате установлено, что у всех изученных типичных штаммов и геновариантов V. cholerae О1 El Tor биовара нуклеотидная последовательность гена vasH идентична референс-штамму V. cholerae N16961 О1 El Tor биовара. Отличия между ними по экспрессии указанного гена также не выявлены (таблица). Видимо, указанные штаммы различаются по экспрессии других генов T6SS, но для проверки данного предположения необходимы дальнейшие исследования.
Кроме завезённых токсигенных штаммов, в работе были использованы штаммы V. cholerae О1 El Tor биовара, не имеющие гены ctxA и tcpA (таб-
ORIGINAL RESEARCHES
лица). Важность исследования данных штаммов заключается в том, что при попадании в организм человека они не способны вызвать холеру, но могут быть причиной острых кишечных инфекций. Не-токсигенные штаммы ежегодно выделяются из водных объектов нашей страны при мониторинговых исследованиях. При этом механизмы их длительного сохранения во внешней среде до конца не изучены. Из литературных источников известно, что водные штаммы V. cholerae являются гетерогенной группой по составу и структуре генов T6SS [19, 22], которые активно экспрессируются в данных штаммах, что повышает их выживаемость во внешней среде [16, 29].
Проведённые нами исследования показали, что вариабельным ген vasH был только у штаммов, не содержащих гены ctxA и tcpA; 90% взятых в анализ ctxA-tcpA+ штаммов, подобно токсигенным, имели интактную последовательность гена vasH (таблица). При изучении экспрессии гена vasH с использованием 0Т-ПЦР в режиме реального времени выявлено, что относительный уровень экспрессии данного гена у ctxA-tcpA+ штаммов в среднем в 3,1 раза выше, чем у изолятов, не имеющих гены ctxA и tcpA, а также в 2,6 и 2,14 раза больше, соответственно, чем у типичных штаммов и геновариан-тов. Именно среди ctxA-tcpA+ штаммов выявлены 3 изолята (М1395, Р18778, М1501), экспрессия vasH у которых была наибольшей (таблица). Для установления причины повышенной экспрессии vasH в ctxA-tcpA+ штаммах нами был проведён анализ структуры гена rpoS (VC0534), кодирующего биосинтез о54-РНК полимеразы, необходимой для активации транскрипции vasH [23, 24]. 0днако полученные сведения не позволили решить указанную проблему (данные не приводятся). Возможно, увеличение транскрипции vasH у ctxA-tcpA+ штаммов может быть обусловлено изменениями в экспрессии гена rpoS или структуре и экспрессии негативных регуляторов luxO (VC1021) и tsrA (VC0070), блокирующих транскрипцию vasH [13, 15]. Планируется продолжение данных исследований.
Заключение
При сравнительном анализе токсигенных и не-токсигенных штаммов V. cholerae 01 El Tor биовара, изолированных на территории России и Украины с 1970 по 2017 г., подтверждены данные зарубежных исследователей о наличии интактного гена vasH у токсигенных штаммов V. cholerae 01 El Tor биовара и вариабельного у штаммов, не содержащих гены ctxA и tcpA. В то же время в данной работе показано, что изученные нетоксигенные ctxA-tcpA+ изоля-ты, как и токсигенные штаммы, имеют интактный ген vasH. Транскрипционная активность гена vasH выявлена у всех взятых в анализ штаммов, а наибольший уровень экспрессии данного гена отмечен
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
у ctxA-tcpA+ штаммов. Необходимо отметить, что среди изученных 35 штаммов обнаружено только два нетоксигенных изолята (866, М1337 — 5,7%), предположительно синтезирующих функционально неактивный белок VasH, что ещё раз указывает на важную роль данного регулятора в биологии V. cholerae.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
1. Kaper J.B., Morris J., Levin M. Cholera. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8(1): 48-89. https://doi.org/10.1128/CMR.8.1.48.
2. Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(9): 3296-9. https://doi.org/10.1128/jcm.40.9.3296-3299.2002
3. Chin C.S., Sorenson J., Harris J.B., Robins W.P., Charles R.C., Jean-Charles R.R., et al. The origin of the Haitian cholera outbreak strain. N. Engl. J. Med. 2011; 364(1): 33-42. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1012928
4. Bundi M., Shah M.M., Odoyo E., Kathiiko C., Wandera E., Miring'u G., et al. Characterization of Vibrio cholerae O1 isolates responsible for cholera outbreaks in Kenya between 1975 and 2017. Microbiol. Immunol. 2019; 63(9): 350-8. https://doi.org/10.1111/1348-0421.12731
5. Weill F.X., Domman D., Njamkepo E., Almesbahi A.A., Naji M., Nasher S.S., et al. Genomic insights into the 2016-2017 cholera epidemic in Yemen. Nature. 2019; 565(7738): 230-3. https://doi.org/10.1038/s41586-018-0818-3
6. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Шашкова А.В., Куты-рев В.В. Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль-Тор, изолированных на территории России в современный период. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011; 26(3): 11-8.
7. Миронова Л.В., Балахонов С.В., Урбанович Л.Я., Поло-винкина В.С., Кожевникова А.С., Куликалова Е.С. и др. Обнаружение «гибридных» штаммов Vibrio cholerae eltor при эпидемических осложнениях в Сибири и на Дальнем Востоке. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011; 88(5): 12-8.
8. Заднова С.П., Кульшань Т.А., Челдышова Н.Б., Крицкий А.А., Плеханов Н.А., Смирнова Н.И. Сравнительный анализ выживаемости типичных штаммов и геновариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор in vitro и in vivo. Проблемы особо опасных инфекций. 2015; (4): 65-9. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2015-4-65-69
9. Son M.S., Megli C.J., Kovacikova G., Qadri F., Taylor R.K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 2011; 49(11): 3739-49. https://doi.org/10.1128/JCM.01286-11
10. Satchell K.J.F., Jones C.J., Wong J., Queen J., Agarwal S., Yildiz F.H. Phenotypic analysis reveals that the 2010 Haiti cholera epidemic is linked to a hypervirulent strain. Infect. Immun. 2016; 84(9): 2473-81. https://doi.org/10.1128/IAI.00189-16
11. Pukatzki S., Ma A.T., Sturtevant D., Krastins B., Sarracino D., Nelson W.C., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system.Proc. NatlAcad.Sci. USA.2006; 103(5): 1528-33. https://doi.org/10.1073/pnas.0510322103
12. Ma A.T., McAuley S., Pukatzki S., Mekalanos J.J. Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells. Cell. Host. Microbe. 2009; 5(3): 23443. https://doi.org/10.1016/jxhom.2009.02.005
13. Joshi A., Kostiuk B., Rogers A., Teschler J., Pukatzki S., Yildiz F.H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends. Microbiol. 2017; 25(4): 267-79. https://doi.org/10.1016/j.tim.2016.12.003
14. Монахова Е.В., Божко Н.В. Изучение экспрессии контакт-зависимых систем секреции холерными вибрионами на модели Dictyostelium discoideum. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2010; 87(4): 89-92.
15. Zheng J., Shin O.S., Cameron D.E., Mekalanos J.J. Quorum sensing and a global regulator TsrA control expression of type VI secretion and virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2010; 107(49): 21128-33. https://doi.org/10.1073/pnas.1014998107
16. Miyata S.T., Kitaoka M., Wieteska L., Frech C., Chen N., Pukatzki S. The Vibrio cholerae type VI secretion system: evaluating its role in the human disease cholera. Front. Microbiol. 2010; 1: 117. https://doi.org/10.3389/fmicb.2010.00117
17. Ishikawa T., Sabharwal D., Bröms J., Milton D.L., Sjöstedt A., Uhlin B.E., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infect. Immun. 2012; 80(2): 575-84. https://doi.org/10.1128/IAI.05510-11
18. Miyata S.T., Unterweger D., Rudko S.P., Pukatzki S. Dual expression profile of type VI secretion system immunity genes protects pandemic Vibrio cholerae. PLoS Pathog. 2013; 9(12): e1003752. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003752
19. Unterweger D., Miyata S.T., Bachmann V., Brooks T.M., Mul-lins T., Kostiuk B., et al. The Vibrio cholerae type VI secretion system employs diverse effector modules for intraspecific competition. Nat. Commun. 2014; 5: 3549. https://doi.org/10.1038/ncomms4549
20. Townsley L., Mangus M.P.S., Mehic S., Yildiz F.H. Response of Vibrio cholerae to low temperature shifts: CspV regulation of type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Appl. Environ. Microbiol. 2016; 82(14): 4441-52. http://dx.doi.org/10.1128/AEM.00807-16.
