CC BY
1
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА / QUALITY CONTROL
УДК 615.072:615.371: 616.9
https://doi.org/10.50895/2221-996X-2024-24-5-548-556 Оригинальная статья | Original article
Щ Check for updates
(cc)
BY 4.0
Сравнительный анализ результатов испытаний вакцины сибиреязвенной живой по показателю «Подлинность» иммунофлуоресцентным и иммунохроматографическим методами
С.А. Алексееван, И.В. Касина, Т.И. Немировская
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051, Российская Федерация
ЕЗ Алексеева Светлана Александровна; AlekseevaS@expmed.ru
РЕЗЮМЕ ВВЕДЕНИЕ. Для проведения экспертизы качества вакцины сибиреязвенной живой по по-
казателю «Подлинность» актуальным представляется внедрение альтернативных методов анализа, позволяющих специфически идентифицировать споровый сибиреязвенный антиген с помощью соответствующих диагностических препаратов, зарегистрированных в Российской Федерации, предназначенныхдля выявления спор ВасШизапОпгас/з. ЦЕЛЬ. Оценка возможности применения иммунофлуоресцентного метода и сравнительный анализ результатов его применения с иммунохроматографическим методом при испытании вакцины сибиреязвенной живой по показателю «Подлинность». МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В работе использовали коммерческие серии вакцины сибиреязвенной живой. Применяли коммерческие диагностические препараты российского производства: иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные сухие, набор реагентов: иммунохроматографическая тест-система для экспресс-выявления и идентификации спор возбудителя сибирской язвы (ИХ тест-система В. ап0пгас15). Для приготовления мазков и проведения реакции в ИХ тест-системе готовили рабочие разведения микробных взвесей исходя из общей концентрации спор вакцинного штамма В. ап0пгас15 СТИ-1 с помощью фармакопейного стандартного образца мутности бактериальных взвесей 10 МЕ. Регистрировали качественные реакции образования иммунокомплексов.
РЕЗУЛЬТАТЫ. При испытании вакцины сибиреязвенной живой иммунофлуоресцентным методом при окраске мазков диагностическими иммуноглобулинами в разведениях 1:52 и 1:64 наблюдалась яркая зеленовато-желтая флуоресценция оболочки микробной клетки - оценка интенсивности флуоресценции на 4+ и 5+. При исследовании вакцины сибиреязвенной живой иммунохроматографическим методом выявлен споровый антиген в концентрациях вакцины 108 и 109 спор/мл - зарегистрированы две отчетливые полосы темно-розового цвета, что свидетельствует о формировании иммунопреципитата. Результаты, полученные указанными методами, подтверждают принадлежность исследуемой микробной культуры к виду В. ап0пгас15.
ВЫВОДЫ. Применение иммунохроматографического и иммунофлуоресцентного методов анализа с помощью соответствующих диагностических препаратов, является удобным и надежным подходом для видоспецифического выявления спор В. ап0пгас15 СТИ-1 в вакцине сибиреязвенной живой. Полученные результаты испытания вакцины сибиреязвенной живой по показателю качества «Подлинность» могут быть основанием для рекомендации вышеуказанных методов как альтернативных в качестве дополнения к методу бактериоскопии спор по Цилю - Нильсену, который в настоящее время применяется в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации.
© С.А. Алексеева, И.В. Касина, Т.И. Немировская, 2024
Ключевыеслова: вакцина сибиреязвенная живая; иммунобиологический лекарственный препарат; показатель «Подлинность»; иммунофлуоресцентный метод; иммунохроматографический метод; диагностические препараты; иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие; ИХ тест-система; споры вакцинного штамма В. апОпгас/з СТИ-1; фармакопейный стандартный образец мутности бактериальных взвесей 10 МЕ; нормативная документация
Для цитирования: Алексеева С.А., Касина И.В., Немировская Т.И. Сравнительный анализ результатов испытаний вакцины сибиреязвенной живой по показателю «Подлинность» иммунофлуоресцент-ным и иммунохроматографическим методами. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2024;24(5):548-556. https://doi.org/10.50895/2221-996X-2024-24-5-548-556
Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России № 056-00026-24-01 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР № 124022200103-5). Потенциальный конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Comparative analysis of the results of live anthrax vaccine identification by immunofluorescence and immunochromatography
Svetlana A. Alekseeva®, Irina V. Kasina, Tatiana I. Nemirovskaya
Scientific Centrefor Expert Evaluation of Medicinal Products, 8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051, Russian Federation
E3 Svetlana A. Alekseeva; AlekseevaSfôexpmed.ru
ABSTRACT INTRODUCTION. The quality evaluation of Live anthrax vaccines will benefit from the implementation of alternative testing methods that are capable of specific identification of the Bacillus anthracis spore antigen using the appropriate diagnostic products that are authorised in the Russian Federation for the detection of B. anthracis spores.
