CC BY
59
сч сч
ев
сч cv
Сравнительный анализ методов генотипирования минорных
антигенов гистосовместимости
А.С. Вдовин1, А.М. Постовская1,2, Н.А. Быкова1, Д.С. Романюк1, А.Х. Алиева3, П.Р. Ефимова1,2,
С.А. Шитиков2, У.Л. Джулакян1, Г.А. Ефимов1
ФГБУ«Гематологический научный центр» Минздрава России; Россия, 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, 4; 2ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»; Россия, 119991, Москва, ул. Ленинские Горы, 1; 3ФГБУН «Институт молекулярной генетики Российской академии наук»; Россия, 123182, Москва,
площадь академика И.В. Курчатова, 2
Контакты: Григорий Александрович Ефимов grigory@efimov.info
Для определения различий донора и реципиента по минорным антигенам гистосовместимости при трансплантации могут быть использованы разнообразные подходы. В настоящей работе нами был проведен сравнительный анализ методов генотипирования, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР), для четырех минорных антигенов. Три метода: аллель-специфичная ПЦР, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов и ПЦР в реальном времени с использованием зондов TaqMan продемонстрировали 100% достоверность результатов генотипирования при сравнении с секвенированием по Сэнгеру для всех изученных полиморфизмов. Метод анализ кривых плавления оказался неприменимым для генотипирования одного минорного антигена (HA-1), имеющего сцепленный синонимичный полиморфизм. Полученная информация может быть использована при выборе метода для крупномасштабного генотипирования в клинической практике.
Ключевые слова: минорные антигены гистосовместимости, однонуклеотидные полиморфизмы, аллогенная трансплантация ге-мопоэтических стволовых клеток, генотипирование, аллельная дискриминация.
DOI: 10.17650/1818-8346-2016-11-2-40-50
Comparative analysis of minor histocompatibility antigens genotyping methods
A.S. Vdovin1, A.M. Postovskaya1,2, N.A. Bykova1, D.S. Romaniuk1, A.K. Alieva3, P.R. Yefmova1,2, S.A. Sheetikov2, H.L. Julhakyan1, G.A. Efimov1
National Research Center for Hematology of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation; 4 Novy Zyikovskiy pr., Moscow, 125167, Russia;
2M.V. Lomonosov Moscow State University; 1 Leninskie Goryi St., Moscow, 119991, Russia;
3The Institute of Molecular Genetics of the Russian Academy of Sciences; 2, Kurchatova Sq., Moscow, 123182, Russia
The wide range of techniques could be employed to find mismatches in minor histocompatibility antigens between transplant recipients and their donors. In the current study we compared three genotyping methods based on polymerase chain reaction (PCR) for four minor antigens. Three of the tested methods: allele-specific PCR, restriction fragment length polymorphism and real-time PCR with TaqMan probes demonstrated 100% reliability when compared to Sanger sequencing for all of the studied polymorphisms. High resolution melting analysis was unsuitable for genotyping of one of the tested minor antigens (HA-1) as it has linked synonymous polymorphism. Obtained data could be used to select the strategy for large-scale clinical genotyping.
Keywords: minor histocompatibility antigen, single nucleotide polymorphism, allogeneic hematopoietic stem cells transplantation, genotyp-ing, allelic discrimination
Введение
Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) широко применяется для лечения гемобластозов. При алло-ТГСК клетки иммунной системы пациента уничтожаются методом пред-трансплантационного кондиционирования и заменяются клетками иммунной системы донора [1]. Помимо восстановления кроветворения, трансплантация за счет иммунного ответа донорских Т-клеток против клеток хозяина приводит к элиминированию остаточных опухолевых клеток. Аллореактивность против злокачест-
венного клона получила название реакции «трансплантат против опухоли» (РТПО). Однако зачастую в ходе посттрансплантационного иммунного ответа поражаются и здоровые ткани пациента (реакция «трансплантат против хозяина», РТПХ). Оба эти эффекта имеют одинаковую природу и зависят от совместимости донора и реципиента по главному комплексу гистосов-местимости (Major Histocompatibility Complex, MHC) и минорным антигенам гистосовместимости (Minor Histocompatibility Antigens, MiHA). Главный комплекс гистосовместимости — группа поверхностных белков,
чьей основной функцией является презентация внутриклеточных (MHC I класса) и внеклеточных (MHC II класса) антигенов Т-лимфоцитам. Гены, кодирующие эти белки (Human Leukocyte Antigen, HLA), высокополиморфны [2], т. е. полное совпадение по этим генам у неродственных людей — редкое событие. В то же время существенное различие по аллелям MHC при трансплантации стволовых клеток крови влечет за собой выраженную и потенциально летальную РТПХ [3]. По этой причине были созданы специальные банки для подбора доноров, совместимых по аллелям MHC. Но даже полное совпадение по генам MHC не может полностью предотвратить аллореактивность. Впервые РТПХ при HLA-идентичной ТГСК была описана в 1970 годы [4]. Мишени алллореактивных Т-клеток получили название Минорных антигенов. Потребовалось почти 20 лет, чтобы охарактеризовать MiHA на молекулярном уровне [5]. Выяснилось, что это пептиды, презентируемые на поверхности клеток реципиента в контексте общего с донором аллеля МНС. Тот факт, что они вызывают иммунный ответ, указывает на то, что они не были представлены в ходе негативного отбора в тимусе донора.
