CC BY
176
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 2, 2012
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012
УДК 616-006.448-06:616.153.962.4]-074:543.545
Т. В. Фомина, О. В. Островский, В. Е. Веровский
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ БЕЛКОВ
сыворотки крови в диагностике миеломной болезни
Волгоградский государственный медицинский университет
При выборе технологии электрофоретического фракционирования белков сыворотки крови, помимо аналитических характеристик, следует учитывать и экономическую составляющую. Авторами проведено сравнение двух технологий электрофореза, предлагаемых НПО "Астра" (Россия) и фирмой PZ Cormay S. A. (Польша), с точки зрения их применимости в рутинной лабораторной практике, в частности в диагностике миеломной болезни. Установлено, что при сопоставимых экономических, "потребительских" и аналитических характеристиках технологий в диагностическом процессе более предпочтительно применение технологии в агарозном геле (PZ Cormay S. A.).
Ключевые слова: электрофоретическое фракционирование, белки, миеломная болезнь
T.V. Fomina, O.V Ostrovsky, VE. Verovsky
THE COMPARATIVE ANALYSIS OF ELECTROPHORETIC FRACTIONATING OF BLOOD SERUM
proteins in diagnostics of multiple plasma cell myeloma
The choice of technology of electrophoretic fractionating of blood serum proteins is determined, besides the analytical characteristics, by its economic component. The electrophoresis technologies developed by the R&D production facility "Astra» (Russia) and the firm "PZ Cormay S.A.» (Poland) are comparedfrom a viewpoint of applicability in routine laboratory practice and diagnostics of multiple plasma cell myeloma in particular. It is established that under the comparable economic, "consumer» and analytic characteristics of technologies in the diagnostic process the application of the technology in agarose gel ("PZ Cormay S.A.») is more preferable.
Key words: electrophoretic fractionating, protein, multiple plasma cell myeloma
Гипергаммаглобулинемия с моноклональной секрецией - ведущий тест в диагностике парапротеинемиче-ских гемобластозов, которые можно определить методом электрофореза (ЭФ) сывороточных белков и белков мочи. Метод относится к полуколичественным и с трудом поддается стандартизации [4, 6, 8]. В настоящее время разработаны и усовершенствованы разные методики электрофоретического разделения. Более того, доступны коммерческие наборы готовых носителей для ЭФ, что, с одной стороны, увеличивает стоимость анализа, а с другой - позволяет улучшить как аналитические характеристики, так и стандартизацию метода [7]. Однако, несмотря на достаточно широкую линейку оборудования для ЭФ, работ по сравнению их характеристик в литературе нет. Целью исследования стало сравнение двух технологий электрофоретического фракционирования сыворотки крови по аналитическим и экономическим характеристикам.
Материалы и методы. Мы апробировали два подхода к проведению электрофореза: 1) технология, предлагаемая НПО "Астра" (Россия); матрица - ацетатцеллюлозная пленка; 2) "ручная" технология с применением камеры деления Helena M1 и агарозных гелей производства "PZ Cormay s. A." (Польша; далее технология Cormay).
Все исследования осуществляли в соответствии с инструкциями производителей оборудования [1].
Для проведения исследования взяты контрольная сыворотка Kemtrol Normal, 24 образца сыворотки здоровых доноров, 106 образцов сыворотки пациентов Вол-
Для корреспонденции:
Фомина Татьяна Владимировна, аспирант каф. теоретической и клин. биохимии.
Адрес: 400006, Волгоград, ул. Дзержинского, 19/116.
Телефон: 8-927-062-44-55.
E-mail:tvfomina@gmail.com
гоградского областного клинического онкологического диспансера № 1 (диагноз: миеломная болезнь). Среди всех пациентов первично диагностированных было 10, с прогрессированием заболевания - 4, находящихся на химиотерапии или сразу после курса - 85, в состоянии ремиссии - 7.
Расчет аналитических характеристик сравниваемых технологий (чувствительность, специфичность, эффективность) проведен по ГОСТ Р 53022.3-2008 [2]. В связи с отсутствием в литературе четких протоколов исследования "потребительских свойств" оборудования, программного обеспечения (ПО) и расходных материалов для электрофореза нами была разработана 5-балльная шкала: 1 - очень плохо, 2 - плохо, 3 - хорошо, 4 - очень хорошо, 5 - отлично. Респондентов просили оценить такие свойства систем, как надежность, эргономичность, качество носителя и красителя, доступность и простота инструкций, интерпретируемость результатов. В опросе приняли участие 12 врачей клинической лабораторной диагностики (КЛД), работающие с данным типом оборудования.
Результаты и обсуждение. Результаты определения "потребительских свойств" исследуемых технологий электрофореза представлены в таблице.