AIM. This study aimed to investigate the applicability of immunofluorescence analysis to the identification of live anthrax vaccines and compare this method with immunochromatography. MATERIALS AND METHODS. The study used commercial batches of a live anthrax vaccine and Russian diagnostic products, including diagnostic dry adsorbed fluorescent anti-anthrax spore immunoglobulins and an immunochromatographic assay (ICA) reagent kit for rapid detection and identification of B. anthracis spores (ICA system for B. anthracis). For smears and ICA system reactions, the authors prepared working solutions of bacterial suspensions at spore concentrations typical ofthe B. anthracis STI-1 vaccine strain. The spore concentrations were achieved using the pharmacopoeial reference standard (RS) for the opacity of bacterial suspensions of 10 international units (IU). Identification reactions involved the registration of immune complex formation.
RESULTS. Immunofluorescence tests ofthe live anthrax vaccine demonstrated bright greenish-yellow envelope fluorescence with an intensity score of 5+ to 4+ for smears stained with diagnostic immunoglobulins at 1:52 and 1:64 dilutions. Immunochromatographic tests ofthe live anthrax vaccine detected the spore antigen at vaccine concentrations of 109 and 108 spores/mL, with the test strips showing two distinct dark-pink lines indicative of immuno-precipitation. According to the results obtained using the selected methods, the tested microbial culture was confirmed as B. anthracis.
CONCLUSIONS. Immunochromatography and immunofluorescence tests with appropriate diagnostic preparations are convenient and reliable tools for the species-specific detection of B. anthracis STI-1 spores in the live anthrax vaccine. The results obtained in the anthrax vaccine identification tests provide a basis for recommending the above methods as supplementary alternatives to Ziehl-Neelsen bacteriological staining, which is currently prescribed by the State Pharmacopoeia ofthe Russian Federation.
Keywords: Live anthrax vaccine; immunobioLogicaL medicinal product; identification; immunofluorescence
analysis; immunochromatography; diagnostic products; diagnostic fluorescent immunoglobulins; immunochromatographic assay; ICA system; B. anthracis STI-1 vaccine strain spores; pharmacopoeial reference standard for the bacterial suspension opacity of 10 IU; regulatory standards
Forcitation: Alekseeva S.A., Kasina I.V., Nemirovskaya T.I. Comparative analysis of the results of live an-
thrax vaccine identification by immunofluorescence and immunochromatography. Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2024;24(3):348-356. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2024-24-3-348-556
Funding. This study was conducted by the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products as part of the applied research funded under State Assignment No. 056-00026-24-01 (R&D Registry No. 124022200103-5). Disclosure. The authors declare no conflict of interest.
ВВЕДЕНИЕ
Основным способом предупреждения заболевания сибирской язвой является плановая иммунизация сельскохозяйственных животных в неблагополучных районах и вакцинация лиц, подверженных повышенному риску заражения сибирской язвой. В Российской Федерации для иммунизации населения используется отечественная вакцина сибиреязвенная живая, которая представляет собой споры вакцинного сибиреязвенного штамма Bacillus anthracis СТИ-1, лиофилизированные в 10% водном растворе сахарозы. Вакцина после двукратного применения с интервалом 20-30 сут вызывает формирование специфического иммунитета продолжительностью до 1 года [1]. В Китае используют живую сибиреязвенную вакцину на основе штамма В. anthracis A16R. В США и Великобритании применяют химические вакцины - AVA и AVP соответственно [2].
В соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации1 (ГФ РФ) обязательным показателем качества вакцины живой сибиреязвенной является показатель «Подлинность», который подтверждается при микроскопии мазков, окрашенных по Цилю - Нильсену. Однако, по мнению авторов статьи, данный метод объективно не характеризует подлинность вакцины, так как не всегда позволяет специфически идентифицировать споровый сибиреязвенный антиген [3].
