CC BY
69
■ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕЖДИСЦИПЛИНАРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК И ПРОВЕДЕНИЯ ВОЗБУЖДЕНИЯ В ВЕНТРИКУЛЯРНЫХ КАРДИОМИОЦИТАХ, ПОЛУЧЕННЫХ ОТ ЗДОРОВОГО ИНДИВИДА И ПАЦИЕНТА С СИНДРОМОМ УДЛИНЕННОГО ИНТЕРВАЛА О-Т
ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ
Агладзе Константин Игоревич -кандидат физико-математических наук, заведующий лабораторией биофизики возбудимых систем Московского физико-технического института (государственного университета) (Долгопрудный, Московская область) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9258-436X
Ключевые слова:
индуцированные плюрипотентные клетки, LQTS, KCNH2
Цвелая В.А., Слотвицкий М.М., Фролова Ш.Р.-кызы, Агладзе К.И.
Московский физико-технический институт (государственный университет), Долгопрудный, Московская область
В настоящее время известно, что в основе большинства сердечных тахиаритмий лежат циркулирующие волны возбуждения - ре-ентри. Развиваемые в последнее время тканево-инже-нерные модели сердечной ткани при использовании оптического картирования позволяют интерактивно наблюдать распространение возбуждения, регистрировать образование ре-ентри в результате взаимодействия волн возбуждения с различными анатомическими препятствиями и видеть непосредственный ответ распространяющихся волн и ре-ентри на фармакологические препараты. Открытие S. Yamanaka в 2006 г. индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и клеточного репрограммирования открывает новые возможности получения кардиомиоцитов человека и делает тканево-инженерные модели потенциально особенно перспективными. Более того, для ряда заболеваний сердца, таких, например, как синдром удлиненного интервала Q-T (Long QT Syndrome, LQTS), не существует адекватных животных моделей, поэтому использование человеческих тканей становится незаменимым.
Подробное знание механизмов формирования ре-ентри может значительно повысить эффективность скрининга потенциальных антиаритмиков, а также разработать схемы лечения, позволяющие избегать тяжелых побочных явлений, таких, например, как лекарственно-индуцированный синдром удлиненного интервала Q-T(aLQTS) и ранняя постдеполяризация. В нашей работе мы изучали особенности генерации и проведения возбуждения в человеческих кардиомиоцитах, полученных репрограммированием от пациентов с синдромом удлиненного интервала Q-T, тип 2 (LQT2), вызванного мутацией p.T613M в гене KCNH2. Изучались основные характеристики здоровых и мутантных клеток и клеточных слоев. Ионные токи, измеренные методом patch-clamp на отдельных клетках, и характеристики волны возбуждения в клеточных слоях, несущих гетерозиготную мутацию p.T613M в гене KCNH2, сравнивались с аналогичными, измеренными в культивированных кардиомиоцитах, полученных от здоровых индивидов. Было обнаружено, что в слоях мутантных клеток, помимо удлинения потенциала действия, наблюдаются пониженная частота спонтанной активности и повышенная вероятность нарушения единого ритма, задаваемого пейсмекерными клетками. Клин. и эксперимент. хир. Журн. им. акад. Б.В. Петровского. 2018. Т. 6, № 3. С. 6-15. doi: 10.24411/2308-1198-2018-13001.
Статья поступила в редакцию: 27.06.2018. Принята в печать: 10.08.2018.
Comparative analysis of electrophysiological characteristics and excitation conduction in ventricular cardiomyocytes obtained from a healthy individual and a patient with the syndrome of long QT interval
Tsvelaya V.A., SLotvitsky M.M., Frolova Sh.R.-kyzy, Agladze K.I.
Moscow Physical Technical Institute (State University), Dolgoprudny, Moscow Region
Currently, it is known that most cardiac tachyarrhythmias are caused by the circulating excitation waves - reentry. The tissue-engineering models of cardiac tissue developed recently and employing optical mapping allow interactively observe the excitation propagation, record the formation of the reentry as a result of the interaction of excitation waves with various anatomical obstacles and see the direct response of propagating waves and the reentry to pharmaceuticals. The discovery of induced pluripotent stem cells and cellular reprogramming made by S. Yamanaka in 2006 opens up new possibilities for the production of human cardiomyocytes and makes tissue engineering models potentially promising. Moreover, for a number of cardiac diseases such as drug-induced long QT syndrome (aLQTS) there is no adequate animal model, so the use of human tissues becomes indispensable.
