CC BY
36
УДК 577.322+577.112
Вестник СПбУ. Сер. 3, 2004, вып. 2
Ю. И. Васъков, В. Е. Стефанов
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ
ГТФ-СВЯЗЫВАЮЩИХ САЙТОВ ТУБУЛИНА
/
Тубулин, образуя микротрубочки, является одним из основных белков цитоскелета клетки и обнаруживается в эукариотических организмах от дрожжей до многоклеточных. Микротрубочки участвуют во многих клеточных функциях. Им отводится важная, если не ключевая, роль в клеточном морфогенезе и некоторых видах клеточной подвижности, в том числе в аксо-нальном транспорте и направленной локомоции клеток. Временное разрушение микротрубо-. чек химическими агентами ведет к рассредоточению аппарата Гольджи, потере формы и полярности клетки. Необратимая элиминация микротрубочек приводит к смерти клетки. Характерной ролью микротрубочек является их участие в мейотическом и митотическом расхождении хромосом. С этой функцией связан механизм действия противоопухолевых препаратов, получаемых на основе естественных алкалоидов или комплексов драгоценных металлов. Клеточно-физиологическая активность микротрубочек реализуется путем их динамической реорганизации - сборки/разборки. Динамические свойства микротрубочки зависят от ее структурной единицы - димера сф-тубулина, его структуры, физико-химических свойств.
Сборка микротрубочек осуществляется при обязательном наличии ГТФ. При сборке происходит гидролиз нуклеотида, который, как полагают, обеспечивает энергию, необходимую для процесса агрегации [11; 13]. Каждый из мономеров (а,(3) тубулина способен связать гуаниновый нуклеотид. Нуклеотид-связывающий сайт в а-тубулине называется N-сайтом, а в Р-тубулине -Е-сайтом [8]. При этом только (3-тубулин проявляет ГТФазную активность. Считается, что гидролиз ГТФ в E-сайте играет ключевую роль в управлении динамическими свойствами микротрубочки. Механизм гидролиза уникален по сравнению с другими G-белками [7] и, несмотря на многолетние исследования микротрубочек и тубулина, до сих пор не раскрыт. Поскольку функциональные свойства белков зависят от их строения, то сравнительный анализ структурной организации ос- и Р-тубулинов позволит приблизиться к пониманию этого механизма.
Тубулин представляет собой суперсемейство белков [9], включающее несколько классов (а, Р, у) и множество изотипов в каждом классе. В одном организме как а-, так и Р-тубулин может быть представлен несколькими изотипами (у человека на сегодняшний момент обнаружено более 5 изотипов Р-тубулина). Существует также целый ряд пострансляционных модификаций, рассмотренных R. F. Luduena [5]. Некоторые из нйх (ацетилирование, фосфорилирование, полиглу-тамилирование) характерны и для других белков. Специфичны для тубулина тирозинилирование/ детирозинилирование, полиглицилирование. Большинство модификаций проходит по С-концу.
Хотя функциональные различия между изотипами тубулинов невелики и в системах in vitro не улавливаются, однако in vivo происходит сортировка различных изотипов тубулина, эксп-рессируемых в одной клетке, в разные типы микротрубочек. Изотип, экспрессируемый в несвойственной среде, обычно формирует микротрубочки, но они могут иметь некоторые отличия, (например, в числе протофиламентов) или меньшую функциональную активность в сравнении с нормальным изотипом для этой же среды [3, 12]. Несмотря на большое количество изоформ, тубулин является консервативным белком, и некоторые участки его молекулы практически идентичны у самых разных организмов - растений, грибов, простейших, насекомых и позвоночных. Так, в этом белке выделяют консенсусную последовательность: [SAG]-G-G-T-G-[SA]-G ) (http://cn.expasy.org/cgi-bin/nicedoc.pI7PDOC00199), характерную для всех
© Ю. И. Васьков, В. Е. Стефанов, 2004
тубулинов. Значительной вариабельностью обладает С-концевой домен. В настоящее время изотипы тубулина интенсивно изучаются. Большинство сведений об их первичной структуре попадает в банки данных (далее БД) по молекулярной биологии без публикации в печати.
Высокая степень гомологии, существующая между классами тубулина, очевидно указывает на то, что в молекулах имеются высоко консервативные области, относящиеся, скорее всего, к лиганд-связывающим сайтам. Вариации аминокислот, образующих эти области, определяют отличия в функциональных особенностях белка, таких как ГТФазная активность и способность связывать лиганды. Поскольку все природные а- и (З-тубулины способны образовывать микротрубочки, мы решили определить степень гомологии и возможные варианты замен аминокислот, образующих ГТФ-связывающие центры. Это позволит выявить «ключевые» аминокислоты, участвующие в гидролизе.
