CC BY
1818. Sambri V., Aldini R., Massaria F. et al. Uptake and killing of Lyme disease and relapsing fever borreliae in the perfused rat liver and by isolated Kupffer cells. Infect. Immun. 1996, 64 (5): 1858-1861.
19. Sarksyan D.S., Platonov A.E., Karan L.S. et al. Probability of spirochete Borrelia miyamotoi transmission from ticks to humans. Emerg. Infect. Dis. 2015, 21 (12): 2273-2274.
20. Suhonen J., Hartiala K., Tuominen-Gustafsson H., Viljanen M.K. Borrelia burgdorferi-induced oxidative burst, calcium mobilization, and phagocytosis of human neutrophils are complement dependent. J. Infect. Dis. 2000, 181 (1): 195-202.
21. Wagemakers A., Koetsveld J., Narasimhan S. et al. Variable major proteins as targets for specific antibodies against Borrelia miyamotoi. J. Immunol. 2016, 196 (10): 4185-4195.
22. Woodman M.E., Cooley A.E., Avdiushko R. et al. Roles for phagocytic cells and complement in controlling relapsing fever infection. J. Leukoc. Biol. 2009, 86 (3): 727-736.
Поступила 31.08.17
Контактная информация: Платонов Александр Евгеньевич, д.б.н., проф.,
111123, Москва, ул. Новогиреевская, 3а, р.т. (495) 974-96-46
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
Е.А.Прокопьева1'2, К.А.Шаршов1, А.А.Романовская3, И.А.Соболев1, О.Г.Курская1, Е.И.Соловьева1'2, Л.В.Шестопалова2, А.В.Зайковская4, А.Ю.Алексеев1, А.М.Шестопалов1
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПАТОГЕННОСТИ ВИРУСОВ ГРИППА А(ШШ) И A(H1N1)pdm09 У ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ
1НИИ экспериментальной и клинической медицины, Новосибирск; 2Новосибирский национальный исследовательский государственный университет; 3Университет Хельсинки, Финляндия; 4ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», Новосибирск
Цель. Проведено экспериментальное инфицирование лабораторных мышей линии BALB/c высокопатогенным вирусом гриппа птиц A(H5N1) и пандемическим вирусом гриппа A(H1N1)pdm09, адаптированного к мышам, с целью сравнения степени патоген-ности вновь возникших штаммов вируса гриппа с пандемическим потенциалом. Материалы и методы. Первую группу мышей линии BALB/c (п=24) инфицировали высокопатогенным вирусом гриппа A(H5N1) в дозе 5 ЛД50, а вторую группу (п=24) инфицировали адаптированным вариантом пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm09 в дозе 5 ЛД50. Определение ЛД50 и ТСГО50 выполняли с помощью вирусологических методов. Морфологические изменения во внутренних органах (легкое, головной мозг, печень, почка, селезенка) исследовали методами световой и трансмиссионной электронной микроскопии. Результаты. Вирусологический анализ показал, что оба штамма являются высоко летальными для мышей. Микроскопическое исследование выявило развитие интерстициальной пневмонии в легких и генерализацию инфекции по внутренним органам. Заключение. Обнаружено развитие высоко летального заболевания в виде респираторной пневмонии у обеих групп экспериментально инфицированных мышей линии BALB/c как под воздействием высокопатогенного вируса гриппа птиц A(H5N1), так и адаптированного пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm09. При этом отмечается различный механизм развития патологического процесса: под воздействием адаптированного варианта вируса гриппа A(H1N1)pdm09 сперва развивается бронхит, который быстро усугубляется развитием альвеолита, в то время как под воздействием высокопатогенного вируса гриппа птиц A(H5N1) сразу же развивается альвеолит. На 6 сутки после инфицирования регистрируется развитие генерализованной инфекции у мышей обеих экспериментальных групп.