A detailed knowledge of the mechanisms of reentry formation can significantly increase the effectiveness of screening for potential antiarrhythmic drugs, and also develop treatment protocols to avoid serious side effect such as aLQTS and early afterdepolarizations (EADs). In this paper we present results of the characterization of the generation and propagation of the excitation in human cardiac cells obtained by reprogramming from patients with congenital Long QT syndrome, type 2 (LQT2), caused by p.T613M mutation in the KCNH2 gene. The main characteristics of the "healthy"-derived and LQT2-derived cells layers were studied. The ion currents measured by the patch-clamp method on individual cells and the characteristics of the excitation wave in the cell layers carrying the mutation were compared with those measured in cultured cardiomyocytes obtained from the healthy individuals.
It was found that layers of the mutant cells characterized by decreased frequency of spontaneous activity, and increased probability of breaking of the unified rhythm determined by the pacemaker cells in addition to the lengthening the action potential.
Clin Experiment Surg. Petrovsky J. 2018; 6 (3): 6-15.
doi: 10.24411/2308-1198-2018-13001. Received: 27.06.2018. Accepted: 10.08.2018.
CORRESPONDENCE
Agladze Konstantin I. -Candidate of Physical and Mathematical Sciences, Head of the Laboratory of Biophysics of Exritable Systems, Moscow Institute of Physics and Technology (State University) (Dolgoprudny, Moscow Region) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9258-436X
Keywords:
induced pluripotent cells, LQTS, KCNH2
По оценкам Всемирной организации здравоохранения, сердечно-сосудистые заболевания занимают первое место среди причин смертности населения в подавляющем большинстве стран мира. Значительная часть сердечнососудистых заболеваний приходится на нарушения ритма сердца, в частности на тахиаритмии. Наиболее опасны желудочковые тахиаритмии, часто приводящие к фибрилляции желудочков и внезапной сердечной смерти [1]. В настоящее время известно, что в основе большинства сердечных тахи-аритмий лежат циркулирующие волны возбуждения - ре-ентри [2, 3]. За последние 20 лет были созданы системы так называемого оптического картирования возбуждения в сердце, убедительно продемонстрировавшие роль ре-ентри в возникновении тахиаритмий и в переходе к режиму фибрилляции [4-8]. Несмотря на успешное применение оптического картирования целого сердца (обычно
искусственно перфузируемого в так называемых препаратах Лангендорфа [9]) для доказательства возникновения ре-ентри как основы развивающейся тахиаритмии, конкретные биофизические механизмы возникновения реентри в препаратах целого сердца изучать затруднительно. Эта трудность обусловлена сложным строением сердца, а также его трехмерностью, затрудняющей использование методов оптического картирования для регистрации возбуждения, распространяющегося в толще миокарда.
Развиваемые в последнее время тканево-инженерные модели сердечной ткани при использовании оптического картирования позволяют интерактивно наблюдать распространение возбуждения, регистрировать образование ре-ентри в результате взаимодействия волн возбуждения с различными анатомическими препятствиями, видеть непосредственный ответ распространяющихся волн и ре-ентри на фармакологические пре-
параты [10-12]. Открытие S. Yamanaka в 2006 г. индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и клеточного репрограммирования открывает новые возможности получения кардиомиоцитов человека и делает тканево-инженерные модели особенно перспективными [13]. Например, в работе [12] было продемонстрировано сравнение эффективности влияния различных антиаритмических препаратов на динамику ре-ентри в монослое человеческих вентрикулярных кардиомиоцитов. Более того, для ряда сердечных заболеваний, таких, например, как синдром удлиненного интервала Q-T (Long QT Syndrome - LQTS), не существует адекватных животных моделей, поэтому использование человеческих тканей становится незаменимым.