При проведении экспертизы качества вакцины сибиреязвенной живой по показателю
«Подлинность» важным аспектом является внедрение альтернативных перспективных методов анализа с помощью соответствующих диагностических препаратов, зарегистрированных в Российской Федерации, предназначенных для выявления спор возбудителя сибирской язвы. В лабораторной диагностике для обнаружения возбудителя сибирской язвы или его компонентов (ДНК, антигенов) используются разные диагностические наборы, бактериофаги и питательные среды2 [4-7]. Ранее в опубликованной авторами работе при оценке качества вакцины по показателю «Подлинность» было продемонстрировано, что иммунохромато-графический метод может быть эффективным экспресс-методом для видоспецифического выявления спор В. ап^гас/^ СТИ-1 в сибиреязвенной вакцине [3]. Кроме того, в других работах авторов рассмотрены альтернативные методы испытания вакцины сибиреязвенной и других вакцин против особо опасных инфекций (туляремийная, бруцеллезная, чумная вакцины) по показателю «Подлинность» [8-10]. Так, например, был применен иммунофлуорес-центный метод, основанный на окраске спор В. ап^гас/^ специфичными иммуноглобулинами, меченными флуоресцентным красителем (реакция иммунофлуоресценции), и показана его диагностическая эффективность [8, 9]. Таким образом, внедрение альтернативных иммунологических методов для ускоренной оценки показателя «Подлинность» сибиреязвенной вакцины с помощью российских диагностических препаратов обеспечивает эффективный
ОФС.1.7.1.0018.18 Иммунобиологические лекарственные препараты. Государственная фармакопея Российской Федерациях^ изд. Т. 2; 2018.
ФС.3.3.1.0016.15 Вакцина сибиреязвенная живая, лиофилизат для приготовления суспензии для подкожного введения и накожного скарификационного нанесения. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 4; 2018. Шепелин ИА, Миронов АЮ, Шепелин КА. Возбудители особо опасных бактериальных инфекций: Справочник бактериолога. М.; 2016.
Онищенко ГГ, Кутырев ВВ, ред. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. М.:ЗАЩ «Шико»; 2013.
контроль качества данного иммунобиологического лекарственного препарата.
Цель работы - оценка возможности применения иммунофлуоресцентного метода и сравнительный анализ результатов его применения с иммунохроматографическим методом при испытании вакцины сибиреязвенной живой по показателю «Подлинность».
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- выявление спорового антигена в вакцине сибиреязвенной живой иммунофлуоресцентным методом с помощью коммерческих иммуноглобулинов диагностических сибиреязвенных при определении показателя качества «Подлинность»;
- проведение сравнительного анализа испытаний вакцины сибиреязвенной живой по показателю «Подлинность» иммунофлуоресцентным и иммунохроматографическим методами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы
В исследовании использовали следующие основные материалы:
- вакцина сибиреязвенная живая, лиофилизат для приготовления суспензии для подкожного введения и накожного скарификационного нанесения, серия 2850921, производства ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Минобороны России;
- фармакопейный стандартный образец (ФСО) мутности бактериальных взвесей 10 МЕ (ФСО мутности 10 МЕ) - ФСО 3.1.00085 (ОСО 42-28-85) производства ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России;
- иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные сухие по ТУ 9389-00501897080-2010 (ФСР 2011/11339), серия 1-22, производства ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, Россия;
- набор реагентов «Иммунохроматогра-фическая тест-система для экспресс-выявления и идентификации спор возбудителя сибирской язвы (ИХ тест-система В. ап^гас'ф по ТУ 9398-093-78095326-2008 (ФСР 2009/05485), серия 084-К-19, производства ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, Россия.
Оборудование
Учет результатов иммунофлуоресцентного анализа проводили на микроскопе люминесцентном (Axio Scope Al, Carl Zeiss, Германия).
Методы
При выполнении работ руководствовались требованиями СанПиН 3.3686-21 и методиче-скимиуказаниями МУК4.2.241 3-083.
Подтверждение подлинности вакцины сибиреязвенной живой иммунофлуоресцентным методом проводили с помощью иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных сухих, представляющих собой меченную флуоресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ) иммуноглобулиновую фракцию к водорастворимому антигену споровой формы В. anthracis, выделенную из гипериммунной кроличьей сыворотки и адсорбированную на основе магноиммуносорбентов с водорастворимыми антигенами штаммов В. cereus 8, В. cereus 104, В. cereus 111, В. megaterium 6.
