CC BY
18
Экспериментальные исследования
© В.В.Барабанова, О.Н.Береснева, 1997 г.
УДК 612.015.1.019:[611.16-018:616.36+616.61-008.64-092.9
В.В.Барабанова, О.Н.Береснева
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕПАТОЦИТОВ И МИКРОСОСУДОВ ПЕЧЕНИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИПЕРПАРАТИРЕОЗЕ И ХРОНИЧЕСКОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ У КРЫС
Научно-исследовательский институт нефрологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова, Россия
РЕФЕРАТ
Проведено гистохимическое исследование активности ферментов ЛДГ, СДГ, НАДФ- и НАД-Нг-депщрогеназ гепатоцитов, 1ДФ эндотелия микрососудов печени крыс, подвергнутых нефрэктомии и инъецированных ПТГ. Показано, что ПТГ и нефрэктомия влияют как на митохондриальные, так и на цитоплазматические окислительно-восстановительные процессы в печени. Существенная роль в регуляции активности исследуемых ферментов принадлежит ионам кальция.
ABSTRACT
In this stady were hystochemicaly investigated activity of hepatocytes lactatdehydrogenase, succinatdehydrogenase, NADP-H2-, NAD-Hj-dehydrogenases and liver microvessels endothelia alkaline phosphtase in rats, undergoing renal mass ablation and PTH injected. Showed: PTH and nephrectomia influence both on mitochondrial and cytoplasmic oxidation-reductation processes in liver.
Ключевые слова: гепатоцит, ферменты печени , паратиреоидный гормон, хроническая почечная недостаточность.
Key words: hepatocyte, liver enzymes, parathyroid hormone, chronic renal failure.
Введение
Паратиреоидный гормон ( ПТГ) является одним из патогенетических агентов, обуславливающих метаболические сдвиги при хронической почечной недостаточности (ХПН) [6]. Это вызвано тем, что при уменьшении массы функционирующих нефронов происходит снижение фильтрации ряда гормонов, в том числе и ПТГ, уменьшается скорость инактивации его фрагментов, увеличивается содержание их в крови [5]. В свою очередь, это приводит к нарушению обмена кальция. Резкое увеличение
поступления кальция из внеклеточной жидкости в клетку способствует нарушению функции клеток, их гибели |4|.
Печени принадлежит ключевая роль в расщеплении молекулы интактного ПТГ, а следовательно, и в регуляции гомеостаза кальция. Между тем имеются лишь единичные работы, касающиеся роли ПТГ и ионов кальция в осуществлении процессов, происходящих в печени [7].
В связи с тем, что при экспериментальной нефрэктомии (НЭ) имеет место увеличение ПТГ в крови животных, представляет определенный интерес проведение сравнительного анализа функциональной активности гепатоцитов и микрососудов печени у животных, подвергнутых НЭ и инъецированных ПТГ. Одним из наиболее информативных методов, позволяющих получить объективную информацию о функциональной активности клеток печени, является количественная гистоэнзимология.
Материал и методы
Для создания модели экспериментального гиперпаратиреоза 45 крысам-самцам линии \Vistar в течение 7 дней внутрибрюшинно вводили ПТГ в дозе 10 ед. на 100 г массы тела в день.
Для создания модели экспериментальной ХПН 25 крысам была выполнена билатеральная резекция 5/6 массы почечной ткани [3]. Операция проводилась в два этапа с интервалом в одну неделю. Контролем служили интактные крысы-самцы линии '\\^81аг.
Том 1, N2
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
После забоя кусочки ткани печени замораживали в жидком азоте. В микротоме-криосгате МК-25 изготавливали срезы толщиной 10 мкм, на которых выявляли следующие ферменты: сукцинатдегидрогеназу (СДГ), лактатдегидроге-назу (ЛДГ) по Нахлассу и Зелигману, НАДФ-Н:- и НАД-Н;-дегидрогеназы с помощью реакции с тетранитросиним тетразолием, щелочную фосфатазу (ЩФ) методом азосочетания. Активность ферментов оценивалась количественно прямым фотоэлектрическим методом в пери-нуклеарных участках цитоплазмы гепатоцитов и эндотелии микрососудов печени (ЩФ). На каждом препарате проводилось измерение активности 100 точек.
Статистическая обработка данных проводилась по программе " С АНТ АД" [5]. Сравнение средних проводили с помощью критерия Сгыо-дента.
Результаты
Количественный гистоэнзимологический анализ выявил существенные изменения активности ферментов в перинуклеарных отделах цитоплазмы гепатоцитов крыс после 7 дней введения ПТГ и через 30-60 дней после НЭ (таблица).
Так, у крыс с экспериментальным гаперпа-ратиреозом гормон вызывает достоверное снижение активности ЛДГ в перинуклеарной зоне цитоплазмы гепатоцитов в среднем на 22% по сравнению с контролем. Активность СДГ увеличивается на 30%. Введение ПТГ приводило также к достоверному увеличению активности НАДФ-Н,- и НАД-Н;-дегидрогеназ гепатоцитов на 60% и 38%, соответственно.
В наших опытах установлено, что наряду с изменением активности ферментов в гепатоцитах
при 7-дневном введении ПТГ наблюдалось изменение функциональной активности эндо-телиальных клеток микроциркуляториого русла печени. Гормон вызывал повышение активности ЩФ в эндотелии микрососудов печени экспериментальных животных в среднем на 45% по сравнению с активностью фермента, зарегистрированной у контрольной группы крыс.