В нашей работе мы изучали особенности генерации и проведения возбуждения в человеческих сердечных клетках, полученных ре-программированием от пациентов с ранее выявленным синдромом удлиненного интервала Q-T. Врожденный LQTS вызывается мутациями в генах, кодирующих сердечные ионные каналы. Мутации нарушают функционирование ионных каналов мембраны сердечных клеток [14]. Частота врожденного LQTS в популяции достаточно низкая (<0,1-0,02%) [15]. Однако совершенно иное значение имеет приобретенный LQTS ^LQTS) [16-19]. Это состояние развивается у 15-20% индивидов в период алкогольной абстиненции, до 50-60% зарегистрированных случаев аLQTS - в процессе лечения антиаритмиками III класса. К развитию аLQTS также приводит лечение некоторыми видами антибиотиков, такими как азитромицин и эритромицин, а также антидепрессантами и нейролептиками (http://www. sads.org.uk/drugs-to-avoid). Опасность удлинения интервала Q-T любой природы проявляется в риске развития сердечных аритмий типа torsade de pointe (TdP), которые с высокой вероятностью могут перейти в фибрилляцию желудочков и сопряжены с высоким риском внезапной сердечной смерти. Причиной возникновения TdP считается ранняя постдеполяризация (EAD). Она проявляется в аномальных колебаниях мембранного потенциала клетки в стадии реполяризации. Было проведено много экспериментальных и вычислительных исследований на одиночных клетках, чтобы установить ионные механизмы образования EAD. Ранняя постдеполяризация возникает в том случае, когда увеличиваются входящие токи через мембрану или уменьшаются выходящие токи либо имеет место и то, и другое. Так, например, сердечная клетка может стать уязвимой для развития EAD при увеличении направленного внутрь тока кальция L-типа (ICaL) и уменьшении проводимости направленных наружу токов, таких
как быстрая (IKr) и медленная (IKs) компоненты калиевого тока задержанного выпрямления. Ранняя постдеполяризация также может произойти из-за патологической динамики кальция в клетке, например кальциевой перегрузки сар-коплазматического ретикулума (SR), что приводит к спонтанному высвобождению кальция и, в конечном итоге, реактивации I при посредничестве тока Na/Ca-обменника (INa/Ca). Несмотря на обилие данных о том, как развивается EAD в одиночных клетках [20, 21], очень мало известно о том, как EADs приводит к аритмии в двумерной ткани и в целом сердце.
Следует заметить, что в настоящее время неизвестен точный механизм перехода к фибрилляции сердца у пациентов с LQTS. Несмотря на надежно установленную связь LQTS с ранней постдеполяризацией, непонятно, как теряется устойчивость распространения возбуждения в сердечной ткани, почему возникают разрывы фронтов, необходимые для образования вращающихся волн типа ре-ентри. Гипотетически предлагаются механизмы, заключающиеся в возникновении крайне неоднородного «рефрактерного хвоста» либо локальной стимуляции от аномальных колебаний мембранного потенциала, попадающей в так называемое «уязвимое окно».
Подробное знание механизмов формирования ре-ентри может значительно повысить эффективность скрининга потенциальных антиаритмиков, а также разработать схемы лечения, позволяющие избегать тяжелых побочных явлений, таких, например, как аLQTS и ранняя постдеполяризация. Так, например, широко используемые для пролонгации плато потенциала действия (как механизма терминации ре-ентри) антиаритмики класса III фактически увеличивают интервал Q-T, что может приводить к ранней постдеполяризации и в ряде случаев чревато внезапной сердечной смертью.
Первым необходимым шагом служит разработка адекватной модели для исследования механизма образования ре-ентри в сердечной ткани с мутациями, вызывающими удлинение интервала Q-T. Поскольку нашей экспериментальной моделью служили кардиомиоциты и слои кардиомиоцитов, полученные методом клеточного репрограммиро-вания, необходимо было изучить их основные характеристики и провести сравнение характеристик клеток, несущих мутацию, с клетками от здорового индивида. Таким образом, в нашей работе ионные токи, измеренные методом patch-clamp на отдельных клетках, и характеристики волны возбуждения в клеточных слоях, несущих мутацию, сравнивались с аналогичными, измеренными в культивированных кардиомиоцитах, полученных от здоровых индивидов.
Материал и методы
Направленная дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в желудочковые кардиомиоциты*
Направленная дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) в кардиомиоциты осуществлялась по протоколу [22]. ИПСК культивировали в течение нескольких пассажей в среде Essential 8™ Medium на пластике, покрытом Geltrex LDEV-Free hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix (ThermoFisher Scientific). Непосредственно перед дифференцировкой клетки пересаживали в лунки диаметром 15 мм на такой же матрикс. Культивация клеток продолжалась до тех пор, пока они не достигнут плотности 80-90%. Дифференцировка инициировалась заменой среды на RPMI 1640, содержащей добавку B27-insulin (Thermo Fisher Scientific) и 12 мкМ CHIR99021 (Sigma-Aldrich), на 24 ч. Дальнейшие этапы дифференци-ровки более подробно приведены в оригинальном протоколе в разделе Gi-WI protocol [22]. Для исследований с иммунофлуоресцентным окрашиванием и patch-clamp дифференцированные клетки дезагрегировали TrypLETM Express (Thermo Fisher Scientific) и пересаживали на поверхности, покрытые 0,1% фактором адгезии (AF Gibco), в среду, содержащую 80% RPMI 1640, 20% эмбриональной бычьей сыворотки и 10 мкМ Y-27632 (StemRD).