Препарат обеспечивает видоспецифическое выявление и идентификацию спор В. anthracis в суспензиях, полученных из колоний микроорганизмов, выращенных на питательном агаре в течение 7 сут при температуре 35±1 °С, и в суспензиях, полученных из сырья животного происхождения и объектов окружающей среды путем специальной пробоподготовки, при которой из выращенных культур готовят микробные взвеси в 0,9% растворе натрия хлорида по ФСО мутности 10 МЕ, эквивалентной концентрации 108 спор/мл. Рабочее разведение иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных сухих - 1:64. Согласно инструкции по применению рабочее разведение иммуноглобулинов должно быть не менее 1:16. В данной работе при окраске мазков с вакциной сибиреязвенной использовали разведения иммуноглобулинов 1:32 и 1:64. Поскольку вакцина сибиреязвенная живая представляет собой взвесь живых спор вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1, лиофилизированную в 10% водном растворе сахарозы, в связи с чем пробоподготовка исследуемого образца для получения спор не требовалась. Взвесь спор вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 разводили исходя из общей концентрации, указанной в паспорте на вакцину, 0,9% раствором натрия хлорида (рН 7,2±0,2) до концентрации 108 спор/мл по ФСО мутности 10 МЕ и готовили мазки. Далее
СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» (утв. Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4). МУК 4.2.2413-08.4.2 Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы. Методические указания (утв. Роспотребнадзором 29.07.2008).
проводили обеззараживание и окраску мазков, а также учет результатов в соответствии с инструкцией по применению на иммуноглобулины. Для учета результатов испытания вакцины использовалась система оценки по интенсивности свечения и количеству специфически светящихся клеток4: 4+ - очень яркая, сверкающая флуоресценция зеленовато-желтого цвета оболочки микробной клетки, четко контрастирующая с темным телом клетки; 3+ - яркая флуоресценция зеленовато-желтого цвета оболочки микробной клетки, при этом клетки расположены отдельными группами и единично; 2+ - слабое свечение всей микробной клетки; 1+ - едва заметные контуры клетки. Препарат вакцины сибиреязвенной живой в рабочем разведении должен обеспечивать специфическое зеленовато-желтое свечение интенсивностью на 3+ или 4+. Свечение на 1+ или 2+ свидетельствует об отсутствии в исследуемых мазках В. anthracis в споровой форме. При этом препарат вакцины в рабочем разведении не должен вызывать специфическую флуоресценцию гете-рологичных штаммов рода Bacillus.
Испытания вакцины сибиреязвенной живой по показателю «Подлинность» иммуно-хроматографическим методом проводили, как описано ранее [3]. Для исследования готовили суспензию из взвеси спор вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 до концентрации 109 спор/мл, исходя из общей концентрации спор, указанной в паспорте на вакцину (4,9 млрд спор/мл). Затем разводили в 0,9% растворе натрия хлорида (pH 7,2±0,2) до концентрации 108 спор/мл по ФСО мутности 10 МЕ. Микробные взвеси в полученных разведениях в объеме 0,1 мл вносили в лунку тест-системы. Через 15 мин фиксировали результат.
Статистическая обработка данных. Испытания проводили три оператора, каждый использовал по одному образцу (ампула) вакцины сибиреязвенной живой. Так как при применении
иммунофлуоресцентного и иммунохроматогра-фического методов регистрировали качественные реакции образования иммунокомплек-сов, результаты оценивали визуально, в связи с чем статистической обработки полученных результатов не проводилось.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При контроле качества иммунобиологических лекарственных препаратов по показателю «Подлинность» предприятиями-изготовителями, контрольными лабораториями, экспертными организациями применяется широкий спектр методов - биологических, химических, физико-химических, молекулярных и др.5 В отношении препаратов вакцин против особо опасных инфекций (сибиреязвенная, туляремийная, бруцеллезная, чумная вакцины)6 существующие методы оценки по показателю «Подлинность» чаще всего являются достаточно трудоемкими, сложными и длительными, а также не всегда обеспечивают высокую достоверность анализа. В связи с этим для подтверждения подлинности вакцины сибиреязвенной более предпочтительным является использование иммунофлуоресцентного и иммунохроматографического методов, которые отвечают основным современным критериям, таким как экспрессность, относительная простота проведения анализа, высокая достоверность результатов анализа. Данные методы успешно применяются для экспресс-диагностики сибирской язвы как в отечественной, так и в зарубежной лабораторной практике7.
Результаты испытания вакцины сибиреязвенной живой иммунофлуоресцентным методом
Как видно на рисунке 1, при окраске мазков препарата вакцины сибиреязвенной живой диагностическими иммуноглобулинами в обоих разведениях наблюдалась яркая зеленовато-желтая, сверкающая флуоресценция оболочки, четко контрастирующая с темным телом споры,
МУК 4.2.2413-08.4.2 Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы. Методические указания (утв. Роспотребнадзором 29.07.2008). Инструкция по применению иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных сухих. ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора; 2011.