Журн. микробиол., 2018, № 2, С. 38—44
Ключевые слова: адаптированный вирус гриппа А(H1N1)pdm09, A(H5N1), генерализованная инфекция
E.A.Prokopeva1'2, K.A.Sharshov1, A.A.Romanovskaya3, I.A.Sobolev1, O.G.Kurskaya1, E.I.Soloveva1,2, L.V.Shestopalova2, A.V.Zaykovskaya4, A.Yu.Alekseev1, A.M.Shestopalov1
COMPARATIVE ANALYSIS OF PATHOGENICITY OF INFLUENZA A(H5N1) AND A(H1N1)pdm09 VIRUSES IN MICE
1Research Institute of Experimental and Clinical Medicine, Novosibirsk; 2National Research State University, Novosibirsk; 3 University of Helsinki, Finland; 4State Scientific Centre of Virology and Biotechnology «Vector», Novosibirsk, Russia
Aim. Compare the degree of pathogenicity of newly emerging influenza virus strains with pandemic potential by experimental infection of BALB/c mice with highly pathogenic avian influenza A(H5N1) virus and mouse adapted pandemic influenza A(H1N1)pdm09 virus. Materials and methods. The first group of BALB/c mice (n=24) were infected with highly pathogenic avian influenza A(H5N1) virus in a dose of 5 LD50, and the second group (n=24) were infected with mouse adapted pandemic influenza A(H1N1)pdm09 virus at a dose of 5 LD50. Determination of LD50 and TCID50 were performed by virological methods. Morphological changes in internal organs (lung, brain, liver, kidney, spleen) were examined by light and transmission electron microscopy. Results. Virologic analysis showed that both strains are highly lethal for mice. Microscopic examination revealed the development of interstitial pneumonia in the lungs and generalization of infection in the internal organs. Conclusion. In both groups of BALB/c mice experimentally infected with highly pathogenic avian influenza A(H5N1) and mouse adapted pandemic influenza A(H1N1)pdm09 virus were revealed the development of a highly lethal disease in the form of respiratory pneumonia. It is noted, different mechanisms of pathological process: in case of infection with mouse adapted pandemic influenza A(H1N1)pdm09 virus firstly developed bronchitis, which quickly exacerbated by the development of alveolitis, while in case of infection with highly pathogenic avian influenza A(H5N1) immediately developed alveolitis. On the 6th day after infection recorded the development of generalized infection in mice of both experimental groups.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2018, No. 2, P. 38-44
Key words: mouse-adapted influenza virus A(H1N1)pdm09, A(H5N1), generalized infection
ВВЕДЕНИ Е
Вновь возникшие вирусы гриппа — высокопатогенный А(Н5Ш) и пандемический А(Н1Ш)рёт09 — относительно недавно продемонстрировали значительную угрозу здоровью населения во многих странах мира. Благодаря появлению вируса гриппа А(НШ1)рёт09 в 2009 году мир стал свидетелем пандемичной инфекции XXI века, которая быстро распространилась по всему Земному шару и поразила сотни тысяч людей [10]. Вирус гриппа А(Н1Ш) рёт09 обладал высокой степенью трансмиссии, но относительно низкими вирулентными и летальными свойства по сравнению с вирусом гриппа А(Н5Ш). Уровень смертности от высокопатогенного вируса гриппа А(Н5Ш) составляет более 60%. Он способен вызывать тяжелые повреждения респираторной системы человека, однако не способен эффективно передаваться от человека к человеку [КоЛеуе£ С., Gu J., 2010]. В настоящее время существует опасение, что если высокопатогенный вирус гриппа птиц А(Н5Ш) приобретет способность эффективно передаваться от человека к человеку подобно пандемическому вирусу гриппа А(НШ1)рёт09 и при этом сохранит свои высоковирулентные свойства, то, возможно, новый реассортант будет оказывать весьма значительный эффект на здоровье населения планеты. Между данными субтипами вируса гриппа А при тяжелых случаях заболевания реги-
стрируют сходные симптомы в клинической картине [Korteveg C., Gu J., 2010]. Известно также, что при тяжелой гипертоксической форме гриппа, вызванной субтипом A(H5N1), наблюдается высокая виремия, обусловленная распространением вирионов по кровеносному руслу с последующим инфицированием различных органов (головной мозг, селезенка, тимус, кишечник, миокард, печень, почки, надпочечники и др.) [3]. По литературным данным, виремия вируса гриппа A(H1N1)pdm09 в такие органы, как головной мозг, селезенка, а также в кровь возможна только под воздействием адаптированных вариантов патогена [9].
Возникновение новых штаммов вируса гриппа А будет по-прежнему создавать проблемы для общественного здравоохранения. Детальное понимание механизмов, определяющих патогенность и межвидовую трансмиссию, имеет важное значение как для прогноза появления новых вирусов, так и для создания эффективных средств и способов профилактики и лечебных мероприятий, что необходимо для контроля над высокопатогенными и пандемич-ными инфекциями.