Электрофизиологическое исследование методом patch-clamp
Ионные токи регистрировали в одиночных изолированных кардиомиоцитах методом перфорированного patch-clamp в конфигурации whole-cell. В качестве перфорирующего агента использовали амфотерицин Б в диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации 0,24 мг/мл [27]. Эксперименты проводили при комнатной температуре (22-24 °C). Покровные стекла с посаженными на них сердечными клетками помещали в камеру, установленную на предметном стекле. Пипеточный (внутриклеточный) раствор состоял из 150 мМ KCl, 5 мМ NaCl, 2 мМ CaCl2, 5 мМ EGTA, 10 мМ HEPES/NaOH, 5 мМ MgATP (pH 7,2, аналогично при использовании раствора КОН). Раствор внеклеточный, используемый для записи Na^TO^: 50 мМ NaCl, 1,8 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 110 мМ CsCl2, 10 мМ D-глюкозы, 10 мМ HEPES/NaOH (pH 7,4 с помощью CsOH). Пипеточ-ный (внутриклеточный) раствор для регистрации
iSMA6L
if31-5
Рис 1. Конфокальная микроскопия кардиомио-цитов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток: в левой колонке показана экспрессия основных кардиальных маркеров для клеток линии 1БМАб1_; в правой колонке -для линии if31-5. После дифференцировки клетки обеих линий обнаруживают поперечно-полосатую исчерченность
Na^TO^: 135 мМ CsCl2, 10 мМ NaCl, 2 мМ CaCl2, 5 мМ EGTA, 10 мМ HEPES/NaOH, 5 мМ MgATP (pH 7,2 с помощью CsOH). Камерный раствор для регистрации тока Ca2+: 160 мМ TEA-Cl, 5 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ D-глюкозы, 10 мМ HEPES/NaOH (pH 7,4 CsOH). Пипеточный раствор содержал 145 мМ CsCl2, 5 мМ NaCl, 5 мМ EGTA, 10 мМ HEPES/NaOH, 5 мМ MgATP (pH 7,2 с помощью CsOH). Для регистрации токов IKr камерный раствор содержал 150 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 1.8 мМ CaCl2, 15 мМ D-глюкозы, 15 мМ HEPES/KOH (pH 7,4 с помощью NaOH) и пипеточный раствор: 150 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 5 мМ NaCl, 5 мМ MgATP, 5 мМ EGTA, 10 мМ HEPES/KOH (pH 7,2 с помощью KOH) [23]. Пипетки для patch-clamp вытягивали из боросиликатного стекла (BF150-86-10 Sutter Instrument, США) сопротивлением ~3 МО в экспериментальном растворе. После формирования гигаомного сопротивления (GO) емкостные компоненты компенсировали с помощью настроек усилителя. После компенсации сопротивления Ra начинались детектирования токов и потенциала действия с помощью установленных протоколов. При необходимости компенсировалось последовательное сопротивление. Потенциал действия был вызван применением фиксированного тока амплитудой 1 нА в течение 2,5 мс. Токи целой клетки для детектирования натриевого тока Na+ были вызваны по протоколу, представляющему собой нарастающий стимул от -120 до +50 мВ длительностью 200 мс
* Здоровая модельная линия ИПСК и линия с синдромом удлиненного интервала 0-Т, тип 2 (1ДТ2), несущая мутацию р.Тб13М в гене КСШ2, if31-5 были предоставлены С.М. Закияном, Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН.
Рис. 2. Сравнение А frU^ln
кардиомиоцитов, дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток линий ISMA6L и if31-5, с помощью электрофизиологического метода patch-clamp
A. Потенциалы действия кардиомиоцитов контрольной клеточной линии, полученных от здорового индивида и от пациента с LQT2.
Б. Масштабированные быстрые натриевые токи INav кардиомиоцитов контрольной линии и LQT2-линии, записанные в ответ на один и тот же рамп-протокол (от -120 до +50 мВ, 200 мс, поддерживаемый потенциал -80 мВ).
B. Кальциевые токи ICa2+, L-типа тока кардиомиоцитов контрольной линии и LQT2-линии, полученные в ответ на стимул в форме ступени потенциалов от -40 до 0 мВ длительностью 300 мс. Инактивация INav тока была достигнута путем ввода предварительной ступени напряжения от поддерживаемого потенциала -80 до -40 мВ в течение 100 мс.