По параметру эргономичности низкая оценка была поставлена технологии Cormay, так как для количественной оценки электрофореграмм применялось ПО сторонних разработчиков (Image J., version 1.38 [12, 13]), не предназначенное для выполнения этой операции. Нерусифицированный интерфейс, отсутствие автоматической обработки пиков (субъективность оценки и невозможность стандартизации) и распечатки готового бланка результата - все это создавало проблемы для пользователей. Из плюсов программы можно отметить ее доступность (условно бесплатная) и способность анализировать пики вне зависимости от их величины.
Лицензионное ПО "Анализ ФСК", разработанное
16
БИОХИМИЯ
Сравнительная оценка (в баллах) "потребительских свойств" оборудования и программного обеспечения для электрофореза
Критерии оценки Технология "Астра" Технология "Cormay"
Эргономичность ПО 4,25 2,0
Надежность оборудования 4,75 5,0
Качество матрицы и красителя 3,5 4,25
Доступность и простота инструкций 4,25 4,25
Интерпретируемость результатов 3,75 4,0
Суммарно 20,5 19,5
специалистами НПО "Астра", тоже не получило высшей оценки в связи с "неприспособленностью" для анализа "патологии", т. е. денситограмм, резко отличающихся от нормальных, где гамма-фракция превышала полосу альбумина. В этих случаях количественное определение фракций значительно затруднено. Из плюсов программы операторы отметили возможность печати готового протокола анализа, автоматическую обработку пиков с возможностью ручной корректировки и русский язык интерфейса.
Надежность оборудования - интегральный показатель, характеризующий длительность безотказной работы. Единственной причиной "отказа" системы для технологии "Астра" стала проблема совместимости программы "Анализ ФСК" и оборудования при подключении нового сканера и принтера.
По принятым международным правилам первоначальная оценка результатов электрофореза белков (выявление нормы или патологии) должна проводиться визуально, путем сравнения с картиной нормальной сыворотки, а количественные данные предназначены только для документирования результатов и динамического наблюдения [6, 9, 10].
Возможность визуальной оценки результатов определялась прежде всего качеством матрицы и применяемого красителя. Ацетатцеллюлозная матрица, применяемая при электрофорезе на УЭФ "Астра", имеет ряд
г/л
Рис. 1. Диаграмма рассеяния результатов электрофоретического определения гамма-фракции сыворотки крови на ацетате целлюлозы (ось ординат) и в агарозном геле (ось абсцисс).
существенных недостатков: низкая пропитываемость (снижение качества разгонки), потеря отчетливости и яркости полос в процессе высыхания пленки (невозможность повторного сканирования и анализа электро-фореграмм). К плюсам этого носителя можно отнести относительную дешевизну и доступность для рутинных лабораторий.
Перечисленные недостатки устранимы при использовании в качестве носителя готовых пластин с агарозным слоем, реализованных в технологии Cormay. Такие матрицы не нужно пропитывать (хранятся в буферном растворе), краситель прочно связывается с белками, и после высушивания пластины готовы к анализу.
Доступность и простота инструкций для обеих технологий были оценены респондентами как очень хорошие.
Что касается критерия интерпретируемость результатов, то врачи отметили, что интерпретировать "патологические" сыворотки на ПО "Анализ ФСК" было проблематично и поставили под сомнение возможность применения данной технологии.
В итоге по "потребительским свойствам" исследуемые технологии набрали практически одинаковое количество баллов, что не позволяет использовать данную категорию характеристик в качестве критерия выбора для применения в условиях клинико-диагностической лаборатории.
Нами проведено определение аналитических характеристик технологий при выявлении синдрома гипер-гаммаглобулинемии.
В литературе единого мнения о количественном диагностическом пороге М-градиента сыворотки крови не сформировано, большинство исследователей сходятся на величине 30 г/л [3, 9-11]. В большинстве случаев при уровне М-компонента 30 г/л и более он практически полностью представляет у-фракцию глобулинов на электро-фореграмме. В связи с этим при оценке М-компонента нами учитывалась величина всей у-глобулиновой фракции. При использовании обеих технологий получены одинаковые результаты расчета аналитических характеристик для группы впервые выявленных пациентов (порог принятия клинического решения 30 г/л): диагностическая специфичность 100%, диагностическая чувстви-
Рис. 2. График Бланд--Альтмана для результатов электрофоретического определения гамма-глобулиновой фракции на ацетате целлюлозы и в агарозном геле.
Здесь и на рис. 4: по оси абсцисс - среднее значение содержания, по оси ординат - среднее значение отклонений.
17
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 2, 2012
г/л
Рис. 3. Диаграмма рассеяния результатов электрофоретического определения альбуминовой фракции сыворотки крови на ацетате целлюлозы (ось ординат) и в агарозном геле (ось абсцисс).