ОФС.1.7.1.0018.18 Иммунобиологические лекарственные препараты. Государственная фармакопея Российской Федерациях^ изд. Т. 2; 2018.
ФС.3.3.1.0011.15 Вакцина бруцеллезная живая, лиофилизат для приготовления суспензии для подкожного введения и накожного скарификационного нанесения. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 4; 2018. ФС.3.3.1.0016.15 Вакцина сибиреязвенная живая, лиофилизат для приготовления суспензии для подкожного введения и накожного скарификационного нанесения. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 4; 2018. ФС.3.3.1.0019.15 Вакцина туляремийная живая, лиофилизат для приготовления суспензии для внутрикожного введения и накожного скарификационного нанесения. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 4; 2018. ФС.3.3.1.0022.15 Вакцина чумная живая, лиофилизат для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 4; 2018. Задорина ИИ. Антигенная и молекулярно-генетическая оценка стабильности вакцинного сибиреязвенного штамма Лан-ге после длительного хранения: дис.... канд. вет. наук. Казань; 2020.
*
ê i
М&Ь^+ЩгШ
г rai
да
Фотографии выполнены авторами/The photograph is taken bythe authors
Рис. 1. Результаты испытаний вакцины сибиреязвенной живой по показателю «Подлинность» при окрашивании иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими сибиреязвенными споровыми адсорбированными. Споры В. anthracis СТИ-1 из препарата вакцины сибиреязвенной живой в разведении 1:32 (А) и 1:64 (В). Микроскопия, увеличение *1000.
Fig. 1. Results of live anthrax vaccine identification involving staining with diagnostic adsorbed fluorescent anti-anthrax spore immunoglobulins. B. anthracis STI-1 spores from the vaccine at dilutions of 1:32 (A) and 1:64 (B). Microscopy, *1000 magnification.
оцениваемая на 3+ или 4+8. При этом были отчетливо видны окрашенные споры как в скоплениях, так и при одиночном расположении размером (0,8-1,0)*1,5 мкм9. Было отмечено, что испытуемый препарат вакцины сибиреязвенной живой в рабочем разведении не вызывал специфическую флуоресценцию гетероло-гичных штаммов рода Bacillus.
На основании полученных результатов при испытании вакцины сибиреязвенной живой по показателю «Подлинность» рекомендовано окрашивать мазки диагностическими сибиреязвенными иммуноглобулинами в рабочем разведении.
Сравнительный анализ данных, полученных при исследовании вакцины сибиреязвенной живой иммунохроматографическим и иммунофлуоресцентным методами
При выявлении спорового антигена в вакцине сибиреязвенной живой иммунохроматографическим и иммунофлуоресцентным методами с помощью, соответственно, ИХ тест-системы В. anthracis и диагностических сибиреязвенных иммуноглобулинов были зафиксированы положительные результаты. В концентрациях суспензии вакцины сибиреязвенной живой, равных 109 и 108 спор/мл, в зоне «С» и «Т» тест-полосок отчетливо видны красные линии (рис. 2), которые свидетельствуют о связывании спорового антигена В. anthracis со специфическими антителами, иммобилизованными на тестовой линии [7].
toi l B. anthracis споры -
О tou^j
B. anthracis споры
I* 1Д »
B. anthracis споры
vi *
В. anthracis споры
л ^ ''JMSI m
L В. anthracis споры
Фотография выполнена авторами/The photograph is taken bythe authors
Рис. 2. Результаты испытаний вакцины сибиреязвенной живой по показателю «Подлинность», полученные с применением иммунохроматографической тест-системы для экспресс-выявления и идентификации спор возбудителя сибирской язвы (ИХтест-система В. anthracis).
Fig. 2. Results of live anthrax vaccine identification using im-munochromatographic assay (ICA) reagent kit for rapid detection and identification of B. anthracis spores (ICA system for B. anthracis).
Примечание. Обозначения на фотографии: ВСЖ - вакцина сибиреязвенная живая; 10', 108, 107 спор/мл - концентрация микробной взвеси вакцины.
Note. The markings on the test strips for B. anthracis spores indicate the tested concentrations of the live anthrax vaccine (ВСЖ) bacterial suspension (107,108, and 10' spores/mL).
МУК 4.2.2413-08.4.2 Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы. Методические указания (утв. Роспотребнадзором 29.07.2008). Поздеев ОК. Медицинская микробиология. М.; 2004.