Причина существования MiHA — полиморфизм человеческого генома [6]. Небольшие различия в белковых последовательностях между индивидуумами приводят к различным наборам пептидов, получающимся вследствие расщепления белков протеасомой, и в конечном итоге к разным наборам пептидов, представленным на поверхности клеток в МНС. Известно всего несколько MiHA, обусловленных структурными вариантами генома (делеция гена) [7], тогда как происхождение большинства MiHA вызвано присутствием однонук-леотидных полиморфизмов (ОНП), благодаря которым два гомологичных пептида донора и реципиента отличаются друг от друга лишь 1 аминокислотой [8]. Из-за диплоидности генома необходимыми условиями возникновения MiHA являются гомозиготность донора по одному (неиммуногенному) аллелю и присутствие хотя бы одного варианта альтернативного (иммуно-генного) аллеля у донора. Количество таких комбинаций полиморфизмов в каждой паре донор—реципиент велико — более 3000 [9], однако не все потенциально иммуногенные комбинации приводят к появлению иммунного ответа на MiHA [10]. На сегодняшний день идентифицированы около 50 полиморфизмов, связанных с MiHA, иммуногенность которых подтверждена экспериментально [8]. Различие, различие донора и реципиента (пациента) по этим полиморфизмам указывает на мишени аллореактивного ответа в данной паре донор—пациент, что позволяет изучить влияние конкретных MiHA на РТПО и РТПХ.
Описание свойств MiHA позволит предсказывать уровень иммунного ответа при алло-ТГСК и своевременно корректировать курс лечения. В перспективе предсказание мишеней аллореактивности позволит селективно модифицировать трансплантат [11].
Генотипирование полиморфизмов методом аллель-специфичной ПЦР (АС-ПЦР) было описано для минорных антигенов НА-1 [12], НА-2 [13] и НА-3 [14]. В этом методе используются два прямых праймера, комплементарных своим З'-концом к одному или другому аллельному варианту ОНП гена MiHA, и один общий обратный праймер. Одну и ту же пробу анализируют в двух параллельных реакциях с помощью двух пар праймеров, затем результат ПЦР визуализируют при помощи гель-электрофореза. Аллельная дискриминация обеспечивается тем, что присоединение по-лимеразой нуклеотидов к З'-концу праймера происходит при полном связывании праймера на З'-конце, т. е. при полной комплементарности в месте ОНП. Однако на практике различие в один нуклеотид не всегда достаточно для обеспечения избирательного синтеза полимеразой, что может затруднять аллельную дискриминацию [15]. Еще одним фактором, важным для последующего клинического применения, является возможность проведения анализа для максимального числа полиморфизмов одновременно. Одновременного типирования нескольких MiHA методом АС-ПЦР существуют ограничения: так как специфичность реакции амплификации достигается за счет того, что З'-конец одного из праймеров приходится на целевой полиморфизм, число возможных вариантов прай-меров сильно ограничено, соответственно, ограничены и свойства олигонуклеотидов. Вариант параллельного типирования на 10 аутосомных MiHA методом АС-ПЦР был описан ранее [16] (табл. 1).
В данной работе мы исследовали применимость альтернативных методов генотипирования для одновременного анализа MiHA-полиморфизмов.
Метод полиморфизма длинырестрикционных фрагментов (ПДРФ) основан на способности эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз) специфически узнавать определенные последовательности ДНК и расщеплять обе нити ДНК в месте или рядом с местом узнавания [17]. Для генотипирования ОНП должен находиться в сайте узнавания рестриктазы, при этом один из аллельных вариантов должен приводить к исчезновению сайта. Это означает, что для каждого гена МША требуется подбирать свою рестриктазу. Аллельная дискриминация проводится путем наработки фрагментов, содержащих исследуемый ОНП, методом ПЦР и последующей их инкубации со специфичной рестриктазой. Затем длина получившихся продуктов рестрикции анализируется агарозным гель-электорофорезом. Этот метод дешев и не требует синтеза специальных флуоресцентных зондов, а существующее на сегодняшний день разнообразие эндонуклеаз рестрикции позволяет подобрать специфичные рестриктазы для почти любого полиморфизма.
Метод плавления в высоком разрешении (ПВР) основан на различии термостабильности двухцепочеч-ных фрагментов ДНК с полностью комплементарными нитями и фрагментов с одним или несколькими
cv cv
ев
cv cv
Таблица 1. Проанализированные минорные антигены гистосовместимости
MiHA Идентификатор полиморр-физма в Частота в популяции н Расположение Хромосома Нуклеотид Аминокислота Пептид Аллель МНС Иммуноген-ность Ткане-специфичность
0,404752 А Н VLHDDLLEA HLA- да
НА-1 ^1801284 0,595248 НМНА1 экзон 19 G R VLRDDLLEA А*02:01 нет Миелоидная,
0,404752 А Н KECVLHDDLL HLA- да лимфоидная
0,595248 G R KECVLRDDLL В*40:01 нет
НА-2 ^61739531 0,863019 MYO1G экзон 7 G V YIGEVLVSV HLA- да Миелоидная,
0,136981 А М YIGEVLVSM А*02:01 нет лимфоидная
АСС-ГТ ^1138357 0,352037 В^2А1 экзон 15 А Y DYLQYVLQI HLA- да Миелоидная,
АСС-1С 0,647963 G С DYLQCVLQI А*24:02 да лимфоидная
АСС-2 ^3826007 0,203474 В^2А1 экзон 15 А D KEFEDDIINW HLA- да Миелоидная,
0,796526 G G KEFEDGIINW В*44:03 нет лимфоидная
СМ см
ев
сч см
Примечания. Жирным шрифтом и подчеркиванием выделены вариантные аминокислоты.
