CC BY
74
УДК 616.34-006.6-008.851-008.9
Цель: проведение сравнительного анализа серологических и эпигенетических методов скрининга рака толстой кишки для создания адекватных скрининговых и диагностических алгоритмов по выявлению колоректального рака.
Материалы и методы: обследованы 204 больных, у которых рак толстой кишки был выявлен при проведении скрининговых мероприятий. Контрольную группу составили 56 здоровых людей. Скрининговые мероприятия объединяли следующие методики: иммунохроматографический тест кала на скрытую кровь, определение онкомаркеров в крови (ра-ковоэмбрионального антигена, онкоантигенов СА 19-9, СА 242), метилированной ДНК гена септина 9 в крови. Методом ROC-анализа определяли диагностическую значимость тестов и их комплексирования.
Результаты: диагностическая эффективность скрининга рака толстой кишки путем определения уровней в крови РЭА, СА 242 и СА 19-9 составляет, соответственно, 40,4%, 50,8% и 51,7%. Эпигенетический тест на наличие метилата ДНК гена SEPT9 в крови как скрининговая методика характеризуется более высокой диагностической чувствительностью - 85,3%.
Заключение: на начальном этапе скрининга рака толстой кишки оптимальным сочетанием методов является комбинация иммунохимического теста на скрытую кровь в кале при пороге 100 нг/мл, определения наличия метилата ДНК гена SEPT9 в крови.
Ключевые слова: рак толстой кишки, скрининг, эпигенетический тест, онкомаркеры, диагностическая чувствительность.
COMPARATIVE ANALYSIS OF EFFICIENCY OF SEROLOGICAL SCREENING METHODS FOR EPIGENETIC
Purpose: Comparative analysis serologic screening techniques of epigenetic and colon cancer for adequate screening and diagnostic algorithms for detection of colorectal cancer.
Materials and methods: Surveyed 204 patients whose colon cancer was detected in screening activities. A control group consisted of 56 healthy people. Screening measures unite following techniques: Immunochromatographic fecal occult blood, determination of tumor markers in the blood (carcinoembryonic antigen, oncoantigens CA 19-9, CA 242), methylated DNA gene septins 9 in the blood. The ROC-analysis determined the significance of diagnostic tests and their aggregation.
Results: Diagnostic efficacy of colon cancer screening by blood levels of CEA, CA 242 and CA 19-9, respectively, 40,4%, 50,8%, 51,7%. Epigenetic testmetilat DNASEPT9of blood as screening method is characterized by a high diagnostic sensitivity-85,3%.
Summary: At the initial stage of colon cancer screening method is a combination of the optimal combination of immunochemical test for the occult blood in feces in the threshold of 100 ng/ml, metilat DNA detection of SEPT9 gene in the blood.
Keywords: colon cancer, screening, epigenetic test, tumour markers, diagnostic sensitivity..
D.V. Burtsev
Введение
Материал и методы
Неуклонный рост заболеваемости и высокий уровень смертности больных раком толстой кишки, поздняя диагностика заболевания, низкая резектабельность являются причинами неудовлетворительных показателей выживаемости у данной категории пациентов [1]. По общемировой статистике в последние пять десятилетий в структуре онкологической заболеваемости колоректальный рак прочно удерживает 3-4 место [1]. В Российской Федерации распространенность заболеваний ободочной кишки значительна и достигает 32 случая на 100 тысяч населения, из них 11,3 случаев приходится на колоректаль-ный рак [2]. Тревожным является тот факт, что на 100 новых больных раком ободочной и прямой кишки приходится более 70 умерших, из них на 1-м году с момента установления диагноза около 40% [3]. Данное обстоятельство обусловлено тем, что при первичном обращении пациентов к врачу запущенные формы рака (Ш-1У стадии) диагностируются у 71,4% больных раком ободочной кишки и у 62,4% в случаях заболевания раком прямой кишки [4].