Г. Калиевые токи IKs и IKr кардиомиоцитов контрольной линии (верхний ряд) и LQT2-линии (нижний ряд). Быстрая (IKs) и медленная (IKr) компоненты калиевого тока задержанного выпрямления получены 5-секундным деполяризующим импульсом в виде ступени потенциалом от -40 до +50 мВ с шагом 10 мВ (при поддерживаемом потенциале -70 мВ). Быстрая (IKs) и медленная (IKr) компоненты калиевого тока задержанного выпрямления получены 5-секундным деполяризующим импульсом от -40 до +50 мВ с шагом 10 мВ (при поддерживаемом потенциале -70 мВ). IKr рассчитывается как хвостовой ток, который появляется после реполяризации.
Рис. 3. Спонтанная электрическая активность линии iSMA6L
А
0,61 с 0,98 с 0,11 с 0,07 с
Врем«..
в
A. Распространение спонтанного возбуждения по монослою кардиомиоцитов, диаметр образца - 15 мм. Время указано в левой верхней части. Возбуждение передается от одних клеток к другим, желтым прямоугольником выделена область, на которой фиксировалась зависимость сигнала от времени (рис. 3Б).
Б. Последовательное возбуждение клеток и их релаксация в выбранной области. Желтыми стрелочками показано направление передачи возбуждения соседним клеткам.
B. Графическая развертка интенсивности сигнала возбуждения кардиомиоцитов линии 15МА61_ с выбранного фрагмента ткани по времени. Пики интенсивности соответствуют максимальному возбуждению выбранного фрагмента монослоя (рис. 3Б). Частота спонтанной активности составляет ~40 уд/мин, что соответствует низким частотам сердечного сокращения у здорового человека в покое.
при поддерживающем потенциале -80 мВ (с использованием ступеньки в начале протокола: от -80 до -120 мВ длительностью 100 мс) [24]. Для записи Са2+-тока 1_-типа без помехи Na+-тока использовали ступенчатый протокол с препульсом от поддерживаемого потенциала от -80 до -40 мВ длительностью 100 мс. Пик тока I измеряли при 0 мВ [25]. Быстрая (I ) и медленная (I ) компоненты калиевого тока задержанного выпрямления получены 5-секундным деполяризующим импульсом от -40 до +50 мВ с шагом 10 мВ (при поддерживаемом потенциале -70 мВ). Как правило, емкость мембран, измеренная с помощью программного обеспечения рС1_АМР10.2, варьировала в диапазоне 20-50 пФ.
Оптическое картирование
Перед процедурой оптического картирования все химические растворы нагревали до 37 °C. Процесс оптического картирования осуществлялся в соответствии с протоколом [26]: образец окрашивали кальций-зависимым флуоресцентным красителем fLuo-4 (AM) в течение 30-40 мин при 37°С в С02-инкубаторе, далее образец промывали раствором Tyrode (Sigma-ALdrich Co., USA, T2145-10L). Образец помещали на термоплейт для поддержания температуры 37 °С. Визуализация волн возбуждения и видеозапись были реализованы с помощью установки, состоящей из флуоресцентного микроскопа OLympus MVX-10 Macro-View и высокоскоростной Andor EM-CCD Camera 897-U.
Рис. 4. Спонтанная 0,9 с активность линии if31-5 при относительно высокой частоте возбуждения. Для рисунков А и Б временная шкала общая
0,95 с
1,06 с
1,46 с
1,57 с
1,72 с
1,96 с
Б
А. Возбуждение небольшого клеточного кластера с высокой аритмичной спонтанной активностью в разные моменты времени. Представлено быстрое повторное клеточное возбуждение клеток после еще не закончившегося периода релаксации.
Б. Временная развертка интенсивности сигнала возбуждения кластера (рис. 4А). Пики интенсивности соответствуют возбуждению монослоя. Частота спонтанной активности составляет порядка 60/мин.
А
Рис. 5. Циркуляция 0,06 с волны возбуждения во времени. Размер образца составляет 15 мм. Желтыми стрелками указано направление распространения фронта волны возбуждения. Желтым кругом показана область, вокруг которой происходит циркуляция
0,14 с
0,25 с
I« Л
0,35 с
0,48 с
0,56 с
у о ч
„ V
J*?
