CC BY
41
Общая биология
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 2 (3), с. 169-173
УДК 57.063.7
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ГЕНА 18S рРНК ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РАЗНЫХ ЭКОБИОМОРФ РОДА VERONICA L. (SCROPHULARIACEAE)
© 2012 г. В.А. Пантюхина 1, Д.В. Новиков 2 Н.П. Савиных 1, В.В. Новиков 1,2
1 Вятский государственный гуманитарный университет, г. Киров 2 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
Pantyuhina_Vera@mail. ru
Поступила в редакцию 15.03.2012
Для многих представителей водной и наземной экобиоморфы Veronica L. из секции Beccabunga известно большое сходство в морфологии и числе хромосом. В то же время описаны значительные различия в ареале и типе жизненной формы. В настоящей работе с использованием гербарного и живого материала определена первичная структура гена 18S рРНК у представителей V. anagallis-aquatica L., V. cmagalloides и V. tenuis. На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей высказано предположение о гибридном происхождении однолетников V. tenuis и V. cnagalloides от многолетников. Также проведено сравнение двух методов выделения ДНК в зависимости от качества сохранности исследуемого материала.
Ключевые слова: экобиоморфа Veronica L., поливариантность, гибриды, ген 18S рРНК ITS.
Введение
Многим вероникам (Veronica L.), в том числе видам из секции Beccabunga, свойственна поливариантность развития. Они существуют в природе в виде разных экобиоморф и жизненных форм однолетних растений: типичных монокар-пиков и однолетников вегетативного происхождения [1, 2]. В наземных популяциях V. anagallis-aquatica L. выделены несколько самостоятельных однолетних видов - V. anagalloides (Guss.) A. Jelen. [3], V. heureca (M.A. Fischer) Tzvel., V. tenuis Ledeb., V. poljensis Murb. (Клинкова, 1993), отличающихся по ряду морфологических признаков: опушение разных частей растений, форма коробочек, строение околоцветника, листьев. Единого мнения о самостоятельности этих видов нет [4]. В то же время при значительных различиях в ареале и типе жизненной формы известно большое сходство в морфологии и числе хромосом у V. beccabunga L. и V. peregrine. Высказана гипотеза о возможной гигрофильной линии возникновения однолетних вероник секции Beccabunga [1, 2]. В связи с этим актуальны сравнение и идентификация новых видов однолетников из группы V. anagallis-aquatica L. с использованием не только морфологического и географического методов, но и молекулярно-генетического анализа генома растений.
Эволюция организмов обусловлена, главным образом, изменениями генотипа, кото-
рые определяют выбор одной из программ развития и не имеют плейотропного эффекта. К сожалению, это подтверждают данные только о генеративной сфере растений. Данных о вегетативной сфере существует очень немного, и они все свидетельствуют о том, что в результате мутации одного или нескольких генов могут происходить существенные изменения габитуса растения [5]. Интерес исследователей к генам, кодирующим рРНК, обусловлен функциональной важностью этого участка генома, а также присутствием в ней эволюционно лабильных и консервативных областей в пределах одного повторяющегося участка, которые делают эти участки нуклеотидной последовательности удобным инструментом для изучения молекулярной эволюции растений.
Цель данной работы - идентификация особей водной и наземной экобиоморфы представителей рода Veronica с помощью молекулярно-генетических методов.
В ходе работы мы попытались решить следующие задачи: установление степени генетического родства отдельных представителей, сравнение двух методов выделения ДНК с целью поиска оптимального, исходя из степени сохранности материала.
В настоящей работе с использованием молекулярно-биологических методов определены нуклеотидные последовательности гена, коди-
рующего 18S РНК представителей V. anagallis-aquatica, V. anagalloides, V. tenuis, произрастающих на территории РФ. Сравнительный анализ первичных структур гена 18S РНК представителей рода вероника, произрастающих на разных территориях, показал генетическую неоднородность как между видами, так и внутри одного вида.