Выходом из сложившейся ситуации является организация и широкое внедрение в практику скринин-говых программ по раннему выявлению рака толстой кишки. Под скринингом рака понимают применение различных методов исследования, позволяющих диагностировать опухоль на ранней стадии, когда еще нет симптомов болезни [5]. Целью скрининга является раннее активное выявление бессимптомного рака и его лечение [6]. К сожалению, уровень скрининга в странах с высоким риском колоректального рака, включая Россию, остается низким. Ошибки на догоспитальном этапе диагностики колоректального рака, несмотря на впечатляющий арсенал диагностических возможностей, достигают 87,8% [6]. Видимо, проблема заключена в отсутствии системности и достаточной кратности использования диагностических инноваций [7]. Чаще всего для неинвазивного скрининга онкологического заболевания, в том числе и рака толстой кишки, используют серологические методы исследования по определению онкомаркеров [8]. Между тем, эпигенетические методы определения метилированной ДНК гена 8БРТ9 могут помочь в организации молекулярного скрининга колоректального рака [9]. Ген 8БРТ9 кодирует синтез белка 8ерИп-9. Метилирование ДНК этого гена прекращает его активную работу и «выключает» синтез белка-супрессора ракового роста [9]. Повреждение экспрессии гена 8БРТ9 ассоциировано с развитием колоректального рака [10]. В связи с появлением новых возможностей, необходимость разработки логических схем, имеющих своей целью оптимизацию каждого этапа скрининга и диагностического процесса в выявлении рака толстой кишки, очевидна.
Целью работы - проведение сравнительного анализа серологических и эпигенетических методов скрининга рака толстой кишки для создания адекватных скринин-говых и диагностических алгоритмов по выявлению колоректального рака.
В исследование включено 1669 пациентов, обследованных в ГБУ РО «Областной консультативно-диагностический центр» г.Ростова-на-Дону по системе скрининга, и 213 больных, которые самостоятельно обратились в специализированные онкологические учреждения с кишечными либо общими системными жалобами. Основную группу пациентов составили 204 больных, у которых рак толстой кишки был выявлен при проведении скрининговых мероприятий у 1669 пациентов и далее подтвержден с помощью фиброко-лоноскопии с гистологическим исследованием био-птатов. В группе скрининга клинических проявлений заболевания не было, жалоб на дисфункцию толстой кишки пациенты не предъявляли. Контрольную группу составили 56 здоровых людей, у которых отсутствовала патология желудочно-кишечного тракта, что было доказано с помощью эндоскопических методов исследования. От всех пациентов получали письменное информированное согласие для участия в исследовании.
Скрининговые мероприятия на начальном этапе объединяли следующие методики: иммунохроматогра-фический тест кала на скрытую кровь (СКК), определение онкомаркеров в крови (раковоэмбрионального антигена, онкоантигенов СА 19-9, СА 242), метилированной ДНК гена септина 9 в крови. Из перечисленных методик определение метилированной ДНК гена септи-на 9 в крови находится на стадии апробации в ряде зарубежных клиник (США, Швейцария) [10], в 2012 году было внедрено в лабораторию ГБУ Ростовской области «Областной консультативно-диагностический центр» и до момента настоящего исследования не использовалась ни в одной из российских клиник.
В основной группе мужчин было 99 (48,5%), а женщин - 105 (51,5%). В контрольной группе число мужчин было 31 (55,4%), а женщин - 25 (44,6%). Средний возраст пациентов основной группы составил 61,4± 1,56 года, а в контрольной группе 58,7±1,23 лет.
Распределение больных раком толстой кишки основной группы с учетом классификации ТММ отражено в таблице 1.
Таблица 1
Распределение больных раком толстой кишки основной и контрольной групп с учетом классификации TNM
Стадии ТММ Основная группа
абс. %
ТШ0М0 21 10,3
Т2ШМ0 141 69,1
Т3ШМ0 24 11,8
Т3ШМ0 12 5,9
Т3ШМ0 6 2,9
Всего 204 100,0
Опухоли больных раком толстой кишки имели различную глубину инвазии в кишечную стенку. В основной группе прорастание слизистого и подслизистого слоев (Т1) наблюдали у 21 (10,3%) больного, врастание
опухоли в мышечную оболочку (Т2) - у 141 (69,1%) пациентов, прорастание всех слоев стенки кишки (Т3) - у 42 (20,6%) больных. Наличие регионарных метастазов в периколярных лимфоузлах (N1-N2) отмечено у 18 (8,8%) пациентов.