Цель работы — сравнительное исследование степени патогенности вируса гриппа птиц A(H5N1) (A/goose/Krasnozerskoye/627/05) и пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm09 (штамм A/Russia/01/2009-МА, адаптированный к мышам) по характеру патологических изменений во внутренних органах и летальности в острый период при экспериментальном инфицировании мышей линии BALB/с.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проведены на мышах линий BALB/с 6 — 7-недельного возраста массой тела 20 — 25 г. Животные были разделены на 3 группы. Первую группу животных (n=24) инфицировали вирусом гриппа A(H5N1) штаммом A/goose/Krasnoozerskoye /627/05 (GenBank EF205206.1, EF205199.1, EF205192.1, EF205157.1, EF205178.1, EF205171.1, EF205164.1, и EF205185.1) в дозе 5 ЛД50 в объеме 50 мкл инфицирующей жидкости. Вторую группу животных (n=24) инфицировали вирусом гриппа A(H1N1)pdm09 штаммом A/Russia/01/2009-MA, адаптированным к мышам(GenBank HQ661364 — HQ661371) [2]) в дозе 5 ЛД50 в объёме 50 мкл инфицирующей жидкости. Третья группа служила контролем и была представлена 3 интактными мышами, которые интрана-зально получали фосфатно-солевой буфер (ФСБ) (pH 7.2) в объёме 50 мкл. Животных содержали в стандартных условиях. Ежедневно определяли вес животных.
На 1, 3, 6 и 10 сутки после заражения животных выводили из эксперимента путём дислокации шейных позвонков. Быстро извлеченные внутренние органы (лёгкое, головной мозг, печень, почка, селезёнка) фиксировали в 4 % растворе формалина, затем обезвоживали по стандартной методике и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 4 — 5 мкм получали с помощью ротационного микротома HM 340E (Carl Zeiss, Германия), окрашивали гематоксилином и эозином. Светооптическое исследование и микрофотосъемку проводили на микроскопе Axioskop 40 (Carl Zeiss, Германия).
Для проведения исследования с помощью трансмиссионной электронной микроскопии были взяты образцы лёгких на 1, 3 сутки после заражения животных, которые фиксировались в 2,5% растворе глютарового альдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 4 ч при температуре 4°С, дофиксирова-ли в 1% растворе четырёхокиси осмия, обезвоживали в спирте возрастающей концентрации (50°, 70°, 96°, абсолютный), смеси спирта и ацетона и заверша-
ли проводку в ацетоне. Образцы лёгких заливали в смесь аральдита-эпона (1:6) с добавлением катализатора DMP-30 и полимеризовали их при 60°С. Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме UC-6 (Leica, Германия), контрастировали насыщенным раствором уранилацетата и раствором Рейнгольдса. Образцы исследовали под электронным микроскопом Libra 120 (Carl Zeiss, Германия) при ускоряющем напряжении 120 кВт.
Определение наличия вируса гриппа А субтипа A(H5N1) и субтипа A(H1N1) pdm09 в лёгких проводили путём инфицирования культуры клеток MDCK. Значение 50% тканевой цитопатической инфекционной дозы (TCID50) рассчитывали по методу Рида-Менча и выражали как среднее lgTCID50 ± SE
[9].
Все работы с животными проводили в соответствии с протоколом исследования, утверждённым биоэтическим комитетом «Вектор» в условиях вивария ГНЦ ВБ «Вектор» с уровнем биологической безопасности BSL2.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Клинические признаки заболевания гриппом у мышей линий BALB/с, инфицированных высокопатогенным вирусом гриппа птиц штаммом A/goose/ Krasnozerskoye/627/05, а также у мышей, инфицированных адаптированным вариантом пандемического вируса гриппа штаммом A/Russia/01/2009-MA, были отмечены уже в 1 сутки и проявлялись конъюнктивитами, снижением физической активности, снижением массы тела, ухудшением качества шерсти, одышкой, а на 10 сутки в обеих экспериментальных группах летальность составляла 50%. Результаты вирусологического анализа показали, что у мышей первой экспериментальной группы наибольший титр вируса в лёгком отмечали с 3 по 10 сутки, а во второй группе — с 1 по 6 сутки после инфицирования (рис. 1).
Морфологическое исследование лёгких мышей выявило в 1 сутки полнокровие капилляров в обеих группах, однако увеличение секреции муцин-продуцирующих клеток бронхиального эпителия отмечали только под воздействием штамма A/Russia/01/2009-MA. С 3 по 6 сутки в обеих группах отмечали десквамацию эпителия средних и мелких бронхов, активную трансэпителиальную миграцию лимфоцитов, активированных макрофагов, а также гранулоцитоз, гемолиз эритроцитов в мелких кровеносных сосудах, встречались явления микротромбоза и обнаруживались признаки ДВС-синдрома (резкое полнокровие, сосудистый отёк, кровоизлияния в альвеолы, образование фибриновых масс и геморрагии). В первой группе животных отмечали эхи-ноцитоз эритроцитов, а во второй — сладж эритроцитов. К концу первой недели наблюдений в обеих группах отмечали развитие интерстициальной пневмонии, которая к 10 суткам приобретала характер многоочаговости.