21. Crisan C.V., Chande A.T., Williams K., Raghuram V., Rishishwar L., Steinbach G., et al. Analysis of Vibrio cholerae genomes identifies new type VI secretion system gene clusters. Gen. Biol. 2019; 20(1): 163. https://doi.org/10.1186/s13059-019-1765-5
22. Santoriello F. J., Michel L., Unterweger D., Pukatzki S. Pandemic Vibrio cholerae shuts down site-specific recombination to retain an interbacterial defence mechanism. Nat. Commun. 2020; 11(1): 6246. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20012-7
23. Kitaoka M., Miyata S.T., Brooks T.M., Unterweger D., Pukatzki S. VasH is a transcriptional regulator of the type VI secretion system functional in endemic and pandemic Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 2011; 193(23): 6471-82. https://doi.org/10.1128/JB.05414-11
24. Seibt H., Aung K.M., Ishikawa T., Sjöström A., Gullberg M., Atkinson G.C., et al. Elevated levels of VCA0117 (VasH) in response to external signals activate the type VI secretion system of Vibrio cholerae O1 El Tor A1552. Environ. Microbiol. 2020; 22(10): 4409-23. https://doi.org/10.1111/1462-2920.15141
25. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis ofrelative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2"лла method. METHODS. 2001; 25(4): 402-8. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262
26. Крицкий А.А., Челдышова Н.Б., Тучков И.В., Смирнова Н.И. Разработка алгоритма определения уровня экспрессии генов ctxA и toxR Vibrio cholerae методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; (3): 53-7.
https://doi.org/10.21055/0370-1069-2017-3-53-57
27. Смирнова Н.И., Агафонова Е.Ю., Щелканова Е.Ю., Агафонов Д.А., Краснов Я.М., Ливанова Л.Ф. и др. Геномное
разнообразие нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae О1, выделенных на территории России и сопредельных стран. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2018; 36(2): 76-84.
https://doi.org/10.18821/0208-0613-2018-36-2-76-84
28. Заднова С.П., Баданин Д.В., Плеханов Н.А., Полунина Т.А., Котова Н.В., Крицкий А.А. и др. Сравнительные протеом-ные профили типичного штамма и генетически измененного варианта Vibrio cholerae О1 серогруппы биовара Эль Тор. Проблемы особо опасных инфекций. 2020; (3): 150-3. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2020-3-150-153
29. Bernardy E.E., Turnsek M.A., Wilson S.K., Tarr C.L., Hammer B.K. Diversity of clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae in natural transformation and contact-dependent bacterial killing indicative of type VI secretion system activity. Appl. Environ. Microbiol. 2016; 82(9): 2833-42. https://doi. org/10.1128/AEM.00351-16
REFERENCES
1. Kaper J.B., Morris J., Levin M. Cholera. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8(1): 48-89. https://doi.org/10.1128/CMR.8.1.48.
2. Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(9): 3296-9. https://doi.org/10.1128/jcm.40.9.3296-3299.2002
3. Chin C.S., Sorenson J., Harris J.B., Robins W.P., Charles R.C., Jean-Charles R.R., et al. The origin of the Haitian cholera outbreak strain. N. Engl. J. Med. 2011; 364(1): 33-42. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1012928
4. Bundi M., Shah M.M., Odoyo E., Kathiiko C., Wandera E., Mir-ing'u G., et al. Characterization of Vibrio cholerae O1 isolates responsible for cholera outbreaks in Kenya between 1975 and 2017. Microbiol. Immunol. 2019; 63(9): 350-8. https://doi.org/10.1111/1348-0421.12731
5. Weill F.X., Domman D., Njamkepo E., Almesbahi A.A., Na-ji M., Nasher S.S., et al. Genomic insights into the 2016-2017 cholera epidemic in Yemen. Nature. 2019; 565(7738): 230-3. https://doi.org/10.1038/s41586-018-0818-3
6. Smirnova N.I., Zadnova S.P., Shashkova A.V., Kutyrev V.V. Genome variability in the altered variants of Vibrio cholerae biovar El Tor isolated in Russia. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2011; 26(3): 102-10. https://doi.org/10.3103/S0891416811030062
7. Mironova L.V., Balakhonov S.V., Urbanovich L.Ya., Polovinki-na V.S., Kozhevnikova A.S., Kulikalova E.S., et al. Detection of "hybrid" Vibrio cholerae El Tor strains during epidemic complications in Siberia and Far East. Zhurnal mikrobiologii, epidemi-ologii i immunobiologii. 2011; 88(5): 12-8. (in Russian)
8. Zadnova S.P., Kul'shan' T.A., Cheldyshova N.B., Kritskiy A.A., Plekhanov N.A., Smirnova N.I. Comparative analysis of survival capacity among typical and genovariant strains of Vibrio cholerae, biovar El Tor in vivo and in vitro. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2015; (4): 65-9.