При гистологическом исследовании биопсийного материала у всех больных были диагностированы аде-нокарциномы толстой кишки различной степени диффе-ренцировки: низкая - 24 (11,8%), средняя - 138 (67,6%) и высокая - 42 (20,6%).
Анализ частоты различных локализаций рака толстой кишки у больных основной группы показал, что чаще других локализаций выявлялся рак сигмовидной (25,5%) и прямой кишки (21,6%). На третьем и четвертом месте по встречаемости были злокачественные новообразования поперечной ободочной (11,3%) и слепой кишки (10,8%).
Анализ кала на скрытую кровь проводили с помощью иммунохроматографического теста (Hexagon OBTI). Для заключения о наличии крови в кале использовали предел количества гемоглобина в кале в 50 нг/мл и 100 нг/ мл. Определение онкомаркера раковоэмбрионального антигена (РЭА) в крови базировалось на принципе твер-дофазового ферментносвязанного иммуносорбентного теста с использованием набора DRG СЕА ELISA (США). Определение уровней онкоантигенов СА 19-9 и СА 242 в сыворотке крови проводили иммуноферментным методом (ELISA) с использованием соответствующих наборов Calbiotech CA19-9 ELISA ИФА (США) и Calbiotech CA 242 ELISA ИФА (США). Качественный анализ наличия метилата гена SEPT9 в крови проводили, используя протокол EpiproColon теста (EpigenomicsAG, Berlin, Germany) для ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном време-
ни выполнена на амплификаторе (RocheAppliedScience, Indianapolis, Indiana).
Фиброколоноскопия (ФКС) выполнялась с использованием видеоинформационных систем V-70, EVIS EXERA и EVIS EXERA-2 «OLYMPUS» (Япония), оснащенных видеоколоноскопами. При этом по показаниям при выявлении патологических объектов применяли, кроме стандартной, магнификационную эндоскопию с использованием видеоколоноскопа CF-180AI с функцией 74-х электронного увеличения без потери качества, что делало возможным различать мельчайшие структуры слизистой и позволяло проводить исследование близкое по качеству к микроскопическому, а также узкоспектральную эндоскопию с помощью видеоколоноскопов «180» для коррекции изображения. При проведении колоноскопии прицельно забирали биоптаты толстой кишки для последующего гистологического исследования. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, проводили световую микроскопию.
Для расчета чувствительности, специфичности, эффективности (точности) диагностических тестов, нахождения диагностической точки разделения использовали ROC-анализ (Receiver Operating Characteristic). Значения площади под ROC- кривыми (AreaUnderCurve, AUC) позволяли оценить качество диагностических тестов. ROC-анализ проводили с помощью программы MedCalc (версия 9.3.5.0).
Результаты и обсуждение
Параметры ROC-анализа диагностической значимости изучаемых методов скрининга рака толстой кишки представлены в таблице 2.
Таблица 2
Показатели ROC-анализа диагностической значимости методов начального этапа скрининга
рака толстой кишки
Метод скрининга ДЧ ДС ДЭ AUC z-стати-стика, р
Тест на скрытую кровь при пороге 50 нг/мл 41,9 94,9 93,1 0,613±0,0132 z=2,4 p=0,04
Тест на скрытую кровь при пороге 100 нг/мл 63,0 91,1 90,1 0,645±0,0241 z=2,9 p=0,02
СА19-9 27,9 87,5 51,7 0,602±0,0324 z=1,2 p=0,13
СА 242 41,7 83,9 50,8 0,632±0,0658 z=5,0 p=0,0001
РЭА 48,0 87,5 40,4 0,746±0,0468 z=5,2 p=0,0001
SEPT9 крови 85,3 91,1 86,5 0,821±0,0287 z=5,13 p=0,0000
Примечание: ДЧ - диагностическая чувствительность, ДС - диагностическая специфичность, ДЭ - диагностическая эффективность, АиС - площадь под ROC-кривой, 2-статистика - критерий доверительной значимости теста при доверительной вероятности р.