7-,
Дни после инфицирования A(H5N1) gg A(H1N1)pdm09-MA
Рис. 1. Величина титров вируса в лёгких мышей, инфицированных высокопатогенным вирусом гриппа A(H5N1) и адаптированным вариантом пандемического вируса гриппа A(HlN1) pdm09.
Рис. 2. Изменения ультраструктур клеток лёгких мышей линии BALB/c, инфицированных вирусом гриппа А(Н5Ш).
Примечание: А — на 1 сутки видны глыбки гетерохроматина на периферии ядра (стрелка) (ПА
— полость альвеолы; Я — ядро); Б — на 3 сутки отмечается вакуолизация клетки альвеолярного эпителия (стрелка). Бар соответстует 1 мкм.
Трансмиссионная электронная микроскопия позволила визуализировать отшнуровку вирусных частиц с поверхности альвеолоцитов 1 типа с первых суток после инфицирования (рис. 2А, 3А). На третьи сутки в лёгких мышей обоих групп деструктивный процесс усугублялся: наблюдалось хлопьевидное содержимое в альвеолярных мешках (рис. 2Б, 3Б).
Светооптическое исследование внутренних органов мышей обеих групп выявило следующие патологические изменения: в головном мозге — нейро-нальную дегенерацию, очаговые некрозы, кровоизлияния и отеки кровеносных сосудов; в печени — гиперемию центральных и воротных вен; в почках
— умеренную гиперемию; в селезёнке — гиперемию и экссудацию белков плазмы крови.
ОБСУЖДЕНИ Е
Известно, что высокопатогенный вирус гриппа птиц А(ШШ) способен вызывать тяжёлую гриппозную инфекцию у экспериментальных мышей линии BALB/c без предварительной адаптации, в то время как пандемическому вирусу гриппа A(H1N1)pdm09 для увеличения патогенных свойств требуется
Рис. 3. Изменения ультраструктур клеток лёгких мышей линии BALB/c, инфицированных адаптированным вариантом вируса гриппа А(НШ1)р^09.
Примечание: А — на 1 сутки отмечали отпочковывание вирионов с поверхности альвеолоцитов (ПА — полость альвеолы; Я — ядро); Б — на 3 сутки отмечали клеточный детрит в альвеолярной полости, дистрофию альвеолярного эпителия. Бар соответстует 1 мкм.
предварительная адаптация путём пассирования в лёгких экспериментальных животных [2, 11, 12].
Наблюдаемые различия на 1 сутки в лёгких экспериментально инфицированных мышей в виде гиперсекреции муцин-продуцирующих клеток бронхиального эпителия, вероятно, связаны с высоким титром штамма А/ Russia/01/2009-МА именно на начальном этапе воспаления, а также с большей тропностью пандемического вируса А(Н1Ш)рёт09 к бронхиальному эпителию [6, 7]. В период с 3 по 6 сутки было выявлено сходство в развитии патологического процесса на ультраструктурном уровне в лёгких обеих исследуемых групп животных: зарегистрированы деструктивные процессы не только в альвеолоцитах 1 типа, но также и в альвеолоцитах 2 типа. По последним данным, птичий тип рецепторов (SAa2,3Gal) регистрируют в нижних отделах дыхательных путей респираторной ткани — преимущественно на альвеоло-цитах 2 типа [13]. Вероятно, за счёт такого распределения рецепторов высокопатогенный вирус гриппа птиц А(Н5Ш), который преимущественно распознает SAa2,3Gal рецепторы [8], в первую очередь, инфицирует альвеолоциты 2 типа и макрофаги лёгких, а пандемичный вирус гриппа А(Н1Ш)рёт09 преимущественно распознает человеческий тип (SAa2,6Gal) рецепторов и чаще вызывает воспаление верхних дыхательных путей [4, 13]. В нашей работе было отмечено, что в случае инфицирования адаптированным вариантом пандемического вируса гриппа А(НШ1)рёт09 также регистрируются деструктивные процессы в альвеолоцитах 2 типа, что, в свою очередь, говорит о возможном увеличении патогенных свойств у данного субтипа вируса гриппа во время адаптации к мышам за счёт увеличения сродства к SAa2,3Gal рецепторам.