Файл конфигурации был загружен с фиксированными параметрами видеонаблюдения (130 кадров в секунду). Обработка данных была выполнена с использованием программы 1тадеЛ и плагинов для этой программы (http://rsbweb.
nih.gov/ij). Экспериментальный сигнал оптического отображения был обработан для уменьшения шума и лучшего представления волновых фронтов с использованием программы Wolfram Mathematica 9. Процесс оптического картиро-
вания проводился менее 30 мин во избежание чрезмерного стресса для клеток. После процедуры картирования образец дважды промывали раствором PBS. После этого раствор Tyrode заменяли средой RPMI 1640 с добавкой B27. Образец помещали обратно в инкубатор до следующих исследований.
Иммунофлуоресцентное окрашивание
Клетки фиксировали в течение 10 мин в 4% растворе параформальдегида, далее в течение 10 мин содержали в 0,4% растворе тритона-Х100 или 96% этаноле (для TRA-1-60 и TRA-1-81). Иммуно-окрашивание антителами к SSEA-4 проводили без стадии пермеабилизации. Клетки инкубировали в течение 30 мин в блокирующем буфере (1% бычий сывороточный альбумин в фосфатном буферном растворе, PBS) в течение 16 ч при 4°C с первыми антителами, далее в течение 1 ч при комнатной температуре со вторыми антителами. Отмывки от несвязавшихся антител проводили в PBS, 2 раза по 15 мин. ДНК клеток была окрашена DAPI (VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI, Vector, USA, Cat. No. H-1200). Для неспецифического окрашивания f-актина использовали фаллоидин Alexa Fluor 488. Образцы анализировали с использованием инвертированных флуоресцентных микроскопов (Zeiss LSM 710 и Nikon Eclipse Ti-E).
Результаты и обсуждение
Характеризация полученных кардиомиоцитов
Полученные путем направленной дифферен-цировки клетки неоднородны по своему фенотипу. Желудочковые кардиомиоциты легко идентифицируются по механическим сокращениям. Остальные клетки также являются терминально дифференцированными и, как правило, представляют собой фибробласты или другие мезодер-мальные типы клеток, не способные к проведению волны возбуждения и механическим сокращениям. Для дополнительной характеризации клеток применяется метод иммуноцитохимии: положительная экспрессия основных кардиальных маркеров-элементов сократительного аппарата некоторыми клетками говорит об удачной диф-ференцировке. Доля клеток с положительной экспрессией на 12-й день от инициации диффе-ренцировки добавлением СН1Р составляет около 20%. На рис. 1 приведены данные с конфокального микроскопа для 2 исследуемых линий 1'5МА61_ и 1Т31-5 (от человека без врожденных сердечно-сосудистых заболеваний и пациента с подтвержденным 1ЛТ2 соответственно). Клетки
обеих линий показывают положительную экспрессию а-актинина (а1р1ш-асШ1п), сердечного тропонина Т (сТпТ) и тяжелой цепи миозина (МНС). Более того, после 15-го дня дифферен-цировки различается поперечная исчерченность по а-актинину.
Ионные токи в одиночных клетках
Для регистрации потенциалов действия (ПД) к кардиомиоцитам, дифференцированным из ИПСК линий 1БМА61_ и 1Т31-5, применяли стимулы в 1 нА длительностью 2,5 мс с частотой 1 Гц (рис. 2А). Кардиомиоциты для исследования брали на той стадии развития, на которой уже формируется полноценный потенциал действия со всеми потенциал-зависимыми ионными токами, т.е. после 30-го дня от начала дифференцировки ИПСК, как было показано ранее [26]. Рис. 2А демонстрирует запись потенциалов действия для кардиомиоцитов контрольной линии 1БМА61_ (длительностью около 400 мс) и линии, полученной от больного с 1ЛГ2, 1^31-5 (длительностью около 700 мс). Видно, что потенциалы действия сильно отличаются по длительности. Потенциал-зависимые быстрый натриевый ток Шау и кальциевый ток 1_-типа оказались идентичны в кардиомиоцитах обеих линий (рис. 2Б, 2В). Для обнаружения потенциал-зависимого натриевого тока Шау применяли рамп-протокол со стимуляцией потенциалом от -120 до +50 мВ длительностью 200 мс. Потенциал-зависимый кальциевый ток 1_-типа, 1СЛ1уре был получен применением протокола стимуляции потенциалом в виде ступеньки от -40 до 0 мВ длительностью 300 мс.