Низкая диагностическая чувствительность отдельного использования скрининговых методов была отмечена для онкомаркеров СА 19-9 (27,9%), СА 242 (41,7%), РЭА (48%), теста на скрытую кровь в кале при пороговом значении гемоглобина 50 нг/мл (41,9%). Диагностическая
чувствительность теста на скрытую кровь в кале у пациентов для выявления рака толстой кишки при уровне 100 нг/мл возрастала до 63%. Наиболее перспективной скрининговой методикой был тест на наличие в крови метилированной ДНК гена SEPT9. Диагностическая
чувствительность этого теста составила 85,3%. Площадь под ROC-кривой эпигенетического теста имела высокое значение (AUC=0,821 ±0,0287) и статистически значимо (p<0,05) отличалась от аналогичных величин других методов начального этапа скрининга - анализа кала на скрытую кровь при пороговом значении 100 нг/мл (0,645±0,0241), определения уровня в крови онкомарке-ров СА-19-9 (0,602±0,0324), СА 242 (0,632±0,0658), РЭА (0,746±0,0468).
Среди больных основной группы при I стадии заболевания положительный результат теста на метилат ДНК гена SEPT9 в крови был выявлен у 34 (75,6%), II стадии - у 123 (87,2%), III стадии - у 17 (94,4%) пациентов. Чувствительность эпигенетического теста при I стадии была 75,6%, II стадии - 87,2%, III стадии - 94,4%. Таким образом, диагностическая значимость эпигенетического теста на ранних стадиях колоректального рака была высокой. С повышением стадии рака толстой кишки от I к III чувствительность изучаемого теста повышалась.
Результаты EpiproColon теста не зависели от локализации рака толстой кишки. В труднодоступных местах толстой кишки, где при фиброколоноскопии существуют определенные затруднения для выявления опухоли, положительные результаты теста выявлялись в 83,3-100%.
Таким образом, определение в крови метилированной ДНК гена SEPT9 эффективно при ранних стадиях рака толстой кишки, а также при проксимальной локализации опухоли.
В результате исследования было выявлено, что диагностической точкой разделения РЭА, при превышении которой повышается вероятность выявления рака толстой кишки, была величина 11,9 нг/мл. При достижении этой величины чувствительность метода соответствовала 48%, а специфичность - 87,5%. Чувствительность изучаемого метода зависела от стадии заболевания. При I стадии чувствительность составила 20%, II стадии - 53,2% и III стадии 77,8%. У больных раком толстой кишки при распространении опухолевого процесса на лимфатические узлы уровень РЭА в крови возрастал практически вдвое (p<0,001) - 56,7±1,5 нг/мл против 25,9±1,2 нг/мл. Степень дифференцировки опухоли также прямо пропорциально влияла на уровень РЭА. После хирургического лечения в ранний послеоперационный период уровень РЭА в крови у больных достоверно снижался (p<0,001) с 26,8±1,9 нг/ мл до 8,3±0,8 нг/мл. В отдаленный период наблюдения содержание онкоантигена в крови зависело от наличия рецидива или метастазов заболевания. При прогрессиро-вании опухолевого процесса уровень РЭА статистически значимо возрастал до 72,1±1,7 нг/мл. У больных без рецидивов заболевания через 3 года после операции уровень РЭА был значительно ниже - 15,8±0,6 нг/мл. Таким образом, для выявления рака толстой кишки диагностическая чувствительность теста по оценке уровня РЭА в крови была недостаточной. Однако уровень РЭА крови отражает степень распространенности опухолевого процесса, его серийное определение в послеоперационный период хирургического лечения рака толстой кишки позволяет предположить рецидив заболевания при многократном повышении концентрации онкоантигена в крови.