■
■
неспаренными нуклеотидами. В качестве способа детекции используют интеркалирующие флуоресцентные красители, интенсивность свечения которых возрастает на порядок при включении в образуемые двухцепо-чечные фрагменты ДНК. За амплификацией исследуемого участка следуют постепенное нагревание проб и регистрация флуоресценции в реальном времени. Ожидается, что образцы, в которых сформировались гетеродуплексы, раньше начнут денатурировать, образуя отдельные нити и высвобождая краситель, при этом из-за свойств красителя свечение в образце понижается. По результатам серии измерений программой формируются кривые плавления двухцепочечных фрагментов [18, 19]. При этом различие лишь по одному нуклеотиду при длине фрагмента до 300 пар оснований вносит достаточные изменения в форму кривой плавления. Сравнивая кривые плавления контролей и образцов, можно определить гетерозиготу и оба гомозиготных варианта. Этот метод генотипирования образцов не требует дополнительных манипуляций (обработка рестриктазами, электрофоретический анализ).
Генотипирование ПЦР-РВ с использованием зондов Та^Мап —метод, требующий специальных составных олигонуклеотидов — TaqMan-зондов, двумя концами конъюгированных с флуоресцентными красителями: сигнальным флуорофором на 5'-конце и гасящим флу-орофором на З'-конце. Спектр излучения сигнальной метки совпадает со спектром поглощения гасителя,
поэтому, когда обе молекулы связаны вместе олиго-нуклеотидом, свет сигнальной молекулы поглощается гасящим флуорофором. В такой ПЦР-РВ используются четыре олигонуклеотида: два праймера для амплификации, фланкирующие область полиморфизма, и два аллель-специфичных TaqMan-зонда, связанные с двумя различными красителями, детектируемыми в разных флуоресцентных каналах. Зонды отличаются на один нуклеотид и комплементарны участку, непосредственно окружающему ОНП. На этапе элонгации в ходе ПЦР Taq-полимераза с 5'-экзонуклеазной активностью, двигаясь от праймера, может наткнуться на зонд, связавшийся с этой же нитью в месте полиморфизма. В этом случае полимераза расщепляет этот зонд и сигнальная метка разобщается с гасителем, в результате чего возникает флуоресцентный сигнал, который далее нарастает за счет экспоненциального накопления продуктов ПЦР и, соответственно, возрастающего количества сайтов связывания и расщепления зондов. При правильно подобранной температуре реакции не полностью комплементарный зонд связывается менее стабильно, поэтому флуоресценция от другого красителя не наблюдается или ее рост значительно замедлен. В результате оба аллеля могут быть обнаружены в ходе одной реакции в одной пробирке в режиме ПЦР-РВ, что требует минимальных временных затрат. Зная соответствующий красителю TaqMan-зонда аллель, можно по графикам роста флуоресценции раз-
делить тестируемые образцы на гомо- и гетерозиготы. Наглядно разделить аллели можно, если построить двумерный график на основе данных флуоресценции для обоих красителей с одного из поздних циклов ПЦР-РВ.
Для сравнительного исследования были выбраны следующие MiHA: НА-1, HA-2, АСС-1 и АСС-2. При выборе мы учитывали клиническую важность: соответствующие этим MiHA полиморфизмы часто встречаются в популяции (следовательно, возникновение иммуногенной комбинации генотипов донора и реципиента высоко вероятно). Аллели HLA, представляющие эти MiHA, также относятся к наиболее распространенным (см. табл. 1), кроме того, ранее был разработан протокол АС-ПЦР для этих MiHA [16]. Помимо этого, данные MiHA специфичны для гемопоэтических клеток, что делает их перспективными с точки зрения разделения эффектов РТПО и РТПХ. Так, для HA-1, HA-2 и ACC-1 было показано, что появление специфичных к ним Т-клеток предшествует ремиссии после инфу-зии лимфоцитов донора [20, 21].
Материалы и методы
Выделение геномной ДНК. Геномная ДНК была выделена из крови 10 здоровых доноров с помощью набора WizardGenomic DNA Purification Kit (Promega, США) согласно протоколу производителя.
Подготовка контрольных матриц. Для контроля всех методов анализа ОНП были сконструированы плазмиды, содержащие фрагменты геномной ДНК с обоими аллельными вариантами исследуемых ОНП. Для этого с тотальной ДНК доноров, с помощью ре-комбинантной полимеразы Pfu (Thermo Scientific, США) нарабатывались фрагменты ДНК, содержащие изучаемые ОНП. Полученные фрагменты очищались электро-форетически в 1,5 % агарозном геле, для выделения ДНК из геля использовался Gene Jet Gel Extraction Kit
(Thermo Scientific, США). Фрагменты лигировались в вектор pJET1.2 с помощью CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific, США) по тупым концам. Компетентные клетки штамма E. coli штамма DH5a, полученные кальциевым способом, трансформировали полученными плазмидами методом теплового шока. После отбора на селективном агаре колонии культивировались ночь в инкубаторе при 37°С, затем плаз-мидную ДНК выделяли с помощью GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific, США). Все полученные контрольные матрицы были проверены секвени-рованием по Сэнгеру (Евроген) [22].