https://doi.org/10.21055/0370-1069-2015-4-65-69 (in Russian)
9. Son M.S., Megli C.J., Kovacikova G., Qadri F., Taylor R.K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 2011; 49(11): 3739-49.
https://doi.org/10.1128/JCM.01286-11
10. Satchell K.J.F., Jones C.J., Wong J., Queen J., Agarwal S., Yildiz F.H. Phenotypic analysis reveals that the 2010 Haiti cholera epidemic is linked to a hypervirulent strain. Infect. Immun. 2016; 84(9): 2473-81. https://doi.org/10.1128/IAI.00189-16
11. Pukatzki S., Ma A.T., Sturtevant D., Krastins B., Sarracino D., Nelson W.C., et al. Identification of a conserved bacterial pro-
ORIGINAL RESEARCHES
tein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2006; 103(5): 1528-33. https://doi.org/10.1073/pnas.0510322103
12. Ma A.T., McAuley S., Pukatzki S., Mekalanos J.J. Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells. Cell. Host. Microbe. 2009; 5(3): 234-43. https://doi.org/10.1016/j.chom.2009.02.005
13. Joshi A., Kostiuk B., Rogers A., Teschler J., Pukatzki S., Yildiz F.H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends. Microbiol. 2017; 25(4): 267-79. https://doi.org/10.1016Zj.tim.2016.12.003
14. Monakhova E.V., Bozhko N.V. Study of the expression of contact-dependent secretion systems by cholera vibrios on a model Dictyostelium discoideum. Zhurnal mikrobiologii, epidemi-ologii i immunobiologii. 2010; 87(4): 89-92. (in Russian)
15. Zheng J., Shin O.S., Cameron D.E., Mekalanos J.J. Quorum sensing and a global regulator TsrA control expression of type VI secretion and virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2010; 107(49): 21128-33. https://doi.org/10.1073/pnas.1014998107
16. Miyata S.T., Kitaoka M., Wieteska L., Frech C., Chen N., Pukatzki S. The Vibrio cholerae type VI secretion system: evaluating its role in the human disease cholera. Front. Microbiol. 2010; 1: 117. https://doi.org/10.3389/fmicb.2010.00117
17. Ishikawa T., Sabharwal D., Bröms J., Milton D.L., Sjöstedt A., Uhlin B.E., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infect. Immun. 2012; 80(2): 575-84. https://doi.org/10.1128/IAI.05510-11
18. Miyata S.T., Unterweger D., Rudko S.P., Pukatzki S. Dual expression profile of type VI secretion system immunity genes protects pandemic Vibrio cholerae. PLoS Pathog. 2013; 9(12): e1003752. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003752
19. Unterweger D., Miyata S.T., Bachmann V., Brooks T.M., Mul-lins T., Kostiuk B., et al. The Vibrio cholerae type VI secretion system employs diverse effector modules for intraspecific competition. Nat. Commun. 2014; 5: 3549. https://doi.org/10.1038/ncomms4549
20. Townsley L., Mangus M.P.S., Mehic S., Yildiz F.H. Response of Vibrio cholerae to low temperature shifts: CspV regulation of type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Appl. Environ. Microbiol. 2016; 82(14): 4441-52. http://dx.doi.org/10.1128/AEM.00807-16.