Экспериментальная часть
Материалом для исследования послужили личные сборы и гербарные образцы. Сбор материала для молекулярно-генетического исследования и морфологического описания производился в Кировской области (песчаные отмели р. Сандаловка, р. Прорва, р. Вятка, р. Пагинка, Заречный парк г. Кирова,), Нижегородской области (р. Ока, р. Волга, окрестности г. Бор, пос. Старая Пустынь), Волгоградской области, Ярославской области (окрестности пос. Борок). Морфологическое описание растений производилось в гербариях Вятского государственного гуманитарного университета, Нижегородского госуниверситета им. Н.И. Лобачевского, гербария И.Л. Мининзона (Нижний Новгород), отдела природы Кировского областного краеведческого музея, Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН (Санкт-Петербург), стационара Института экологии растений и животных РАН (г. Лабытнанги). После этого определяли виды по справочникам [6].
Материал для молекулярно-генетического исследования собирали в период цветения и плодоношения растений. Растения помещали в речную воду для транспортировки, чтобы избежать высыхания. Листья промывали сначала мыльным раствором, затем слабым раствором марганцовки и дистиллированной водой. Кусочек листа растений приблизительно 2 см2 помещали в пробирку и замораживали при минус 80°С. После криообработки проводили выделение ДНК. К исследуемому образцу добавляли 400 мкл лизирующего буфера (250 мМ Tris pH 8, 250 мМ NaCl, 0.5% SDS, 50 мМ EDTA) и измельчали растиранием. Затем инкубировали 60-80 минут при +65°С, периодически аккуратно взбалтывая. Добавляли 200 мкл 3 М ацетата Na, перемешивали и инкубировали при -20°С в течение 20 мин. После инкубации центрифугировали 15 мин при 14000 g. Супернатант отбирали в чистую пробирку, добавляли равный объем смеси фенол-хлороформ (1:1) и центрифугировали 15 мин при 14000 g. Супернатант вновь отбирали в чистую пробирку и добавляли 2.5 объема 96%-ного этилового спирта. После
этого инкубировали в течение 20 мин при -20°С и центрифугировали 15 мин при 14000 g. Удаляли супернатант, осадок высушивали на воздухе и растворяли в дистиллированной воде. Метод выделения ДНК из растений с использованием СТАВ-реагента описан ранее [7].
Полученный раствор ДНК использовали в полимеразной цепной реакции (ПЦР) для наработки фрагмента ДНК, кодирующего18S рРНК. Реакцию проводили в объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала ПЦР буфер (100 мМ Tris-HCl pH 8.9; 500 мМ KCl, 15 мМ MgCl2),
0.2 мМ дНТФ, по 0.4 мМ прямого ITSF (TCgTAACAAggTTTCCgTAggTg) и обратного ITSR (TCCTCCgCTTATTATTgATATgC) праймеров. Проводили 30 циклов амплификации по следующей программе: 94°С - 30 сек, 55°С -30 сек, 72°С - 45 сек. Полученные в ходе проведения ПЦР результаты оценивали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле, содержащем бромид этидия.
Фрагменты кДНК вырезали из агарозного геля и очищали с использованием коммерческого набора DNA Extraction Kit (Fermentas, Латвия) согласно рекомендациям производителя.
Определение нуклеотидной последовательности проводили с помощью реакции терминирования. Реакцию терминирования выполняли с использованием набора BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit (США). К 5 мкл очищенной ДНК добавляли 1 мкл BigDye Terminator, 2 мкл буфера и 0.5 мкл праймера, инкубировали при 94°С в течение 5 мин и проводили 25 циклов ПЦР по следующей программе: 94°С - 10 сек, 50°С - 10 сек, 62° - 4 сек. Полученную ДНК очищали от несвязавшейся метки с использованием изопропанола, разводили в 20 мкл деионизованного формамида и прогревали в кипящей водяной бане. Проводили электрофорез одноцепочечной ДНК в приборе ABI Prizm 3130 Genetic Analyzer (США). Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием пакета компьютерных программ DNASTAR.
Результаты и их обсуждение
Систематика вероник из родства Veronica anagallis-aquatica L. s. l., как и многих других влаголюбивых видов, существенно осложняется в связи с многочисленностью экологических форм, обитающих в разных условиях увлажнения. Почти все признаки вегетативной сферы изменяются в широких пределах, создавая видимость непрерывного ряда, который связывает большинство известных видов группы. В про-
цессе поиска признаков, пригодных для таксономических целей, использованы строение и распределение волосков на вегетативных и генеративных органах [3]. С точки зрения морфологии растений использование характера опушения значительно упрощает идентификацию многих сомнительных образцов.