Высокая консервативность тубулина свидетельствует о том, что третичные структуры разных типов тубулина подобны. Негомологичные области предположительно также собираются в сходные третичные структуры [6]. Это подтверждается исследованиями рентгеноструктурных карт, в которых обнаруживаются только небольшие различия между а- и р-тубулинами.
На сегодняшней день существует четыре модели молекул тубулина, созданные по данным рентгеноструктурных исследований. В некоторых из них для выявления активных центров использовались негидролизуемые аналоги ГТФ. Это позволяет определить место положения активного центра на молекуле, но не выявляет его функциональные компоненты. Логично предположить, что аминокислоты, непосредственно участвующие в связывании ГТФ, должны быть неизменными в тубулинах из разных организмов. Работы, посвященные изучению гомологии аминокислот, образующих активный центр у разных организмов, нам не известны, кроме упомянутой выше консенсусной последовательности, а- и (3-субъединицы содержат приблизительно по 450 аминокислотных остатков. Установить трехмерную структуру тубулина методами рентгеноструктурного анализа долгое время не удавалось из-за сложности получения кристаллов, поскольку довольно крупные молекулы тубулина имеют большую склонность к образованию полимеров. Сообщение о первой трехмерной модели, полученной на основе рентгеноструктурного анализа, было опубликовано в 1998 г. [8]. В последующем этими же авторами модель была уточнена. Она учитывает все аминокислотные остатки, за исключением последних десяти в а-тубулине и восемнадцати - в |3-тубулине [4].
Структуру а-тубулина можно разделить на три домена (рис. 1) [4]. "К-концевая часть, аминокислоты с 1 по 206, формируют нуклеотид-связывающий домен. Консенсусная последовательность, характерная для всех тубулинов, входит в эту область. Первый домен образует
ГДФ
Рис. I. Пространственная структура (3-тубулина со связанными ГДФ и таксолом.
Молекула тубулина представлена в виде вторичной струтуры, таксол и ГТФ - Ван-дер-ваальсовых радиусов.
истинную укладку Россманна, характерную для нуклеотид-связывающих белков. Здесь имеется определенное структурное сходство с классическим ГТФазами, но оно не может объяснить уникальный, присущий тубулину, механизм гидролиза ГТФ. В средней части молекулы тубу-лина (остатки 207-384) гомология с последовательностями других белков практически отсутствует. Этот домен участвует в образовании контактов между мономерами, а также вовлечен в гидролиз и может таким образом рассматриваться как важная для катализа область молекулы. Третий домен, содержащий С-концевой вариабельный участок, находится на внешней стороне микротрубочки и участвует во взаимодействии с различными лигандами.
Материалы и методы. Основу работы составили методы биоинформатики, такие как:
• множественное выравнивание аминокислотных последовательностей белков;
• моделирование и визуализация пространственной структуры молекул;
• трехмерное структурное выравнивание белков.
Работа выполнена на Wintel платформе.
Так кактубулин является белком с большим количеством форм (информации по первичным структурам которых к настоящему времени накоплено достаточно много), обладающих сходной третичной структурой, для выполнения задачи по анализу аминокислотных остатков активных центров мы решили применить метод множественного выравнивания.
Для получения исходных материалов использованы общедоступные в Интернете БД по последовательностям белков. На настоящий момент существует целый ряд таких БД (табл. 1), постоянно обменивающихся информацией и практически равноценных. Однако средства работы с ними различны.