21. Crisan C.V., Chande A.T., Williams K., Raghuram V., Rishish-war L., Steinbach G., et al. Analysis of Vibrio cholerae genomes identifies new type VI secretion system gene clusters. Gen. Biol. 2019; 20(1): 163.
https://doi.org/10.1186/s13059-019-1765-5
22. Santoriello F.J., Michel L., Unterweger D., Pukatzki S. Pandemic Vibrio cholerae shuts down site-specific recombination to retain an interbacterial defence mechanism. Nat. Commun. 2020; 11(1): 6246.
https://doi.org/10.1038/s41467-020-20012-7
23. Kitaoka M., Miyata S.T., Brooks T.M., Unterweger D., Pu-katzki S. VasH is a transcriptional regulator of the type VI secretion system functional in endemic and pandemic Vibrio cho-lerae. J. Bacteriol. 2011; 193(23): 6471-82. https://doi.org/10.1128/JB.05414-11
24. Seibt H., Aung K.M., Ishikawa T., Sjöström A., Gullberg M., Atkinson G.C., et al. Elevated levels of VCA0117 (VasH) in response to external signals activate the type VI secretion system of Vibrio cholerae O1 El Tor A1552. Environ. Microbiol. 2020; 22(10): 4409-23. https://doi.org/10.1111/1462-2920.15141
25. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2"AACt method. Methods. 2001; 25(4): 402-8. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262
26. Kritskiy A.A., Cheldyshova N.B., Tuchkov I.V., Smirnova N.I. Development of the algorithm for identification of the level of
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Vibrio cholerae ctxA and toxR gene expression using RT-PCR with Real-Time hybridization-fluorescent registration of results. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2017; (3): 53-7. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2017-3-53-57 (in Russian)
27. Smirnova N.I., Agafonova E.Yu., Shchelkanova E.Yu., Aga-fonov D.A., Krasnov Ya.M., Livanova L.F., et al. Genomic diversity of nontoxigenic Vibrio cholerae O1 strains isolated in the territory of Russia and neighboring states. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2018; 36(2): 97-109. https://doi.org/10.18821/0208-0613-2018-36-2-76-84 (in Russian)
Информация об авторах
Заднова Светлана Петровнан — д.б.н., в.н.с. лаб. патогенных вибрионов Российского научно-исследовательского противочумного института «Mикроб», Саратов, Россия, svetlanazadnova@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-4366-0562 Плеханов Никита Александрович — к.б.н., с.н.с. лаб. патогенных вибрионов Российского научно-исследовательского противочумного института «Mикроб», Саратов, Россия, https://orcid.org/0000-0002-2355-7018
Спирина Алина Юрьевна — м.н.с. лаб. патогенных вибрионов Российского научно-исследовательского противочумного института «Mикроб», Саратов, Россия, https://orcid.org/0000-0001-9779-166X
Крицкий Андрей Александрович — к.б.н., зав. лаб. патогенных вибрионов Российского научно-исследовательского противочумного института «Mикроб», Саратов, Россия, https://orcid.org/0000-0002-5506-4285
Участие авторов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.
Статья поступила в редакцию 03.09.2022; принята к публикации 01.11.2022; опубликована 30.12.2022
28. Zadnova S.P., Badanin D.V., Plekhanov N.A., Polunina T.A., Kotova N.V., Kritskiy A.A., et al. Comparative proteomic profiles of typical strain and genetically altered variant of Vibrio cholerae O1, biovar El Tor. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2020; (3): 150-3. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2020-3-150-153 (in Russian)
29. Bernardy E.E., Turnsek M.A., Wilson S.K., Tarr C.L., Hammer B.K. Diversity of clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae in natural transformation and contact-dependent bacterial killing indicative of type VI secretion system activity. Appl. Environ. Microbiol. 2016; 82(9): 2833-42. https://doi.org/10.1128/AEM.00351-16
Information about the authors
Svetlana P. ZadnovaM — D. Sci. (Biol), leading researcher, Laboratory of pathogenic vibrios, Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russia, svetlanazadnova@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-4366-0562
Nikita A. Plekhanov — Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of pathogenic vibrios, Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russia, https://orcid.org/0000-0002-2355-7018 Alina Yu. Spirina — junior researcher, Laboratory of pathogenic vibrios, Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russia, https://orcid.org/0000-0001-9779-166X
Andrey A. Kritskiy — Cand. Sci. (Biol.), Head, Laboratory of pathogenic vibrios, Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russia, https://orcid.org/0000-0002-5506-4285 Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published.
The article was submitted 03.09.2022; accepted for publication 01.11.2022;
published 30.12.2022