Для детектирования быстрой I и медленной I компонент калиевого тока задержанного выпрямления был применен стимул в виде ступенек потенциалов от -40 до 50 мВ с шагом в 10 мВ длительностью 5 с (при поддерживаемом потенциале -40 мВ) (рис. 1Г, верхний ряд). Для разделения быстрой (Ш) и медленной (Ш) компонент калиевого тока задержанного выпрямления применяется либо блокатор Ш -с1|готапо1-293, либо блокатор Ш - Е-4031 соответственно, регистрировался либо Ш, либо Ш. Затем заблокированный ток в чистом виде получается путем вычитания из контрольной амплитуды калиевых токов. В данном исследовании мы использовали блокатор Жг Е-4031, который в концентрации 500 нМ/л полностью блокировал Жг. Так, в присутствии Е-4031 в случае кардиомиоцитов, дифференцированных из ИПСК линии !5МА61_ (контрольная), Жг присутствует (рис. 2Г, верхний ряд). В то же время в случае кардиоми-оцитов, дифференцированных из линии 1Т31-5 (от пациента с 1ЛГ2), на рис. 2Г (нижний ряд)
видно, что I отсутствует. Подавленный I объясняет удлиненный ПД кардиомиоцитов линии 1Т31-5 по сравнению с ПД кардиомиоцитов линии КМДбЬ
Оптическое картирование распространения возбуждения
Использование флуоресцентных красителей (А.ио4) и высокочувствительной скоростной камеры позволяет иметь детальную информацию об электрической активности полученных кардио-миоцитов. Так, механические сокращения указывают на наличие клеток со спонтанной электрической активностью. Такие клетки-пейсмекеры способны возбудить соседние кардиомиоциты и запустить волну возбуждения. Это приводит к согласованным механическим сокращениям с частотой, задаваемой пейсмекерами. Анализ информации о распространении волн возбуждения по синцитию для линий 1'5МД61_ приведен на рис. 3: показано проведение при небольших частотах спонтанного возбуждения. Волна распространяется от пейсмекера изотропно и без разрывов, динамика кальция показывает последовательное возбуждение и релаксацию монослоя. Пик интенсивности соответствует возбуждению клеток и нормирован на максимальное значение. Монослой способен проводить имульсы с высокой частотой без нарушений в проведении, все процессы возбуждения и релаксации монослоя последовательны.
В случае линии 1Т31-5, имеющей происхождение от донора с 1ЛТ2, усваиваемые частоты стимуляции существенно отличаются от монослоя линии 1'5МД61_. Частоты спонтанной активности у этой линии гораздо ниже, так как клеткам требуется гораздо больше времени для релаксации, чем клеткам линии 1'5МД61_. Повышение частоты спонтанной активности ведет к тому, что следующий возбуждающий импульс достигает клетки до того, как
Литература/References
1. JaLife J. Ventricular fibrillation: mechanisms of initiation and maintenance. Ann Rev f Physiol. 2000; 62: 25-50.
2. Antzelev'tch C. Basic mechanisms of reentrant arrhythmias. Curr Opin Cardiol. 2001; 16: 1-7.
3. Fenton F., Karma A. Vortex dynamics in three-dimensional continuous myocardium with fiber rotation: filament instability and fibrillation. Chaos. 1998; 8: 20-47.
4. Dawdenko J.M., Pertsov A.V., Salomonsz R., Baxter W., et al. Stationary and drifting spiral waves of exritation in isolated cardiac-muscle. Nature. 1992; 355: 349-51.
5. Cabo C., Pertsov A.M., Baxter W.T., Datfdenko J.M., et al. Wave-front curvature as a cause of slow conduction and block in isolated cardiac-muscle. Circ Res. 1994; 75: 1014-28.
она полностью реполяризуется, что нарушает правильный ритм возбуждения (рис. 4), показанный на рис. 3. Подобные нарушения ритма могут приводить к возникновению особого режима проведения волны возбуждения - ее циркуляции вокруг различного вида неоднородностей, в том числе и не полностью реполяризованных участков. Такой режим проведения представлен на рис. 5. Если частота циркуляции волны превышает частоту спонтанной активности, происходит подавление последней. Исходя из полученных данных (см. рис. 4) такой сценарий гораздо более вероятен у клеток линии 1Т31-5, обладающих более низкой и временами аритмичной спонтанной активностью.
Заключение
Проведенное исследование показало, что клеточное репрограммирование не только служит эффективным инструментом при изучении ионных токов в отдельных клетках, но и позволяет исследовать распространение возбуждения в клеточных монослоях, имитирующих сердечную ткань. Выращенные слои кардиомиоцитов желудочков позволяют проводить сравнение характеристик распространения возбуждения в ансамблях клеток, несущих мутацию с клетками от здорового индивида. В слоях клеток с мутацией р.Т613М в гене KCNH2, помимо удлинения потенциала действия, наблюдаются пониженная частота спонтанной активности и повышенная вероятность нарушения единого ритма, задаваемого пейсмекерными клетками.