Одноклеточные железистые волоски характерны для V. anagalloides, V. heureca и кавказских популяций V. tenuis, европейских и азиатских образцов V. tenuis. У V. poljensis наблюдаются многоклеточные волоски с большим количеством члеников. V. anagallis-aquatica отличается редкими волосками только на оси соцветия и цветоножках.
После определения видовой принадлежности из исследуемого материала выделяли нуклеиновую кислоту. Проведено сравнение двух методов выделения, основанных на использовании доде-цилсульфата натрия и реагента СТАБ (цети-лтриметиламмонийбромида). Установлено, что при использовании додецилсульфата натрия амплификация ДНК гена, кодирующего 18S рРНК, наблюдалась в образцах свежих листьев, а при использовании СТАБ-метода - в гербарных образцах. Таким образом, с использованием двух методов выделения хромосомной ДНК из листьев растений были наработаны фрагменты ДНК гена, кодирующего 18S рРНК представителей V. anagalloides, V. anagallis-aquatica L. , собранных летом 2011 г., и фрагменты гена 18S рРНК представителей V. tenuis из гербарного материала, собранного в 1968 году. На рис. 1 представлена амплификация ДНК гена 18S рРНК.
1 2 3 4 5 б 7 S
ДНК гена ISSpPHX
Рис. 1. Электрофореграмма амплифицированного фрагмента гена 1BS рРНК: l, l - V. Anagalloides; 2, б, В - V. anagallis-aquatica; З - V. Beccabunga; 4, З -V. tenuis
Для каждого из исследуемых растений были определены участки нуклеотидной последовательности гена, кодирующего 1BS рРНК, размером приблизительно 1B7-29B нуклеотидных оснований с 5' и 3' конца каждого из фрагментов.
Нуклеотидные последовательности использовали для сравнения между собой и с первичными структурами гена 1BS рРНК других представителей семейства Vemnica, доступными в
базе данных NCBI. Установлено, что для представителей видов V. anagalloides и V. tenuis в базе данных NCBI отсутствуют нуклеотидные последовательности исследуемого гена. Это позволяет утверждать, что первичная структура гена, кодирующего 1BS рРНК для V. anagal-loides и V. tenuis, определена впервые.
Сравнение определенных нами нуклеотидных последовательностей между собой показало, что наибольшим сходством обладали первичные структуры гена, кодирующего 1BS рРНК у V. tenuis (RU) и V. anagallis-aquatica (RU), которое составило 96.O%. Сходство первичных структур гена, кодирующего 1B S рРНК, между представителями рода Vemnica варьировало от lO.B до 967%. Интересно отметить, что у представителей одного вида V. anagallis-aquatica, произрастающих на территории Нижегородской области и островах Новой Зеландии, сходство первичной структуры гена, кодирующего l8S рРНК, составило 90.l%. Данное наблюдение свидетельствует о внутривидовой изменчивости нуклеотидных последовательностей генома, вероятно вызванной произрастанием в изолированных друг от друга условиях.
На рис. 2 представлена полученная с использованием компьютерной программы MegAlign дендрограмма сходства нуклеотидных последовательностей гена, кодирующего 1BS рРНК. Как видно из рисунка, V. anagallis-aquatica (RU), V. anagalloides (RU) и V. tenuis (RU) образовывали единый кластер с представителями видов V. heureca (Austria), V. beccabunga (Turkey) и V. peregrina (Austria), минимальное сходство между представителями которого составляло 88.8%. Полученные данные указывают на генетическое родство представителей секции Beccabunga и свидетельствуют о происхождении этих видов от одного предшественника. Расположение видов в едином кластере с представителем, произрастающим на территории Новой Зеландии, позволяет утверждать, что формирование секции Beccabunga произошло до отделения островов от континентальной части Евразии. Данное наблюдение подтверждает выводы А.Г. Еленевского [В], который на основе анализа морфологии и эволюции пришел к выводу о древнем происхождении секции Bec-cabunga в южно-азиатской части континента.
В нашем исследовании максимальное сходство нуклеотидных последовательностей гена, кодирующего 1BS рРНК, наблюдалось между V. tenuis и V. anagallis-aquatica (96.1%) и V. anagalloides и V. beccabunga (96.2%). В то же время максимальное сходство нуклеотидных последовательностей между другими видами не
—\ V. heurica Austria
V. anagallis-aquatica New Zelan V. anagalloides Ru
V. beccabunga Turkey V. peregrina Austria
V. tenuis
V. anagallis aquatica RU
_|~ V. alpina Austria
Paederota bonarota
V. officinalis Turkey
V . cymbalaria Austria
V. trichadena Austria
V. lanuginosa Austria V. thessalica Balkan
12.