АС-ПЦР. Условия амплификации искомых фрагментов геномной ДНК методом аллель-специфичной ПЦР, состав смеси ПЦР и последовательности прай-меров (табл. 2) с небольшими изменениями были заимствованы из ранее опубликованной работы [16]. ПЦР-смесь содержала 80 нг геномной ДНК, 0,25 Ед. Taq-полимеразы (ThermoScientific, США), 0,01 % желатина, 0,2 мМ dNTP (ThermoScientific, США), по 0,5 мкМ праймеров (Евроген, Россия), 1,5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl (pH 8,3) и 6 % сахарозы (S7903, Sigma-Aldrich, Германия). Для увеличения выхода ПЦР концентрация праймеров для HA-1 была удвоена. Концентрация dNTP была снижена с 0,8 мМ до 0,2 мМ, поскольку исходная концентрация значительно превышала оптимальную и ингибировала реакцию. Цикл амплификации начинался с 2 мин при 94°C, затем 10 циклов: 10 с на 94°C и 60 с на 65°C, далее 20 циклов проходили при следующих условиях: 10 с на 94°C, 50 с на 61°C, 30 с на 72°C. Образцы были проанализированы при помощи электрофореза на 2 % агарозном геле.
Подбор праймеров для ПВР и TaqMan-ПЦР. Подбор праймеров, фланкирующих полиморфные регионы (см. табл. 2), производился с использованием программ Beacondesigner 7.0 и Primer 3 [23]. Во избежание попадания праймеров на другие ОНП, для каждого
CV CV
CS
CV CV
Таблица 2. Последовательности праймеров для аллель-специфичной полимеразной цепной реакции
MiHA Аллельный вариант (вариантная аминокислота) Прямой праймер Обратный праймер
HA-1 H CTTAAGGAGTGTGTGCTGCA ACTCCTACACATCCCTCAGA
HA-1 R CTTAAGGAGTGTGTGTTGCG
HA-2 V ACAGTCTCTGAGTGGCTCAG GCTCCTGGTAGGGGTTCAC
HA-2 M GCTCCTGGTAGGGGTTCAT
ACC-1 Y CATTGCCTCAACAGCTTCAAG GGTTGTGGTATCTGTAGGGCGT
ACC-1 C GGTTGTGGTATCTGTAGGGCGC
ACC-2 D GATGGAAAAGGAGTTTGAAGGCGA CAGCCTCCGTTTTGCCTTATC
ACC-2 G GATGGAAAAGGAGTTTGAAGGCGG
Примечание. Приведены 5'-3'-последовательности олигонуклеотидов. Жирным шрифтом выделены аллель-специфичные нуклеотиды на 3'-конце, подчеркиванием — дополнительные замены, внесенные для увеличения специфичности полимеразной цепной реакции.
сч сч
ев
сч ev
ОНП были взяты фланкирующие нуклеотидные последовательности из генома человека версии hg38 (UCSCGenomeBrowser — http://hgdownload.soe.ucsc.edu/ goldenPath/hg38/database/), на которых отмечались варианты нуклеотидных полиморфизмов из базы данных dbSNP версии 142 (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/snp/database), встречающиеся более чем в 1 % человеческой популяции. Проверка на специфичность подобранных прайме-ров к исследуемым областям генома проводилась с помощью ресурса Primer-Blast, NCBI.
ПДРФ. Фрагменты, содержащие исследуемые ОНП, амплифицировались с помощью ПЦР. В реакционную смесь входили 1,5 мМ MgCl2, 200 мкМ dNTP, 0,5 мкМ прямого праймера, 0,5 мкМ обратного праймера, Taq-полимераза (Thermoscientific, США), буфер для Taq-полимеразы с KCl (ThermoScientiffic, США) и 10 нг геномной ДНК. Контрольные пробы содержали 0,5 нг контрольной матрицы. ПЦР проходила при следующих температурных условиях: 95 °С — 5 мин, 30 циклов; 95 °С — 30 сек, 60 °С - 30 сек, 72 °С - 8 сек, 72 °С - 5 мин.
После завершения реакции амплификации непосредственно в ПЦР-смесь добавляли соответствующие эндонуклеазы: для HA1 и HA2 — 2 Ед. FatI (СибЭнзим, Россия), ACC1 - 10 Ед. RsaI (СибЭнзим, Россия), ACC2 -10 Ед. SfaNI (СибЭнзим, Россия). Рестрикция проходила в течение 30 минут при 37°С. Получившиеся фрагменты разделялись в 10 % полиакриламидном геле, приготовленном на однократном TBE буфере. Для визуализации гель помещали в раствор бромистого этидия (0,5 мкг/мл) и инкубировали, перемешивая, 15 минут. Анализ аллельных вариантов проводили по наличию фрагментов ДНК определенной длины (табл. 3).
ПЦР-РВ с использованием технологии TaqMan. Для амплификации фрагментов геномной ДНК, содержащих изучаемые полиморфизмы, методом ПЦР-РВ использовались подобранные, как описано выше, праймеры, приведенные в таблице 4. Подбор TaqMan-
Таблица 3. Длина фрагментов при типировании методом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов
MiHA Аллель Рестриктаза Наличие сайта рестрикции Длина фрагментов с учетом липких концов п. н.
HA1 A + 85 и 54
G FatI - 135
HA2 G - 135
A + 100 и 39
ACC1 A RsaI + 47 и 69
G - 116
ACC2 A SfaNI - 126
G + 70 и 60
зондов, комплементарных полиморфному региону, производился с использованием программ Beacon Designer 7.0 и Primer3 [23]. Использовались флуоресцентные красители — FAM и HEX и гаситель флуоресценции BHQ1.