Благодарности. Авторы благодарят С.М. За-кияна и Е.В. Дементьеву за предоставленные линии ИПСК и помощь в отработке протоколов диф-ференцировки.
Работа поддержана грантом Российского научного фонда 16-14-10091.
6. Davidenko J.M., Pertsov A.M., Baxter W.T., Salomonsz R., et al. High-resolution mapping of action-potential duration gradients in isolated sheep epicardial muscle. Circulation. 1993; 88: 327-7.
7. Cabo C., Pertsov A.M., Dawdenko J.M., Jalife J. Electrical turbulence as a result of the critical curvature for propagation in cardiac tissue. Chaos. 1998; 8: 116-26.
8. Gray R.A., Pertsov A.M., Jalife J. Spatial and temporal organization during cardiac fibrillation. Nature. 1998; 392: 75-8.
9. Gray R.A., Pertsov A.M., Jalife J. Incomplete reentry and epicardial breakthrough patterns during atrial fibrillation in the sheep heart. Circulation. 1996; 94: 2649-61.
10. Bursac N., Loo Y.H., Leong K., Tung L. Novel anisotropic engineered cardiac tissues: Studies of electrical propagation. Biochem Biophys Res Commun. 2007; 361: 847-53.
11. Iravanian S., Nabutovsky Y., Kong C.R., Saha S., et al. Functional reentry in cultured monolayers of neonatal rat cardiac cells. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 2003; 285: H449-56.
12. Kadota S., Minami I., Morone N., Heuser J.E., et al. Development of a reentrant arrhythmia model in human pluripotent stem cell-derived cardiac cell sheets. Eur Heart J. 2013; 34: 1147-56.
13. Lahti A.L., Kujala V.J., Chapman H., Koivisto A.P., et al. Model for long QT syndrome type 2 using human iPS cells demonstrates arrhythmogenic characteristics in cell culture. Dis Model. Mech. 2012; 5: 220-30.
14. Chiang C.E., Roden D.M. The long QT syndromes: genetic basis and clinical implications. J Am Coll Cardiol. 2000; 36: 1-12.
15. Schwartz P.J., Stramba-Badiale M., Crotti L., Pedrazzini M., et al. Prevalence of the congenital long-QT syndrome. Circulation. 2009; 120: 1761-7.
16. Viskin S. Long QT syndromes and torsade de pointes. Lancet. 1999; 354: 1625-33.
17. Sesti F., Abbott G.W., Wei J., Murray K.T., et al. A common polymorphism associated with antibiotic-induced cardiac arrhythmia. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97: 10 613-8.
18. El-Sherif N., Turitto G., Bouttjdir M. Acquired long QT syndrome and torsade de pointes. Pacing Clin Electrophysiol. 2018; 41: 414-21.
19. Antzelevitch C. Ionic, molecular, and cellular bases of QT-in-terval prolongation and torsade de pointes. Europace. 2007; 9: 4-15.
20. Egashira T., Yuasa S., Suzuki T., Aizawa Y., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovasc Res. 2012; 95: 419-29.
21. Malan D., Friedrichs S., Fleischmann B.K., Sasse P. Cardio-myocytes obtained from induced pluripotent stem cells with long-QT syndrome 3 recapitulate typical disease-specific features in vitro. Circ Res. 2011; 109: 841-7.
22. Lian X.J., Zhang J.H., Azarin S.M., Zhu K.X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 2013; 8: 162-75.
23. Ma J.Y., Guo L., Fiene S.J., Anson B.D., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2011; 301: H2006-17.
24. Estacion M., Waxman S.G. The response of Na(V)1.3 sodium channels to ramp stimuli: multiple components and mechanisms. J Neurophysiol. 2013; 109: 306-14.
25. Pelzmann B., Schaffer P., Bernhart E., Lang P., et al. L-type calcium current in human ventricular myocytes at a physiological temperature from children with tetralogy of Fallot. Cardiovasc Res. 1998; 38: 424-32.
26. Slotvitsky M.M.,Tsvelaya V.A., Frolova S.R., Demenfeva E.V., et al. The study of the functionality of cardiomyocytes obtained from induced pluripotent stem cells for the modeling of cardiac arrhythmias based on long QT syndrome. Vavilovskii Zhurnal Genetiki i Sele-ktsii. 2018; 22: 187-95.
27. Lippiat J.D. Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique. In: Potassium Channels: Methods and Protocols. Humana Press. 2009; 141-9.