Явления микротромбозов, зарегистрированных в обеих экспериментальных группах, к 6 суткам, возможно, сопряжены с повреждающим воздействием вирусов гриппа на эндотелий сосудов лёгких, что наиболее часто встречается при инфицировании высокопатогенным вирусом гриппа А(Н5Ш) [1], а также за счёт изменения реологических свойств крови, проявляющихся в виде сладжа эритроцитов и эхиноцитоза.
При сравнительном анализе структурных изменений во внутренних органах экспериментально инфицированных мышей были обнаружены патологические изменения не только в мозге и в селезенке, как это было описано в литературе ранее [6], но также в печени и почках, что, вероятно, объясняется развитием генерализованной инфекции под воздействием адаптированного варианта пандемического вируса гриппа А(ШШ)рёт09 подобно высокопатогенному гриппу птиц А(Н5Ш) [5].
Таким образом, обнаружено, что пандемический вирус гриппа А(Н1Ш) рёт09 способен вызывать высоко летальное заболевание в виде респираторной пневмонии среди экспериментально инфицированных мышей линии BALB/c аналогично высокопатогенному вирусу гриппа птиц А(Н5Ш) только после предварительной адаптации к мышам. При этом отмечается различный механизм развития патологического процесса: под воздействием адаптированного варианта вируса гриппа А(ШШ)рёт09 сперва развивается бронхит, который быстро усугубляется развитием альвеолита, в то время как под воздействием высокопатогенного вируса гриппа птиц А(Н5Ш) сразу же развивается альвеолит. На 6 сутки после инфицирования регистрируется развитие генерализованной инфекции у мышей обеих экспериментальных групп.
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ номер проекта 17-44-07001.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ковнер А.В., Потапова О.В., Шкурупий В.А. Морфофункциональные изменения эн-дотелиоцитов сосудов легких при гриппе A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoe/627/05 у мышей. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012, 154 (10): 472475.
2. Романовская А.А., Шаршов К.А., Зайковская А.В. Дурыманов А.Г., Шестопалов А.М. Штамм вируса гриппа A/Russia/01/2009-MA субтипа H1N1 для исследования лечебной и профилактической активности противовирусных препаратов in vitro и in vivo. Патент на изобретение. RUS 2451072 18.10.2010.
3. Belser J.A., Szretter K.J., Katz J.M., Tumpey T.M. Use of animal models to understand the pandemic potential of highly pathogenic avian influenza viruses. Advances in virus research.
2009, 73: 55-97. doi: 10.1016/S0065-3527(09)73002-7.
4. Connor R.G., Kawaoka Y, Webster R.G., Paulson JC.l. Receptor specificity in human, avian, and equine H2 and H3 influenza virus isolates. Virology. 1994, 205(1): 17-23.
5. Garigliany M.M., Habyarimana A., Lambrecht B. et al. Influenza A strain-dependent pathogenesis in fatal H1N1 and H5N1 subtype infections of mice. Emerging Infectious diseases.
2010, 16(4): 595-603. doi: 10.3201/eid1604.091061.
6. Ilyushina N.A., Khalenkov A.M., Seiler J.P. et al. Adaptation of pandemic H1N1 influenza viruses in mice. J. Virology. 2010, 84 (17): 8607-8616. doi: 10.1128/JVI.00159-10.
7. Ito T., Couceiro J.N., Kelm S. et al. Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential. J. Virol. 1998, 72 (9): 7367-7373.
8. Kuiken T., Taubenberger J. Pathology of human influenza revisited. Vaccine. 2008, 26: D59-D66.
9. Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. World Health Organization. 2002.
10. Pandemic (H1N1) 2009—update 102. World Health Organization. http://www.who.int/csr/ don/2010_05_28/en/index.html (Дата обращения 25.08.2014).
11. Prokopyeva E.A., Romanovskaya A.A., Sharshov K.A. et al. Pathogenicity assessment of A(H1N1)pdm09 and A(H5N1) viruses. Histology and Histopathology. 2017, 32: 1057-1063. doi: 10.14670/HH-11-866.
12. Prokopyeva E.A., Sobolev I.A., Prokopyev M.V., Shestopalov A.M. Adaptation of influenza A(H1N1)pdm09 virus in experimental mouse models. Infection Genetic Evolution. 2016, 29. pii: S1567-1348(16)30022-3. doi: 10.1016/j.meegid.2016.01.022.
13. Shinya K., Ebina M., Yamada S. et al. Avian flu: influenza virus receptors in the human airway. Nature. 2006, 440 (7083): 435-436.
Поступила 05.11.17
Контактная информация: Прокопьева Елена Александровна, 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2, р.т. (383)333-64-56