Таблица 1. Некоторые (^шествующие в настоящее время в Internet банки данных
Наименование банка данных (БД) (Web-сайт)
Краткое описание
SWISS-PROT (www. expasy.ch/sprot/sprot-top.html)
PIR (www-
nbrf.georgetown.edu/pir/searchdb.html)
PDB (www.rcsb.org/pdb/) OWL
(www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/ OWL.html)
PR0S1TE (www.expasy.ch/prosite)
ProDom (protein.toulouse.inra.fr/prodom.html)
Protein Motions Database (hyper.stanford.edu/~mbg/ProtMotDB)
PROMISE (bioinf.leeds.ac.uk/promise)
Аннотированная БД по аминокислотным последовательностям белков Аннотированная БД по аминокислотным последовательностям белков, организованным в соответствии с гомологией и таксономией БД по 30 структуре биологических макромолекул
Невырожденная комплексная БД по структурам белков из SWISS-PROT, РЖ, ОепВапк и N111,-30
БД паттернов функционально значимых участков белков
БД по доменам белков БД по динамике белков, включающая многоуровневую классификацию движения петель, доменов и субъединиц
БД по простетическим группам и ионам металла в активных центрах белков
Сравнив количество записей по а- и Р-тубулинам, содержащихся в этих БД, а также предоставляемый ими пользовательский интерфейс, для дальнейшей работы мы выбрали БД SWISS. На момент проведения исследований он содержал информацию о 1419 последовательностях а- и р-тубулинов. Такой выбор был обусловлен рядом причин. Во-первых, данная база является наиболее полной. Она содержит кроме собственных данных также ссылки на информацию из других баз. БД SWISS содержит сведения о наибольшем количестве аминокислотных последовательностей, интересующих нас. Во-вторых, эта база позволяет сохранять все записи, найденные по запросу в одном текстовом файле (доступном для загрузки с сервера) в различных форматах (FASTA, HTML, text). Это удобно для дальнейшей обработки больших массивов информации в режиме off-line.
В режиме on-line через систему поиска БД SWISS мы сделали запрос по ключевому слову «tubulin». Все записи по полученной выборке были сохранены в файле формата FASTA.. Поскольку полученная выборка содержала записи не только о самом тубулине, но и о других белках, имеющих отношение к тубулину, а также информацию о не полностью расшифрованных последовательностях, для дальнейшей работы необходимо было создать собственную базу данных с возможностью выборочной фильтрации. Для этого были созданы макросы на Visual Basic's, позволяющие конвертировать файл из формата FASTA в базу данных Microsoft Access. Созданная база позволяет выводить информацию с заданными критериями поиска в файл формата FASTA для последующей обработки в программах, осуществляющих выравнивание аминокислотных последовательностей.
Для изучения степени гомологии в ряду тубулина были использованы, только аминокислотные последовательности тех белков, первичная структура которых полностью определена. Множественное выравнивание проводилось при помощи программы ClustalX(ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/ClustalX/) версии 1.81. Мы остановили свой выбор на этой программе, так как она обладает следующими достоинствами:
• является свободно распространяемой;
• обладает несколькими алгоритмами выравнивания и гибкими настройками этих алгоритмов;
• существуют версии под различные операционные системы (DOS, Windows, Unix-подобные, Macintosh);
• результаты представляются в графическом виде и сохраняются в текстовом файле.
При выравнивании мы использовали алгоритм «Slow-Accurate» (основанный на динамическом программировании) и матрицу весов аминокислот «Identity matrix». Алгоритм «Slow-Àccurate» выполняет наиболее точное выравнивание и не зависит от других настроек, которые используются только для начального приближения (математическая модель приведена в описании к программе).
Данные по пространственному строению белков нами были получены из банка Protein Data Bank (PDB) (http://www.rcsb.org/pdb/index.html). В момент выполнения работы этот банк содержал четыре модели пространственной структуры тубулина, полученные при помощи рентгеноструктурного анализа. Поскольку все эти белки имеют одинаковую первичную структуру, мы выбрали модель, полученную с самым большим разрешением. Такой структурой является 1JFF, выполненная с разрешением 3,50 Â [4]. В качестве инструмента визуализации и вычислений мы использовали программу DeepView / Swiss-PdbViewer (http://www.expasy.ch/spdbv/) версии 3.7. Эта программа распространяется бесплатно, в отличие от широко известных коммерческих продуктов, таких как ChemCAD, HyperChem, ChemDraw, но не уступает им в функциональности, а по некоторым позициям даже превосходит. К достоинствам DeepView можно отнести возможность:
• работать в отдельных слоях;
• работать с отдельными участками молекул (при этом сохраняется сквозная нумерация аминокислотных остатков, в отличие от HyperChem)',
• выполнять выравнивание трехмерных структур по различным алгоритмам;
• выполнять анализ вторичной структуры; .
• рассчитывать положение молекул воды, связанных с белком и/или лигандом;
• рассчитывать межатомные расстояния и углы;
• визуализации в различных представлениях («скелет», Ван-дер-ваальсовы радиусы, вторичная структура, поверхность молекулы и т. д.);
• визуализации в стереоскопическом виде;
• поддержки OpenGL (в том числе для Macintosh);
а также множество других функций.