Следует отметить, что полученные авторами в данной работе положительные результаты испытаний на наличие спорового антигена В. аМИгася иммунохроматографическим методом с помощью ИХ тест-системы коррелируют с положительными результатами других исследователей [11].
Таким образом, результаты испытания вакцины сибиреязвенной живой продемонстрировали, что как иммунофлуоресцентный, так и им-мунохроматографический методы равноценны и подтверждают подлинность сибиреязвенного микроба, входящего в состав вакцины. При этом важно отметить, что каждый метод имеет как пре-имущества, так и недостатки (табл. 1).
Использование иммунохроматографического теста при подтверждении подлинности вакцины сибиреязвенной живой, учитывая быстроту анализа, высокую специфичность и экономичность, является удобным и надежным методом. Достоверность тестов достигает 92-99,8%, и при этом каждый тест имеет встроенный
внутренний контроль [11]. К недостаткам используемых тест-систем можно отнести субъективность оценки результатов в спорных моментах, однако это можно нивелировать путем проведения контрольныхтестов10.
В свою очередь, иммунофлуоресцентный метод может быть эффективным в силу наглядного учета результатов, невысокой стоимости иммуноглобулинов диагностических сибиреязвенных споровых адсорбированных и относительно большого срока их годности (3 года). Следует отметить значительный разброс данных литературы по характеристике специфичности этого метода. Согласно данным Ю.О. Селянинова и И.Ю. Егорова [12], специфичность метода составляет 70% из-за большого числа перекрестно реагирующих антигенов с близкородственными микроорганизмами. Результаты другого исследования показывают, что иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные в разведении 1:64 выявляют 93,8±6,0% исследуемых штаммов В. апМгааБ (оценка
Таблица 1. Сравнительная характеристика иммунохроматографического и иммунофлуоресцентного методов при оценке качества вакцины сибиреязвеннойживой
Table 1. Comparative characteristics of immunochromatography and immunofluorescence analysis for the quality assessment of the live anthrax vaccine
Показатель Метод Method
Parameter Иммунохроматографический Immunochromatography Иммунофлуоресцентный immunofluorescence
Время проведения анализа Testing time 15-20 мин 15-20 min 2,5 ч 2.5 h
Специфичность Specificity 92-99,8% (со встроенным внутренним контролем) 92-99.8% (integrated internal control) 70-99%
Наглядностьучета результатов Visual clarity ofresults Визуальная оценка невооруженным глазом Unaided visual inspection Визуальная оценка с помощью микроскопа Microscopy
Срок годности диагностических препаратов11 Shelf life of diagnostic products" 1 год 1 year 3 года 3 years
Использование дополнительного оборудования Additional equipment Не используется not used Используется used
Стоимость диагностических препаратов12 Cost of diagnostic products12 1100 рублей за упаковку (3 теста) 1100 rubles per pack (3 test strips) 340 рублей за ампулу 340 rubles per ampoule
Таблица составлена авторами с использованием источников согласно сноскам11,12 /The table is prepared by the authors using data from the sources specified in the footnotes1112
Задорина ИИ. Антигенная и молекулярно-генетическая оценка стабильности вакцинного сибиреязвенного штамма Лан-ге после длительного хранения: дис.... канд. вет. наук. Казань; 2020.
Инструкция по применению иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных сухих. ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора; 2011.
Инструкция по применению иммунохроматографической тест-системы для экспресс-выявления и идентификации спор возбудителя сибирской язвы В. апЫгася «ИХ тест-система споры В. апМгас/х». ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора; 2009. https://www.snipchi.ru/page.php785
https://www.obolensk.org/services/nutrient-media/diagnostics
по интенсивной флуоресценции на 3+ или 4+), при этом в 96,9±3,1% случаев не реагируют со штаммами близкородственных микроорганизмов13. Однако недостатком данного метода является использование дорогостоящего оборудования - люминесцентного микроскопа с системой светофильтров.
ВЫВОДЫ
1. Иммунофлуоресцентный метод с использованием иммуноглобулинов диагностических сибиреязвенных споровых адсорбированных является эффективным методом для видоспецифического выявления спор В. аМИгася СТИ-1 в вакцине сибиреязвенной живой. Основные преимущества метода: наглядность учета результатов, невысокая стоимость иммуноглобулинов и относительно большой срок их годности (3 года).