Список использованных флуоресцентных зондов (выделен нуклеотид, комплементарный соответствующему полиморфизму):
HA1-G: 5' - FAM-TGGCTCTCACCGTCAÇGCAA-CACA-BHQ1-3'
НА1-А: 5' - HEX-TGGCTCTCACCGTCAIGCAA-CACA-BHQ1-3'
НА2-С: 5' - FAM- TGGTGTCCGTGAACCCCTAC BHQ1-3'
НА2-Т: 5' - HEX- TGGTGTCC4TGAACCCCTAC-BHQ1-3'
АСС1-С: 5' - FAM-CTATCTGCAGTGCGTCCTA-CAGA-BHQ1-3'
АСС1-Т: 5' - HEX-CTATCTGCAGTiCGTCCTA-CAGA-BHQ1-3'
АСС2-С: 5' - FAM-AGTTTGAAGACGGCATCAT-TAACTGG-BHQ1-3'
АСС2-Т: 5' - HEX- AGTTTGAAGACGiCATCAT-TAACTGG -BHQ1-3'.
ПЦР-РВ проводили на приборе CFX96 (BioRad, США). В состав 25 мкл реакционной смеси входили 10 нг ДНК, по 400 нМ прямого и обратного праймеров, по 100 нМ каждого из двух зондов, qPCRmix-HS (Евроген, Россия), содержащий HSTaq ДНК-полиме-разу, смесь нуклеотидтрифосфатов, Mg2+ и реакционный буфер. Каждый образец анализировался в трех повторностях. Цикл амплификации начинался с 60 сек при 50°C, затем 300 сек - 95°C, далее 40 циклов: 95°C -10 сек, 62,5°C - 20 сек, 72°C - 30 сек. Аллельная дискриминация ОНП производилась при помощи программного обеспечения BioRad CFXManager 3.1.
Метод ПВР. Для амплификации фрагментов геномной ДНК, содержащих изучаемые полиморфизмы, методом ПВР использовались праймеры (таблица 4), подобранные и проанализированные с использованием алгоритма программы Primer3 [23]. Размер ампли-фицируемого фрагмента составлял 80-100 пар нукле-отидов и включал в себя полиморфизм. Реакция ПЦР-РВ проводилась в смеси Précision Melt Supermix (Bio-Rad, США) при рекомендованных производителем условиях, после чего снималась кривая плавления полученного продукта. Кривые плавления были проанализированы при помощи программного обеспечения Precision Melt Analysis (Bio-Rad, США), присутствие аллельных вариантов в пробах определялось по кластеризации кривых плавления образцов с кривыми, полученными на контрольных матрицах.
Cеквенuрованuе по Сэнгеру
ПЦР-амплификация кодирующих MiHA участков проводилась Phusion High-Fidelity ДНК-полимеразой (Thermo Scientific, США).
Таблица 4. Последовательности праймеров, использованных для генотипирования (в направлении 5'—3)
MiHA Аллель Прямой праймер Обратный праймер Фрагмент, п. н. Метод
H CTTAAGGAGTGTGTGCTGC4
ACTCCTACACATCCCTCAGA 190 АС-ПЦР
R CTTAAGGAGTGTGTGTTGCG
HA-1 H, R GTCGTCGAGGACATCTCCC TCTGGCTCTGTCTTCCACC 135 TaqMan ПЦР, ПДРФ, сек-венирование по Сэнгеру
H, R GCTGAGGGCCTTGAGAAACT CTTGGGTCTGGCTCTGTCTT 96 ПВР
V GCTCCTGGTAGGGGTTCAC
ACAGTCTCTGAGTGGCTCAG 271 АС-ПЦР
M GCTCCTGGTAGGGGTTCAX
НА-2 V, M CACAGCATAGAGATGGGGTG CGCATCTACACCTACATCGG 135 TaqMan ПЦР, ПДРФ, сек-венирование по Сэнгеру
V, M AGGGGCAGCTCCTGGTAG TGTGTCCAGGTTCGAGAAGG 84 ПВР
Y GGTTGTGGTATCTGTAGGGCGJ
CATTGCCTCAACAGCTTCAAG 137 АС-ПЦР
ACC-1 С GGTTGTGGTATCTGTAGGGCGC
Y, C CCACCAGGCAGAAGATGACA GGACGTTTTGCTTGGACCTG 116 TaqMan ПЦР, ПДРФ, сек-венирование по Сэнгеру
Y, C AGCACTCTGGACGTTTTGCT CAGGCTGGCTCAGGACTATC 81 ПВР
D GATGGAAAAGGAGTTTGAAGGCG4
CAGCCTCCGTTTTGCCTTATC 197 АС-ПЦР
G GATGGAAAAGGAGTTTGAAGGCGG
АСС-2 D, G CGTAGACACTGCCAGAACACTATT CGTAGAAGTTTCTT GATGAGAATACCTTC 126 TaqMan ПЦР, ПДРФ, сек-венирование по Сэнгеру
D, G CCGTAGACACTGCCAGAACA TGGTTACAATTCTTCCCCAGT 87 ПВР
CV CV
ев
сч сч
Примечание. ПЦР — полимеразная цепная реакция, АС-ПЦР — аллель-специфичная полимеразная цепная реакция, ПДРФ — полиморфизм длинырестрикционных фрагментов. Подчеркиванием отмечены аллель-специфичные нуклеотиды.