Результаты и обсуждение. В результате нашей работы была создана база данных, полностью расшифрованных в настоящее время аминокислотных последовательностей а- и ß-тубулинов. База включает в себя 162 секвенса а-тубулинов и 256 секвенсов ß-тубулинов. Организмы, белки которых представлены в этой базе, образуют группу, охватывающую виды от сине-зеленных водорослей до человека, всего 200 видов.
Проведенное множественное выравнивание показало, что степень консервативности для полных последовательностей, проанализированных нами, хорошо согласуется с данными литературы [1] и составляет для а-тубулина около 70%, для ß-тубулина около 80%. Однако приведенная
выше консенсусная последовательность нуждается в уточнении, так как возможна замена третьего глицина на валин, а последнего глицина на аланин (например, в ^-тубулине, выделение»! из кукурузы). Следует отметить, что и для а- и для (^тубулинов не характерны замены первого глицина на другие аминокислоты. Таким образом, эту последовательность можно записать как: 0-0-[0У]-Т-0-[8А]-[вА]. Гомология различных участков молекулы продемонстрирована на графике (рис. 2).
Аминокислотные остатки . Рис. 2. Степень гомологии (%) аминокислотных остатков в ТВА_РЮ (а) (пунктирная линия), и
ТВВ_РЮ(3) (сплошная линия).
Используя трехмерную модель молекулы тубулина, мы определили аминокислоты, лежащие вокруг гуанинового нуклеотида на расстоянии не более 6 А , так как только они могут вступать непосредственно или посредством молекул воды в контакт с ним (рис. 3). В их число входят аминокислоты, образующие упомянутую консенсусную последовательность. Найденные аминокислоты и возможные замены приведены в табл. 2. Характерно, что аминокислоты, лежащие дальше по полипептидной цепи от активного центра, обладают значительно меньшей степенью гомологии. Возможные замены аминокислотных остатков активного центра требуют дальнейшего анализа.
«Глицин-богатая» петля»
Рис. 3. Стереопара пространственной структуры нуклеотид-связывающего центра р-тубулина со связанным ГДФ (черный).
Минимальное расстояние от «глицин-богатой петли» до 03 фосфата — 3,33 А.
Таблица 2. Аминокислотные остатки (аа) нуклеид-связывающих центров а- и ß-тубулинов
Минимальное
а-тубулин ß-тубулин растояние яо нуклеотида, в А * J5 к £ в я О ьЫ
^ § * ч 1 о « х £ §
S t 2 возможные замены № аа по TBBPIG № аа по 1JF1 я я возможные замены 3,5 5 6
10 G G 10 10 G G • •
11 Q Q 11 11 Q QR • • •
12 А ACG 12 12 С АС • • •
13 G G 13 13 G GMR
15 Q Q . 15 15 Q Q • • •
16 I ILMTV 16 16 I IV • *
69 D D 67 69 D D • •
71 Е DEG 69 71 Е Е
74 V PV 72 74 Т TV
99 А AG 97 99 А AG • •
100 А AS ■ 98 100 G G • •
101 N NS 99 101 N N • •
140 S AS 138 140 S S
142 G G 140 142 G G • • • SAG
143 G G 141 143 G G • • G'
144 G GX 142 144 G GV • • • G
145 Т Т 143 145 Т Т • • • Т
146 G G 144 146 G G • • • G
147 S S 145 147 S AS • [SA]
148 G G 146 148 G AG G
171 I CISV 169 171 ' V IV • *
172 Y TWY 170 172 V ACFGILMV
173 Р Р 171 173 р АР «
174 А AS 172 174 S ASV • •
178 S AS" 176 178 S S
179 Т ST 177 179 D DEL • • •
180 А AGS 178 180 Т TV • •
183 Е Е 181 183 Е Е • •
204 V LV 202 204 I IL
206 N N 204 206 N N • • •
209 I CGILV 207 209 L L
210 Y FY 208 210 Y HSY •
224 Y FLY 222 224 Y' FHY
225 Т AEFMRST 223 225 G ADGPQ •
227 L L 225 227 L HL • •
228 N N 226 228 N EN • • • -
231 I IV 229 231 V IV •
Первичная структура 1JFF и TBB_PIG(b) совпадает. ♦http://cn.expasy.org/cgi-bin/nicedoc.pl7PDOGOO 199
Показано, что направленный мутагенез в области активного центра при замещении некоторых аминокислот полностью предотвращает гидролиз GTP и агрегацию тубулина [14]. Полученные нами результаты хорошо согласуются с этой работой. Так, замены в ß-тубулине G143>E, G148>C М149Ж, G150>S, G150>T вызывают проблемы при фолдинге или/и ди- и полимеризации [14]. Таких замен мы не обнаружили в известных природных секвенсах. А мутации по ß M149>F, ß T151>S и a T150>G неотличимы от дикого типа [14]. Возможность данных замен определяется существованием таковых (ß Т151S и a T150G) в дикой природе, a замена M148 на F существует у а-тубулинов. Примененный метод анализа всех расшифрованных аминокислотных последовательностей и дальнейшего их множественного выравнивания позволяет прогнозировать с высокой степенью вероятности результаты экспериментов по сайт-направленному мутагенезу.