Synthyris bullii
8 6 Nucleotide Substitutions (x100)
1
1
2
Рис. 2. Дендрограмма сходства нуклеотидных последовательностей участка гена, кодирующего 18S рРНК представителей семейства Veronica
превышало 80.0%. На дендрограмме сходства нуклеотидных последовательностей видно, что как V. tenuis и V. anagallis-aquatica, так и V. anagalloides и V. beccabunga образуют между собой отдельные близкородственные пары. По-видимому, обнаруженные различия в нуклеотидных последовательностях этих пар связаны с различными ареалами. Представленные данные свидетельствуют скорее в пользу гибридного происхождения V. tenuis и V. anagalloides от многолетников, чем о самостоятельности данных видов. Однако для окончательного заключения необходимо сравнение первичных структур генов пластид, которые передаются исключительно по материнской линии.
Выводы
Установлено, что при использовании доде-цилсульфата натрия амплификация ДНК гена, кодирующего 18S рРНК, наблюдалась в образцах свежих листьев, а при использовании СТАБ-метода - в гербарных образцах.
Представленные данные свидетельствуют скорее в пользу гибридного происхождения V. tenuis и V. anagalloides от многолетников, чем о самостоятельности данных видов.
Полученные данные указывают на генетическое родство представителей секции Beccabun-ga и свидетельствуют о происхождении этих видов от одного предшественника.
Расположение видов в едином кластере с представителем, произрастающим на террито-
рии Новой Зеландии, позволяет утверждать, что формирование секции Beccabunga произошло до отделения островов от континентальной части Евразии.
Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009—2012 гг.».
Список литературы
1. Цвелев Н.Н. О двух новых для европейской части СССР видах из родов Melandrium (Caryophyl-laceae) и Veronica (Scrophulariaceae) // Бот. журн. 1984. Т. 69. № 9. С. 1255-1260.
2. Савиных Н.П. Род вероника: морфология и эволюция жизненных форм. Киров: Изд-во ВятГГУ, 2006. 324 с.
3. Клинкова Г.Ю. Заметки о систематике вероник секции Beccabunga (Hill) Griseb. (Veronica, Scrophulariaceae) Нижнего Поволжья // Бюл. МОИП. Отд. биол. 1993. Т. 98. Вып. 4. С. 112-119.
4. Еленевский А.Г. Систематика и география вероник СССР и прилежащих стран. М.: Наука, 1978. 259 с.
5. Жмылев П.Ю. Эволюция жизненных форм растений: суждения и предположения // Журн. общей биологии. 2004. № 3. С. 232-249.
6. Moore D.M. Flora Europaea. Cambridge University Pres, 1964. 301 p.
7. Doyle J.J., Doyle J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue // Focus. 1990. V. 12. P. 13-15.
8. Еленевский А.Г. Заметка о Veronica austriaca L. и о некоторых близких видах // Новости систематики высших растений. 1974. Т. 11. С. 272-276.
A COMPARATIVE ANALYSIS OF THE PRIMARY STRUCTURE OF THE 18S rRNA GENE OF DIFFERENT ECOBIOMORPH REPRESENTATIVES OF THE GENUS VERONICA L. (SCROPHULARIACEAE)
V.A. Pantyukhina, Д. V. Novikov, N.P. Savinykh, V. V. Novikov
The great similarity in the chromosome number and morphology is known for many representatives of water and land ecobiomorph Veronica L. from the section Beccabunga. At the same time considerable distinctions have been described in the natural habitats and vital forms. In this work the primary structure of the 18S rRNA gene in representatives of V. anagallis-aquatica L., V. аnagalloides and V. tenuis has been defined using herbarium and a live material. On the basis of the comparative analysis of nucleotide sequences, an assumption has been made about a hybrid origin of V. tenuis and V. аnagalloides annuals from perennials. A comparison has also been made of two methods of DNA extraction as dependent on the preservation quality of the material studied.
Keywords: ecobiomorph Veronica L., polyvariantness, hybrids, gene 18S rRNA ITS.