тельность 75%, диагностическая эффективность теста 92,3%. Таким образом, различий в чувствительности, специфичности и эффективности между тестами не выявлено. Это позволяет сделать вывод о сходной способности технологий выявлять патологически повышенный уровень иммуноглобулинов.
Диаграмма рассеяния результатов определения у-фракции по двум технологиям (рис. 1) в целом указывала на их высокую степень связанности (R2 = 0,88, тангенс угла наклона не отличается от единицы).
Однако представление данных в виде графика Бланд-Альтмана (рис. 2) показало, что использование технологии "Астра» в критичной для диагностики области 16-30 г/л в 3,8% случаев приводило к завышению результатов на величину выше +1о относительно среднего смещения. Напротив, в области патологических значений показателя (> 30 г/л) результаты по той же технологии оказываются существенно заниженными (6,6% случаев).
Частичное объяснение данной тенденции можно получить, анализируя результаты определения альбуминовой фракции (рис. 3, 4), поскольку процентное содержание альбумина и глобулинов - величины взаимосвязанные.
Исходя из диаграммы рассеяния (см. рис. 3), можно предположить, что вариация результатов анализа по технологии "Астра» связана с реальной вариацией содержания аналита примерно на 40-50% (R2 = 0,32, тангенс угла наклона 0,48 ± 0,07). По-видимому, это и является причиной переоценки вклада фракции альбумина при низком содержании белка и недооценки - при высоком (см. рис. 4), т. е. в условиях патологически увеличенной продукции у-глобулинов, как это происходит при миеломной болезни.
Сравнение технологий по себестоимости анализа. Расчет себестоимости лабораторного теста проводили согласно приложению № 13 приказа № 380 Минздрава РФ [5]. Расчетная норма времени проведения электрофореза на ацетатцеллюлозных пленках зафиксирована в приложении № 12 того же приказа, для агарозных гелей хронометраж проводился самостоятельно. В себестоимость анализа как необходимая составляющая входила себестоимость определения общего белка сыворотки крови биуретовым методом, так как без этого невозможно рассчитать абсолютные концентрации белковых
Рис. 4. График Бланд--Альтмана для результатов электрофоретического определения фракции альбумина на ацетате целлюлозы и в агарозном геле.
фракций. Себестоимость анализа составила 214 и 254 руб. для технологий "Астра» и Cormay соответственно.
Таким образом, при сопоставимых экономических, "потребительских" и аналитических характеристиках технологий в диагностическом процессе, на наш взгляд, более предпочтительно применение технологии в агарозном геле. Выбор обусловлен более узким динамическим диапазоном технологии на ацетате целлюлозы, что увеличивает вероятность недооценки вклада у-фракции в области пороговых значений 16-30 г/л и выше.
ЛИТЕРАТУРА
1. Анализ фракций сыворотки крови. Руководство пользователя. 643.45312116.00001-01 34 01-ЛУ - Уфа, 2007.
2. ГОСТ Р 53022.2-2008. Технологии лабораторные клинические. Требования к качеству клинических лабораторных исследований. Ч. 2. Оценка аналитической надежности методов исследования (точность, чувствительность, специфичность). - М., 2008.
3. Моисеев С. И., Салогуб Г. Н., Степанова Н. В. Современные принципы диагностики и лечения множественной миеломы: Пособие. - СПб., 2006.
4. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. - М., 1981.
5. Приказ МЗ РФ № 380 от 25.12.1997. О состоянии и мерах по совершенствованию лабораторного обеспечения диагностики и лечения пациентов в учреждениях здравоохранения Российской Федерации. Приложение № 13. Расчет себестоимости лабораторного анализа. - М., 1997.
6. СергееваН. А. // Клин. лаб. диагн. - 1999. - № 2.
7. Шевченко О. П., Долгов В. В., Олефиренко Г. А. Электрофорез в клинической лаборатории. I. Белки сыворотки крови. - М., 2006.
8. Bossuyt X., Bogaerts A., Schiettekatte G., Blanckaert N. // Clin. Chem. - 1998. - N 5. - P. 944-949.
9. CookL., MacdonaldD. H. C. // Postgrad. Med. J. - 2007. - Vol. 83. - P. 217-223.
10. International Myeloma Working Group // Br. J. Haematol. - 2003. -Vol. 121. - P. 749-757.
11. NCCN. Clinical practice in oncology: Multiple Myeloma V.2.2009 // National Comprehensive Cancer Network Guidelines. http://www. nccn.org/professionals/physician_gls/PDF/myeloa.pdf
12. http://rsbweb.nih.gov/ij/
13. www.originlab.com
Поступила 02.12.10
18