Плазмиды pJET и продукты ПЦР секвенировались в компании «Евроген» (Москва).
Для амплификации исследуемого фрагмента и его секвенирования применялись те же праймеры, что и для ПЦР-РВ. Для секвенирования плазмиды pJET применялись универсальные праймеры для этой плазмиды («Евроген», Россия): прямой праймер pJET — CGACT-CACTATAGGGAGAGCGGC, обратный праймер -AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG.
Результаты секвенирования анализировались с помощью программного обеспечения CLC Genomics Workbench (QIAGEN, Германия) и Geneious Pro (Bio-matters, Новая Зеландия).
Результаты и обсуждение
Образцы ДНК от 10 доноров были протипирова-ны с использованием 5 методов. Результаты АС-ПЦР (рис. 1), ПДРФ (рис. 2), ПЦР-РВ с использованием зондов TaqMan (рис. 3) и секвенирования по Сэнгеру совпали (табл. 5).
Секвенирование по Сэнгеру выступало в данном случае как контроль качества типирования. Полученные результаты говорят о надежности указанных методов. Выбор между ними зависит от области применения типирования по MiHA, которая, в свою очередь, определяет оптимальное сочетание временных и финансовых затрат, простоты и прочих параметров.
АС-ПЦР и ПДРФ — наиболее дешевые из всех описанных методов, однако они проигрывают по показателю затрачиваемого на анализ времени. В обоих случаях для получения конечного результата требуется разделение продуктов ПЦР при помощи электрофореза. АС-ПЦР осложняется тем, что на каждый образец требуется ставить 2 реакции. Кроме того, поскольку один из праймеров для АС-ПЦР строго привязан к полиморфизму, это осложняет подбор условий для унифицированного типирования одновременно большой панели МША. Этот метод обычно применяется для определения аллельных вариантов при исследовании отдельных MiHA, но не подходит для масштаб-
Контр. матрицы НА-1
см см
ев
сч см
м-р
А в в/А
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
7* —' -- — — - —-----
— —
НА-2
"5-А~в7А 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
в 200 150 А 200 150
в
А 200
в 200 100
А АСС-1,л 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
в А в/А
200 5 100[
А 200 А 100
АСС-2
в А в/А 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Рис. 1. Типирование образцов ДНК при помощи аллель-специфичной полимеразной цепной реакции
Контр матрицы НА- 1 в А в/А
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
150 100
150 100
50
150 100
и и у и и и ы 5 ы М 1 Ы 1
■ Ы 1
НА-2 в А в/А 1 2 3 4 5 6 7 8
АСС-1 в А в/А 1 2 3 4 5 6 7 8
АСС-2
в А в/А 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
и
Рис. 2. Типирование образцов ДНК при помощи анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов
ного типирования, что потенциально востребовано в клинике.
ПДРФ помимо электрофоретического анализа включает еще одну дополнительную стадию — реакцию рестрикции. При типировании панелей МША возникает необходимость использования большого набора эндонуклеаз, что не только увеличивает время анализа, но и повышает вероятность ошибки. Кроме того, для эффективной работы некоторых рестриктаз может потребоваться этап очистки ДНК после амплификации и/или большее время инкубации. Необходимость электрофоретического анализа для АС-ПЦР и ПДРФ также создает угрозу контаминации рабочего пространства и реагентов продуктами ПЦР, особенно
при регулярном проведении типирования, что может послужить причиной ложно-положительных результатов.
Метод ПЦР-РВ с использованием флуоресцентных зондов TaqMan требует минимальных затрат по времени и позволяет получить результат типирова-ния сразу после проведения ПЦР. После отработки условий этот метод возможно масштабировать для ти-пирования большого числа доноров на целые панели MiHA. Ограничением является лишь относительно большая стоимость реагентов.
Метод анализа кривых плавления показал надежные результаты только для 3 из 4 исследуемых MiHA: НА-2, АСС-1 и АСС-2. В случае ИА-1 обработка результатов позволяет отличить только гомозиготные образцы от гетерозиготных (рис. 4). Для всех МША в изучаемом полиморфизме пара G/C в одном аллель-ном варианте заменяется на А/Т в другом. Такие замены являются наиболее распространенными среди ОНП, и обычно разница в энергии связывания между ними позволяет детектировать изменения в кривых плавления.
Более редкие замены G/C на С^ и А/Т на Т/А определить гораздо труднее, и это не всегда удается. Для полиморфизма ге3764653, дающего начало антигену HA-1, ситуация осложняется еще и тем, что всего в 3 нуклеотидах от него находится сцепленный полиморфизм гб1801284, таким образом, замена G/C на А/Т в ге3764653 всегда сопровождается заменой Т/А на С^ в гб1801284, что не дает значительного изменения в энергии связывания. Тем не менее такой случай не относится к числу распространенных, и метод ПВР может применяться для типирования других MiHA. Это важно, поскольку по скорости анализа и простоте он практически не уступает ПЦР-РВ и при этом более экономически выгодный.