На следующем этапе у больных скрининговой группы изучали эффективность определения в крови карбоги-драт-антигена СА-242. Изучение ROC-кривых показало, что диагностической точкой разделения СА-242, при превышении которой повышается риск наличия рака толстой
кишки, была концентрация 23 Е/мл. При достижении этой величины чувствительность метода соответствовала 41,7%, а специфичность - 83,9%. При верхней границе нормы 15 Е/мл чувствительность теста была крайне низкой, а специфичность - высокой, что привело бы при соблюдении такой точки разделения к гиподиагностике. Диагностическая чувствительность метода определения СА 242 в крови повышалась при III стадии заболевания. При I стадии диагностическая чувствительность составила 33,3%, II стадии - 43,3% и III стадии - 50%. У больных раком толстой кишки при распространении опухолевого процесса на лимфатические узлы уровень СА-242 в крови возрастал незначительно (p>0,05) - с 34,7±2,1 Е/мл до 41,7±1,5 Е/мл. Степень дифференцировки опухоли не влияла на уровень СА-242 в крови. После хирургического лечения в ранний послеоперационный период уровень СА-242 в крови у больных снижался с 35,2±1,7 Е/мл до 20,7±1,9 Е/мл (p<0,05). В отдаленный период наблюдения при развитии метастазов содержание онкоантигена в крови возрастало в 4 раза до 80,5±1,6 Е/мл. У больных без рецидивов заболевания через 3 года после операции уровень СА- 242 достоверно не изменялся и составил 23,9±1,5 Е/мл. Таким образом, только по определению СА-242 в крови скрининг рака толстой кишки является неэффективным. Концентрация СА- 242 коррелировала со стадиями заболевания и отражала распространенность опухолевого процесса, что определяет целесообразность динамичного серийного учета СА-242 в крови после операции у больных раком толстой кишки.
На следующем этапе определяли диагностический уровень карбогидрат-антигена СА 19-9 в крови для выявления больных раком толстой кишки. Диагностической точкой разделения была концентрация СА 19-9 в 46 U/мл. При содержании СА 19-9 в 46 U/мл чувствительность и специфичность составили, соответственно, 27,9% и 87,5%. Диагностическая чувствительность метода определения СА 19-9 в крови составила при I стадии рака толстой кишки - 17,8%, II стадии - 27,6% и III стадии - 55,5%. У больных раком толстой кишки при распространении опухолевого процесса на лимфатические узлы повышенный уровень СА 19-9 в крови наблюдался в 88,9% и значительно возрастал по сравнению с больными без поражения лимфатических узлов - на 61,3%. Степень дифференцировки опухоли, как и в случае СА-242, не влияла на уровень СА 19-9 в крови. После хирургического лечения в ранний послеоперационный период уровень СА 19-9 в крови у больных снижался с 62,1±2,1 U/мл до 44,1±2,5 U/мл. В отдаленный период наблюдения при развитии у больных метастазов содержание онкоан-тигена в крови возрастало с 62,1±2,1 U/мл до 86,3±2,3 U/ мл. У больных без рецидивов заболевания через 3 года после операции уровень СА 19-9 достоверно не изменялся и составил 47,2±1,9 U/мл. Таким образом, самая низкая диагностическая эффективность в отношении скрининга рака толстой кишки была характерна для СА 19-9. Однако концентрация СА 19-9 изменялась сопряжено со стадией заболевания, уровень онкоантигена отражал распространенность опухолевого процесса на лимфатические узлы и повышался при развитии рецидивов и метастазов рака толстой кишки.
Низкая диагностическая эффективность серологических методов скрининга рака толстой кишки обусловливала необходимость исследования значимости их совместного определения для выявления колоректального
рака в комбинации с эпигенетическими опухолевыми маркерами.
Комплексное использование методов скрининга рака толстой кишки приводило к последовательному возрастанию их совместной диагностической ценности. Исключение составило сочетание определения онкогенов СА-242 и СА 19-9. При таком сочетании серологических методов скрининга диагностическая чувствительность не изменялась по сравнению с одиночным применением методов.