Выполнив пространственное выравнивание а-субъединицы с ß-субъединицой, мы обнаружили, что трехмерные структуры центров связывания нуклеотида практически идентичны. На модели видно, что две структуры очень хорошо накладываются друг на друга, а аминокислоты, образующие активный центр, одинаковы (рис. 4). Сходны даже возможные замены той
Рис. 4. Пространственные структуры нуклеотид-связываюших центров а- и (3-тубулинов, выровненных друг с другом.
Белым в черной обводке показана и подписана молекула а-тубулина, черным -Р-тубулина; пунктиром выделены РЭ179-аТ179.
или иной аминокислоты у а- и (3-тубулинов. Например, в положении (3-тубулина ТВВ_РЮ находится аланин, но он может быть заменен в, других (3-тубулинах на цистеин, характерный для а-тубулина. В свою очередь, в а- тубулине в этом же положении цистеин может быть заменен на аланин. Исключение составляет 0(ЕЬ)179 (здесь и далее в скобках указаны возможные варианты замен, встречающиеся в других белках) в |3-тубулине, замененный на Т(Б) а-тубулина, но эти аминокислоты лежат в области рибозы и, скорее всего, не контактируют непосредственно с фосфатными группами. Возможность замены 0179 на Т, или наоборот, является интересной для дальнейшего изучения методом сайт-направленного мутагенеза.
Исходя из функциональных отличий, J. С. Zabala и коллеги высказали гипотезу, что а- и (З-тубулины относятся к различным классам ГТФ-связывающих белков [14]. Из структурного подобия активных центров можно сделать вывод, что функциональные различия а- и р-тубу-линов, скорее всего, не определяются разницей строения связывающих центров. Анализ трехмерной структуры, проведенный нами, позволяет утверждать, что механизм связывания сходен.
Функциональные различия в отношении гидролиза ГТФ, по-видимому, объясняются отличиями между аминокислотами а-и Р-тубулинов, структурно не образующими активный центр, или находит подтверждение гипотеза «синергии». Ее авторы выдвинули предположение, что в гидролизе участвует не только субъединица, образующая «карман» для нуклеотида, но и закрывающая его [2]. В р-тубулине обнаружены зоны на этом участке, сходные по строению с классическими ГТФазами. Также показано, что некоторые мутации в этой области приводят к неспособности тубулина к сборке [2]. Существует,предположение, согласно которому тубулин является собственным ГТФазу-активирующим белком (GAP). Стимуляция гидролиза происходит благодаря синергичному взаимодействию двух субъединиц (а- и (3-), когда они вступают в контакт друг с другом. Такой, механизм близок к известному механизму гидролиза ГТФ G-белками [2]. Исходя из трехмерной модели, J. Lowe с коллегами приходят к выводу, что в р-тубулине с фосфатными группами нуклеотида N-сайта взаимодействует К254, а в а-тубулине с фосфатными группами нуклеотида Е-сайта взаимодействует Е254 [4]. Однако нами установлено, что в природе существуют белки с заменой в а-тубулине К254 на Е, а в Р-тубулине -Е254 на К.
, Как и у других ГТФ-связывающих белков в активном центре тубулина присутствует ион двухвалентного металла (Mg2+, Са2+), взаимодействующий с гуаниновым нуклеотидом. Ранее [10] на основе анализа методами молекулярной механики и квантовой химии были предложены различные варианты строения Е- и N-сайтов тубулина, с учетом ионов Mg2+ и Са2+. В них Е-сайт тубулина связывает кислороды у и Р фосфатных групп ГТФ с ионом магния в тетра-эдрической конфигурации, в то время как N-сайт предпочтительно связывает ион кальция в октаэдрической конфигурации. Зафиксировать атом металла при рентгеноструктурном анализе в Р-тубулине до настоящего времени не удалось. Но существуют модели а-тубулина, демонстрирующие положение иона Mg2+. Трехмерное выравнивание а- и р-тубулина позволяет предположить местонахождение иона двухвалентного металла в активном центре Р-тубулина и выполнить расчеты координационного комплекса.