2. Иммунохроматографический метод с использованием диагностического набора реаген-
тов - иммунохроматографическая тест-система для экспресс-выявления и идентификации спор возбудителя сибирской язвы (ИХ тест-система В. аМЬгааз) эффективен для подтверждения подлинности спорового антигена вакцины сибиреязвенной живой. Основные преимущества метода: быстрота и простота проведения анализа, специфичность и экономичность.
3. Представленные результаты испытания вакцины сибиреязвенной живой по показателю качества «Подлинность» иммунофлуорес-центным и иммунохроматографическим методами с помощью коммерческих диагностических препаратов российского производства являются основанием для рекомендации внесения данных методов в нормативную документацию на вакцину сибиреязвенную живую в качестве альтернативных подходов, дополнительных к методу бактериоскопии спор по Цилю - Нильсену.
Литература/References
1. Медуницын HB, Катлинский AB, Ворслов ЛО. Вакцино-логия: монография. М.: Практическая медицина. 2022. 480 с.
Medunitsyn NV, KatLinsky AV, Vorslov LO. Vaccinology: monograph. Moscow: Prakticheskaya meditsina; 2022 (In Russ.).
EDN: FOLWPT
2. Микшис НИ, Попова ПЮ, Семакова АП, Кутырев ВВ. Лицензированные сибиреязвенные вакцины и экспериментальные препараты на стадии клинических исследований. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2017;(4):112-26.
Mikshis N1, Popova PYu, Semakova АР, Kutyrev VV. Licensed anthrax vaccines and experimental preparations at the stage of clinical trials. Journal of Microbiology, Epidemiology and immunology. 2017;(4):112-26 (In Russ.). https://doi.org/10.56255/0572-9511-2017-4-112-126 5. Касина ИВ, Алексеева CA, Немировская ТИ. Теоретическое и экспериментальное обоснование перспективных методов экспертизы качества вакцины сибиреязвенной живой. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2020;20(4):277-84.
Kasina IV, Alekseeva SA, Nemirovskaya Tl. Theoretical and experimental substantiation of alternative methods for quality control of live anthrax vaccine. BiOprepara-tions. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2020;20(4):277-84 (In Russ.).
https://doi.org/10.50895/2221-996X-2020-2Q-4-277-284
4. Дятлов ИА, ред. Методы изучения биологических и мо-лекулярно-генетических свойств возбудителя сибирской язвы. Оболенск:Династия; 2021.
Dyatlov IA, ed. Methods for studying the biological and molecular genetic properties ofthe anthrax pathogen. Obolensk: Dinastiya; 2021 (In Russ.). EDN: LBRSWO
5. Саяпина ЛВ, Лобач PH, Бондарев В., Никитюк НФ. Современное состояние лабораторной диагностики
сибирской язвы: обнаружение и идентификация Bacillus anthracis. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2016;16(1):27-54.
Sayapina LV, Lobach RN, Bondarev VP, Nikityuk NF. Current status of the laboratory diagnosis of anthrax: detection and identification of Bacillus anthracis. BiOprepara-tions. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2016;16(l):27-54 (In Russ.). EDN:VSCUOR
6. Жарникова ИВ, Курчева CA, Русанова ДВ, Жарникова ТВ. Аналитические характеристики диагностических препаратов для иммуноанализа особо опасных инфекций. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2020;16(5):56-42.
Zharnikova IV, Kurcheva SA, Rusanova DV, Zharnikova TV. Analytical characteristics of diagnostic preparations for immunoassay of particularly dangerous infections. Yu.A. Ovchinnikov Bulletin of Biotechnology and Physical and Chemical Biology 2020;16(5):56-42 (In Russ.). EDN: NMWSEM
7. Егорова ИЮ, Селянинов ЮО, Ковалева EH. Оценка эффективности и практической пригодности современных методов экспресс-индикации возбудителя сибирской язвы. RussianJournal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. 2016;(2):5-15.
Egorova IYu, Selyaninov YuO, Kovaleva EN. Evaluation of effectiveness and feasibility of up-to-date methods for anthrax rapid indication. RJOAS. 2016;(2):5-15 (In Russ.). https://doi.org/10.18551/rjoas.2016-02.01
8. Саяпина ЛВ, Абдрашитова AC, Лобач PH, Комратов AB, Малахаева АН, Лешова ОЮ и др. Диагностическая эффективность иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных адсорбированных по данным медицинских испытаний. Проблемы особо опасных инфекций. 2012;(4):92-6. Sayapina LV, Abdrashitova AS, Lobach RN, Komratov AV, Malakhaeva AN, Leshova OYu, et al. Diagnostic efficiency
Лобач РН. Диагностическая ценность сибиреязвенных иммуноглобулинов и бактериофага гамма а-26 при выявлении и идентификации возбудителя сибирской язвы: автореф. дис.... канд. мед. наук. М.; 2014.