Эффективной программой начального этапа скрининга оказался комплекс методов, включающих анкетирование для выяснения наличия наследственной предрасположенности к заболеванию и факторов риска рака толстой кишки, иммунохроматографический анализ кала на скрытую кровь при пороговом значении 100 нг/мл и определение наличия метилата ДНК гена SEPT9 в крови (чувствительность 89,2%, специфичность 92,9%, эффективность 90%).
Таким образом, совокупность серологических и эпигенетических методов скрининга ввиду их высокой диагностической чувствительности и меньшей стоимости по сравнению с фиброколоноскопией могут выступать альтернативой эндоскопическому скринингу. Разработанные нами скрининговые программы включают неинвазивные тесты, доступные в выполнении как для обследуемого, так и для врача, обладающие оптимальным соотношением чувствительности и специфичности, эффективности и затратности. Кроме того, возрастание в крови уровней
исследуемых опухолевых маркеров поставляет дополнительную информацию о степени распространенности опухолевого процесса и, что особенно важно, об эффективности проведенного лечения. Периодическое исследование опухолевых маркеров после окончания лечения дает возможность заподозрить развитие рецидива опухолевого процесса раньше традиционно используемых в онкологии методов диагностики.
Выводы
Диагностическая эффективность скрининга рака толстой кишки путем определения уровней в крови РЭА, СА 242 и СА 19-9 составляет, соответственно, 40,4%, 50,8% и 51,7%.
Эпигенетический тест на наличие метилата ДНК гена SEPT9 в крови как скрининговая методика характеризуется более высокой диагностической чувствительностью 85,3%, диагностической специфичностью 91,1% и диагностической эффективностью 86,5% по сравнению с серологическими методами.
На начальном этапе скрининга рака толстой кишки оптимальным сочетанием методов является комбинация иммунохимического теста на скрытую кровь в кале при пороге 100 нг/мл, определения наличия метилата ДНК гена SEPT9 в крови. Диагностическая эффективность I этапа скрининга составляет 90%.
ЛИТЕРАТУРА
1. Мерабишвили В.М.Злокачественные новообразования в мире, России, Санкт-Петербурге. - СПб.: Коста, 2011. -290 с.
2. Циммерман Я.С.Колоректальный рак: современное состояние проблемы // Вестник Северо-западного государственного медицинского университета им. И.И.Мечникова. - 2012. -Ы 1. -С.78-83.
3. Чалык Ю., Рубцов В. Методологические аспекты раннего выявления колоректальных новообразований // Врач. -2011.-№13. -С.22-24.
4. Солодкий В., Чхиквадзе В., Станоевич У, Дехисси Е. Ранняя диагностика колоректального рака // Врач.-2012.-Ы 11.-С.20-23.
5. Воробьев А.В., Протасова А.Э. Общие вопросы скрининга // Практическая онкология. -Т. 11, № 2 - 2010. -С.53-59.
6. Егоренков В.В., Моисеенко Ф.В. Скрининг рака толстой кишки // Практическая онкология. -2010.Т. 11, № 2.-Имянитов Е.Н. Высокопроизводительные молекулярно генетические методы нового поколения в диагностике и лечении новообразований // Практическая онкология. -2011. -Т.12, №4. -С.194-202.
7. Пальцева Е.М., Самофалова О.Ю., Горбачева Ю.В., Царьков П.В. Молекулярно-биологические маркеры прогрессии рака толстой кишки // Архив патологии. -2012.-№ 2. -С.14-18.
8. Akhtar-Zaidi B., Cowper-Sallari R., Corradin O., Saiakhova A.Epigenomic enhancer profiling defines a signature of colon cancer // Science. -2012. -Vol.336, №6082. - Р.736-739.
9. KondoY.,Issa J.P. Epigenetic changes in colorectal cancer // Cancer Metastasis Rev. - 2004. - Vol. 23. - P. 29-39.
ПОСТУПИЛА 07.01.2014