Заключение
Основное внимание при выборе оптимального метода следует уделить таким параметрам, как затрачиваемое на анализ время, стоимость анализа и возможность масштабирования для большого числа пациентов и изучаемых полиморфизмов. Экономически самые выгодные — АС-ПЦР и ПДРФ. Однако, если перед исследователем стоит задача массового и регулярного генотипирования больших объемов образцов, более перспективными представляются методы, не требующие дополнительных манипуляций после проведения ПЦР. Метод ПВР показал свою эффективность для 3 из 4 изучаемых полиморфизмов. Неприменимость ПВР для типирования HA-1 обусловлена особенностями строения участка ДНК, а именно наличием близлежащего сцепленного полиморфизма. Метод ПЦР-РВ сочетает в себе универсальность и быстроту получения результатов, ограничением для его применения является лишь его относительно высокая стоимость.
350
300 < 250
-Û
5 200
с с
го
г- 150
<
х 100
50 0
1200 1000 800
с
<и
¡5 600
< х
400 200 0
250
200
ú 100
и
50
250
200
150
100
50
50
200
50
CV
ev
ев
100
150 200 HA-1 аллель G
250
300
CV CV
300
400 HA-2 аллель G
500
600
100 150 200
ACC-1 аллель G
250
300
50
100
150 200 ACC-2 аллель G
250
300
Рис. 3. Аллельная дискриминация образцов ДНК методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием зондов TaqMan: HA-1 (а), HA-2 (б), ACC-1 (в), ACC-2 (г). По осям X и Y отложена флуоресценция в каналах FAM и HEX. Различными значками обозначены кластеризующиеся по уровню флуоресценции образцы
а
0
б
в
0
0
г
0
0
НА-1
CV CV
ев
82,5
83,0
83,5
84,0
Температура
НА-2
ev
CV
I
<и ■л
и <и ü
о ^
с
-е-
81
82
83
Температура
84
85
i
<и ■л
и <и
о ^
с
-
АСС-1
78
79
80
Температура
81
82
83
а
б
в
г АСС-2
Температура
Рис. 4. Типирование образцов ДНК при помощи метода плавления в высоком разрешении: НА-1 (а), НА-2 (б), АСС-1 (в), АСС-2 (г). Приведены графики скорости изменения интенсивности флуоресценции от температуры. Различными цветами обозначены кластеризующиеся образцы
Таблица 5.Сводная таблица результатов типирования
Донор MiHA Метод типирования
АС-ПЦР ПДРФ ПВР TaqMan Секвенирование по Сэнгеру
НА-1 G/G G/G G/G или Л/Л G/G G/G
1 НА-2 G/G G/G G/G G/G G/G
АСС-1 G/G G/G G/G G/G G/G
АСС-2 G/G G/G G/G G/G G/G
НА-1 G/A G/A G/A G/A G/A
2 НА-2 G/G G/G G/G G/G G/G
АСС-1 А/А А/А А/А А/А А/А
АСС-2 А/А А/А А/А А/А А/А
НА-1 G/G G/G G/G или Л/Л G/G G/G
3 НА-2 G/A G/A G/A G/A G/A
АСС-1 G/G G/G G/G G/G G/G
АСС-2 G/G G/G G/G G/G G/G
НА-1 G/A G/A G/A G/A G/A
4 НА-2 G/A G/A G/A G/A G/A
АСС-1 G/A G/A G/A G/A G/A
АСС-2 G/A G/A G/A G/A G/A
НА-1 G/A G/A G/A G/A G/A
5 НА-2 G/A G/A G/A G/A G/A
АСС-1 G/A G/A G/A G/A G/A
АСС-2 G/A G/A G/A G/A G/A
НА-1 G/A G/A G/A G/A G/A
6 НА-2 G/G G/G G/G G/G G/G
АСС-1 G/G G/G G/G G/G G/G
АСС-2 G/G G/G G/G G/G G/G
НА-1 А/А А/А G/G или Л/Л А/А А/А
7 НА-2 А/А А/А А/А А/А А/А
АСС-1 G/G G/G G/G G/G G/G
АСС-2 G/G G/G G/G G/G G/G
НА-1 G/A G/A G/A G/A G/A
8 НА-2 G/G G/G G/G G/G G/G
АСС-1 G/A G/A G/A G/A G/A
АСС-2 G/A G/A G/A G/A G/A
НА-1 G/A G/A G/A G/A G/A
9 НА-2 А/А А/А А/А А/А А/А
АСС-1 G/G G/G G/G G/G G/G
АСС-2 G/G G/G G/G G/G G/G
НА-1 G/A G/A G/A G/A G/A
10 НА-2 G/G G/G G/G G/G G/G
АСС-1 G/G G/G G/G G/G G/G
АСС-2 G/G G/G G/G G/G G/G
СМ см
ев
см см
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
CV CV
CS
CV «V
1. Talmadge J.E. Hematopoietic stem cell graft manipulation as a mechanism
of immunotherapy. Int Immunopharmacol. 2003;3(8):1121-43. DOI: 10.1016/S1567-5769(03) 00014-6; PMID: 12860168.
2. Marsh S.G. and WHO Nomenclature Committee for Factors of HLA System. System, nomenclature for factors of the HLA system, update December 2015. HLA, 2016;87(2):126-30 DOI: 10.1111/tan. 12745; PMID: 26889910.
3. Felix N.J., Allen P.M. Specificity of T-cell alloreactivity. Nat Rev Immunol. 2007;7(12):942-53. DOI: 10.1038/nri2200; PMID: 18007679.
4. Goulmy E., Termijtelen A., Bradley B.A., van Rood J.J. Alloimmunity to human H-Y. Lancet 1976;2(7996):1206. PMID: 63036.