В дальнейшем предполагается сравнить центры связывания нуклеотида в тубулине и других G-белках. В предварительных исследованиях нами было обнаружено, что вторичные структуры участков, образующих в них нуклеотид-связывающий центр, подобны.
Summary
Vas'kov Yu. /., Stefanov V. E. Comparative analysis of tubulin GTP-binding sites.
Up-to-date methods of bioinformatics (multiple alignment of amino acids sequences, visualization of spatial structure of molecules and three-dimensional structural alignment) were used for the analysis of all decoded amino acid sequences of a. (3 tubulins. On the basis of a three-dimensional model of the tubulin molecule, amino acids distant from GTP for no more than 6 A are identified. According to three-dimensional alignment amino acids participating in the formation of the GTP-binding site are practically identical. Therefore, different functional performance of the subunits cannot be accounted for by structural properties of their GTP-binding sites. The applied methods can be helpful in planning and predicting results of the experiments on site-directed mutagenesis.
Литература
1. Burns R. G. and Surridge C. D. Functional role of a consensus peptide which is common to a-, p-and y-tubulin, to actin and centractin, to phytochrome A, and to the TCP la chaperonin protein // FEBS Lett. 1994. Vol. 347. P. 105-111. 2. Erickson H. P. Atomic structures of tubulin and FtsZ // Trends In Cell Biol. 1998. Vol. 8, P. 133-137.3. Hirose K., Amos W. В., Lockhar, A., Cross R. A. and Amos L. A. Three-Dimensional Ciyoelectron Microscopy of 16-Protofilament Microtubules: Structure, Polarity, and Interaction with Motor Proteins // J. Struct. Biol. 1997. Vol. 118. P. 140-148. 4. Lowe J., Li, H., Downing К. H. and Nogales E. Refined Structure of ab-Tubulin at 3.5 E Resolution// J. Mol. Biol. 2001. Vol. 313. P. 1045-1057.5. Luduena R. F. Multiple forms of tubulin: different gene products and covalent modifications // Int. Rev. Cytol. 1998 Vol. 178. P. 207-275. 6. McKeanP. G„ Vaughan S. and Gull K. The extended tubulin superfamily // J. Cell Science. 2001. Vol. 114. P. 2723-2733. 7. Nogales E., Downing K. #., Amos L. A. and Lowe J. Tubulin and FtsZ form a distinct'family of GTPases // Nat. Struct. Biol. 1998a. Vol. 5. P. 451-458. 8. Nogales E., WolfS. G. and Downing К. H. Structure of the alpha beta tubulin dimer by electron crystallography // Nature. 1998b. Vol. 391. P. 199-203. 9. Oakley С. E. and Oakley B. R. Identification of g-tubulin, anew member of the tubulin superfamily encoded by mipA gene of Aspergillus nidulans // Nature. 1989. Vol. 338. P. 662-664. 10. Stefanov V. E„ TulubA. A., Pavlenko V. K., KutinA. A. Mg2+ and Ca2+ ions bind differently to E-, N-tubulin sites manifesting different mechanisms of action in tubulin assembly //Anales de Quimica Int./ Ed. 1998. Vol. 94. P. 250-257. 11. Stewart R. J:, Farrell K. W. and Wilson L. Role of GTP hydrolysis in microtubule polymerization: evidence for a coupled hydrolysis mechanism // Biochemistry. 1990. Vol. 29. P. 6489-6498. 12. Tran P. Т., Jos hi P. and Salmon E. D. How Tubulin Subunits Are Lost from the Shortening Ends of Microtubules // J: Struct Biol. 1997. Vol. 118. P. 107-118. 13. Vandecandelaere A., Brune M, Webb M. R., Martin S. R. and Bayley P. M. Phosphate release during microtubule assembly: what stabilizes growing microtubules?//Biochemistry. 1999. Vol. 38. P. 8179-8188.14. ZabalaJ. C., FontalbaA. andAvilaJ. Tubulin folding is altered by mutations in a putative GTI^binding motif // J. Cell Science.v1996. Vol. 109. P. 1471-1478.
Статья поступила в редакцию 14 декабря 2003 г.