of adsorbed anthrax vegetative fluorescent immunoglobulins demonstrated in the medical trials. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2012;(4):92-6 (In Russ.). EDN:PMDKYF
9. Лобач PH, Саяпина ЛВ, Абдрашитова AC, Ляшова ОЮ, Валова ТВ, Храмов MB и др. К вопросу об индикации возбудителя сибирской язвы иммуноглобулинами флуоресцирующими сибиреязвенными споровыми адсорбированными. Жизнь без опасностей. Здоровье. Профилактика. Долголетие. 2013;8(2):46-51.
Lobach RN, Sayapina LV, Abdrashitova AS, Lyashova OY, Valova TV, Khramov MV, et al. To the question of anthrax indication by fluorescenting anthracicabsorbing sporous immunoglobulines. Life without Dangers. Health. Prevention. Longevity. 2013;8(2):46-51 (In Russ.). EDN: OJBWOH
10. Касина ИВ, Алексеева CA, Немировская ТИ. Оценка возможности применения иммунохроматографического метода для экспертизы качества вакцины чумной живой и аллергена туляремийного (Тулярина) по показателю «Подлинность». БИОпрепараты. Профилактика,
диагностика, лечение. 2023;23(2):231-40. Kasina IV, Alekseeva SA, Nemirovskaya Tl. Evaluation of the applicability of immunochromatography to the identification of live plague vaccines and the tularaemia allergen (Tularin). Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2023;23(2):231-40 (In Russ.). https://doi.org/10.30895/2221-996X-2023-23-2-231-240
11. Маринин ЛИ, Дятлов ИА, Шишкова НА, Герасимов ВН. Сибиреязвенные скотомогильники: проблемы и решения. М.: Династия; 2017.
Marinin LI, Dyatlov IA, Shishkova NA, Gerasimov VN. Anthrax cattle burials: problems and solutions. Moscow: Di-nastiya; 2017 (In Russ.). EDN:VVYZNL
12. Селянинов ЮО, Егорова ИЮ. Об ошибках при индикации и идентификации В. anthracis. Ветеринария. 2008;(10):30-3.
Selyaninov YuO, Egorova IYu. On some diagnostic mistakes as occurred at B. anthracis indication and identification. Veterinary. 2008;(10):30-3 (In Russ.). EDN: JWCYLB
Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям 1СМ.1Е. Наибольший вклад распределен следующим образом: С.А. Алексеева - выполнение экспериментальных исследований по определению показателя качества «Подлинность» вакцины сибиреязвенной живой, обобщение экспериментальных данных, анализ и интерпретация результатов, написание и критический пересмотр текста рукописи; И.В. Касина - формирование цели и задач исследования, выполнение экспериментальных исследований по определению показателя качества «Подлинность» вакцины сибиреязвенной живой; обобщение экспериментальных данных, анализ и интерпретация результатов исследования, написание текста рукописи; Т.И. Немировская - общее руководство, критический пересмотр текста рукописи и утверждение окончательной версии статьидля публикации.
Authors' contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. S.A. Alekseeva conducted identification experiments with the live plague vaccine, summarised the experimental data, analysed and interpreted the study results, and drafted and critically revised the manuscript. I.V. Kasina formulated the study aim and objectives, conducted identification experiments with the live plague vaccine, summarised the experimental data, analysed and interpreted the study results, and drafted the manuscript. T.I. Nemirovskaya provided general supervision of the research project, critically revised the manuscript, and approved the final version of the manuscript for publication.
Об авторах / Authors
Алексеева Светлана Александровна, канд. биол. наук / Svetlana A. Alekseeva, Cand. Sei. (Biol.) ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5804-57Q9
Касина Ирина Владимировна, канд. биол. наук / Irina V. Kasina, Cand. Sei. (Biol.) ORCID: https://orcid.org/0000-00Q5-5287-2651
Немировская Татьяна Ивановна, канд. мед. наук/Tatiana I. Nemirovskaya, Cand. Sei. (Med.) ORCID: https://orcid.org/0000-0002-0848-75Q6
Поступила 10.06.2024 Received 10 June 2024
После доработки 12.08.2024 Revised 12 August 2024
Принята к публикации 12.09.2024 Accepted 12 September 2024