Гистоэнзимологический анализ показал, что и уменьшение массы функционирующих нефронов у крыс приводит к достоверному снижению активности ЛДГ на 30 - 60-е сутки после НЭ. К 60-м суткам эксперимента активность ЛДГ снижается на 31% по сравнению с контролем. Активность СДГ в ходе эксперимента меняется дважды. На 30-е сутки после НЭ регистрируется повышение активности фермента в среднем на 68%, а на 60-е сутки - снижение активности. Активности НАДФ-Н,- и НАД-Н,-цегидрогеназ достоверно увеличиваются в течение всего срока наблюдения по сравнению с активностью данных ферментов в группе контрольных животных. Следует отметить, что у крыс, подвергнутых НЭ, уровень ПТГ в сыворотке крови в 2 - 2,5 раза превышал контрольные значения.
Обсуждение
Полученные результаты показали, что парат-гормон и НЭ влияют как на митохондриальные, так и на цитоплазматические окислительно-восстановительные процессы в печени, связанные с циклом Кребса, пентозофосфатным шунтом и системой анаэробного гликолиза. Учитывая, что цикл Кребса через фумаровую кислоту связан с циклом синтеза мочевины, можно предположить, что активация СДГ в гепатоцитах косвенно
Влияние ПТГ и НЭ на активность фсрментоп гепатоцидов и микрососудов печени крыс
Ферменты Контроль ПТГ Нефрэктомия
30 дней 60 дней
ЛДГ СДГ НАДФ-Н ,-дегидрогеназа НАД-Н ,-дегидрогеназа ЩФ Ы 24,3± 0,81* 18,9± 0,42* 19,03± 0,64* 18,0± 1,0* 6,3± 0,52 19,2± 0,91* 24,8± 0,65* 32,1± 1,3* 25,0± 1,2* 17,3± 1,2* 31,0± 1,3* 23,9± 0,90* 44,б± 1,2* 18,2± 1,3 15,0± 0,89 29,6± 1,2 45,0± 1,3
15,0± 1,3 8,2± 0,45* 4,0± 0,41
* Различия достоверны, Р<0,01.
свидетельствует об активации синтеза мочевины гепатоцитами. Как известно, НАДФ-Н2- дегидро-геназа маркирует общую активность гексозомоно-фосфатного пути метаболизма глюкозы, который является основным источником синтеза пентозо-фосфатов, и его активация предполагает интенсификацию процессов внутриклеточного синтеза. Повышение активности данного фермента свидетельствует об активации в гепатоцитах процессов синтеза белков и нуклеотидов. Повышение активности НАД-Н2-дегидрогеназы может свидетельствовать об увеличении энергетических потребностей клеток, направленных на осуществление процессов синтеза веществ.
Не исключено, что одним из факторов, вызывающих активацию дегидрогеназ гепатоци-тов, может являться дополнительный вход в клетки ионов кальция под влиянием IГГГ, содержание которого повышается как при введении гормона животным, так и после удаления массы функционирующих нефронов. Скоротечное повышение содержания ионов кальция в цитозоле клеток печени может запускать определенную последовательность реакций [б]. Важную роль в этом случае играет цАМФ, который начинает фосфорилирование протеиназ, катализирующих различные клеточные реакции.
Снижение активности СДГ, которое мы наблюдали на 60-е сутки эксперимента, может быть связано с перегрузкой митохондрий гепатоцитов ионами кальция. Известно, что перегруженная кальцием митохондрия не может поддерживать окислительное фосфорилирование, наблюдается ингибирование активности дыхательных ферментов [2]. В конечном итоге, перегрузка клетки ионами кальция может привести к расстройству энергетического запаса, существенно изменить функцию ферментов мембраны, рецепторов и каналов и, в конечном итоге вызвать гибель клетки.
Одновременно с изменением активности ферментов в гепатоцитах у исследуемых групп животных изменялась активность трансэндотели-ального транспорта в микрососудах печени, о чем свидетельствует изменение активности ЩФ в эндотелиальных клетках сосудов. Возможно, что снижение активности трансэндотелиального транспорта, которое мы наблюдали к 60-м суткам после НЭ также может быть связано с накоплением в клетках эндотелия микрососудов печени ионов кальция.
Заключение В целом, полученные результаты позволяют считать, что под влиянием ПТГ у крыс происходит комплексная перестройка внутриклеточного метаболизма печени и изменение морфо-функционального состояния портальных сосудов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Равкин И.А. Некоторые методы математической обработки гистоэнзимологических данных.// Введение в количественную гистохимию ферментов/Ред. Т.Б. Журавлева, Р.А. Прочуханов.- М.: Медицина, 1978,- С. 184-196.
2. Borgers М., Liuc S. Changes in ultrastructure and Ca distribution in the isolated working heart after the ishemia// Amer. J.Pathol.- 1987,-Vol.26, N 1.-P.92-102.
3. Capiod Т., Noel J., Combetter L., Claret M., Cyclic AMP-evo-ked ascillation of intracellular [Ca" ] In guinea-pig hepatocytes // Biochem. J.-1991.- Vol.275.-P.277-280.
4. Cheung J.J., Bonventre J.V., Malis C.D., Jeaf A. Calcium and ischemic injury.// N. Eng. J. Med - 1986 - Vol.314, N 26,- P. 1670-1676.
5. Llach F., Massry S. On the mechanism of secondary hyperparathyroidism in moderat renal insufficiency. //J. Clin. Endocrinol. Metab.- 1985 - Vol.61, N 4.-P.601-606.
6. Massry S.G., Goldstein D.A. Role of parathyroid hormone in uremic toxicity.//Kidney Int.- 1978,-Vol.13, N 8.-P.39-42.
7. Nllius B. Calcium and liver cell death.//Wiss. Beltr. M.-Luther-Univ. Halle-Wittenberg.- 1987.-N 99,- P. 108-122.