5. den Haan J.M., Sherman N.E., Blokland E. et al. Identification of a graft versus host disease-associated human minor histocompatibility antigen. Science 1995;268(5216):1476-80. PMID: 7539551.
6. Ефимов Г.А., Вдовин А. С., Григорьев А.А. и др. Иммунобиология острой реакции «трансплантат против хозяина. Медицинская иммунология 2015;17(6):499-516. [EfimovG. A., Vdovin A.S., Grigoryev A.A. et al. Immunobiology of acute graft-versus-host disease. Meditsinskaya immunologiya = Medical immunology 2015;17(6):499-516 (In Russ.)]. DOI:10.157 89/1563-0625-2015-6-499-516.
7. Murata M., Warren E.H., Riddell S.R. A human minor histocompatibility antigen resulting from differential expression due
to a gene deletion. J Exp Med. 2003;197(10): 1279-89. DOI: 10.1084/jem. 20030044; PMID: 12743171.
8. Griffioen M., van Bergen C.A., Falkenburg J.H. Autosomal minor histocompatibility antigens: how genetic variants create diversity in immune targets. Front Immunol. 2016;7:100. DOI: 10.3389/ fimmu. 2016.00100; PMID: 27014279.
9. Быкова Н.А., Малько Д.Б., Вдовин А.С., Ефимов Г.А. In silico анализ иммуногенн-ного потенциала однонуклеотидных полиморфизимов при полностью
HLA-совместимой трансплантации. Российский иммунологический журнал 2016; 10(19)(1):39—49. [Bykova N.A., Malko D.B., Vdovin A.S., Efimov G.A. In silico analysis of single nucleotide polymorphism immunogenic potential in fully HLA-matched transplantation. Rossiiskii immunologicheskii zhurnal = Russian Immunology Journal 2016; 10(19)(1): 39-49 (In Russ.)].
10. Granados D.P., Sriranganadane D., Daouda T. et al. Impact of genomic polymorphisms on the repertoire of human MHC class I-associated peptides. Nat Commun. 2014;5:3600. DOI: 10.1038/ ncomms4600; PMID: 24714562.
11. Li J.M., Giver C.R., Lu Y. et al. Separating graft-versus-leukemia from graft-versus-host disease in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Immunotherapy 2009;1(4): 599-621. DOI: 10.2217/imt. 09.32; PMID: 20191089.
12. Wilke M., Poo J., den Haan J.M., Goulmy E. Genomic identification
of the minor histocompatibility antigen HA-1 locus by allele-specific PCR. Tissue Antigens 1998;52(4):312-7. PMID: 9820596.
13. Wilke M., Pool J., Goulmy E. Allele specific PCR for the minor Histocompatibility antigen HA-2. Tissue Antigens 2002;59(4):304-7. PMID: 12135429.
14. Spierings E., Brickner A.G., Caldwell J.A. et al. The minor histocompatibility antigen HA-3 arises from differential proteasome-mediated cleavage of the lymphoid blast crisis(Lbc) oncoprotein. Blood 2003;102(2):621-9. DOI: 10.1182/ blood-2003-01-0260; PMID: 12663445.
15. Simsek M., Adnan H. Effect of single mismatches at 3'-end of primers on polymerase chain reaction. J Sci Res Med Sci 2000;2(1):11-4. PMID: 24019700.
16. Spierings E., Drabbels J., Hendriks M. et al. A uniform genomic minor histocompatibility antigen typing methodology and database designed
to facilitate clinical applications. PLoS One 2006;1: e42. DOI: 10.1371/journal. pone. 0000042; PMID: 17183671.
17. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F. et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985;230(4732):1350-4. PMID: 2999980.
18. Krypuy M., Newnham G.M., Thomas D.M. et al. High resolution melting analysis for the rapid and sensitive detection of mutations in clinical samples: KRAS codon 12 and 13 mutations in non-small cell lung cancer. BMC Cancer 2006;6:295. DOI: 10.1186/1471-2407-6-295; PMID: 17184525.
19. Gundry C.N., Vandersteen J.G., Reed G.H. et al. Amplicon melting analysis with labeled primers: a closed-tube method for differentiating homozygotes and heterozygotes. Clin Chem. 2003;49(3):396-406. PMID: 12600951.
20. Turpeinen H., Volin L., Partanen J. Domestic and foreign donor candidates result in differential probability of matching minor histocompatibility antigens—relevance
of selection for hematopoietic stem cell transplantation. Tissue Antigens 2009;73(3):236-41. DOI: 10.1111/j. 13990039.2008.01210. x; PMID: 19254253.
21. Di Terlizzi S., Zino E., Mazzi B. et al. Therapeutic and diagnostic applications of minor histocompatibility antigen HA-1 and HA-2 disparities in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation:
a survey of different populations. Biol Blood Marrow Transplant 2006;12(1):95-101. DOI: 10.1016/j. bbmt. 2005.09.017; PMID: 16399573.
22. Ryazantsev D.Y., Rogozhin E.A., Dimitrieva T.V. et al. A novel hairpin-like antimicrobial peptide from barnyard grass (Echinochlo acrusgalli L.) seeds: structure-functional and molecular-genetics characterization. Biochimie 2014;99:63-70. DOI: 10.1016/j. biochi. 2013.11.005; PMID: 24275143.
23. Untergasser A., Cutcutache I., Koressaar T. et al. Primer3 - new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res 2012;40(15): e115. DOI: 10.1093/nar/gks596; PMID: 22730293.
