CC BY
9ФАРМАКОЛОГИЯ, КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ
Е. Н. Калапко1, С. Ю. Штрыголь1, Т. В. Горбач2, Ю. Б. Ларьяновская1, С. И. Мерзликин1
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВД'-(ЭТАН-1,2-ДИИЛ)БИС(ХИНОЛИН-2-КАРБОКСАМИДА), ДИАКАМФА ГИДРОХЛОРИДА И МЕТФОРМИНА В ОСТРОМ ПЕРИОДЕ АЛЛОКСАНОВОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА У КРЫС
Национальный фармацевтический университет, г. Харьков, Украина 2Харьковский национальный медицинский университет, г. Харьков, Украина
Лечение сахарного диабета, относящееся к важнейшим проблемам современной медицины и фармации, требует поиска новых лекарственных средств и углубленного изучения механизмов известных Целью данной работы стал сравнительный анализ влияния новых средств N,N'-1этан-1,2-диил)бис(хинолин-2-карбоксамида) в дозе 11,64 мг/кг, диакамфа гидрохлорида (25 мг/кг) и метформина (100 мг/кг), вводимых в желудок в лечебном режиме, на выживаемость, состояние углеводного и белкового обмена, интенсивность липопероксидации, уровень TNF-a, а также гистоструктуру поджелудочной железы крыс в остром периоде аллоксанового сахарного диабета у крыс. (этан-1,2-диил)бис(хинолин-2-карбоксамид) и диакамфа гидрохлорид достоверно повышают выживаемость, уменьшают гипергликемию, гипоинсулинемию, содержание TNF-a в крови, степень повреждения островковыгхв-клеток и нарушений гистострук-туры поджелудочной железы, нормализуют уровень гликогена в печени, проявляют антиоксидантные свойства. Оба средства имеют преимущества перед метформи-ном, который, уменьшая степень повреждения поджелудочной железы, не снижает раннюю летальность, вызывает гиперлакацидемию и гипопротеинемию.
Ключевые слова: аллоксановый сахарный диабет, N,N'-(этан-1,2-диил) бис(хинолин-2-карбоксамид), диакамф, метформин.
ВВЕДЕНИЕ
Сахарный диабет (СД) - одно из наиболее распространенных и социально значимых заболеваний - представляет собой актуальную проблему здравоохранения. Более 90% случаев приходится на СД 2 типа [1-3]. Лечение СД остается недостаточно эффективным.
В поиске новых антидиабетических средств привлекает внимание ^№-(этан-1,2-диил)бис(хинолин-2-карбоксамид) (^№-ЭБХК). Это соединение, известное противоопухолевыми свойствами за счет активации каспазы-3 и индукции апоптоза [4], оказывает гипогликемический эффект на модели сформировавшегося аллокса-нового СД при различных путях введения [5-7]. ^№-ЭБХК является агонистом ими-дазолиновых рецепторов обоих типов -11 и 12 [8, 9], что нетипично для известных противодиабетических средств.
ЭБХК характеризуется малой токсичностью при внутрижелудочном введении (IV класс токсичности, ЛД50 = 633,45 мг/кг) и большой широтой терапевтического действия. Диапазон эффективных доз ЭБХК на модели аллоксанового СД - 7,9231,67 мг/кг с нелинейной зависимостью «доза-эффект», ЕД50 = 11,64 мг/кг, терапевтический индекс (ТИ) - 54,42. При вну-трибрюшинном введении в дозе 1,5 мг/кг ^№-ЭБХК снижает гликемию у диабетических крыс, превышая эффект метформина в дозе 100 мг/кг, а ЛД50 = 10,005 мг/кг (III класс токсичности - умеренно токсичные вещества). Ценно отсутствие саха-роснижающего действия ^№-ЭБХК при нормогликемии (при введении внутрь оно проявляется лишь в дозе 15 мг/кг) [5], что выгодно отличает это соединение от производных сульфонилмочевины.
Другое направление поиска оригинальных противодиабетических средств
привело к созданию производного бензи-мидазола - (±)-цис-3-(2'-бензимидазолил)-1,2,2-триметилциклопентанкарбоновой кислоты гидрохлорида (диакамфа гидрохлорида, ДГ). Его антигипергликемическое действие, наиболее выраженное в диапазоне доз 10-25 мг/кг, обусловлено стимуляцией панкреатических Р-клеток, возбуждением 12-имидазолиновых рецепторов, уменьшением инсулинорезистентности, мощной антиоксидантной активностью [10, 11]. Удобный для создания инъекционного раствора водорастворимый ДГ, как и эффективный на разных моделях СД диакамф, обладают ценными церебропро-текторными и ноотропными свойствами, в механизм которых вовлечена стимуляция ^-имидазолиновых рецепторов [12, 13]. По величине ЛД50 (3000 мг/кг) ДГ относится к малотоксичным веществам (IV класс токсичности), а по широте терапевтического действия превосходит ^№-ЭБХК (ТИ в разных исследованиях достигает 120-300) [13].
Механизм действия производного гу-анидина - диметилбигуанида (метформи-на), широко применяемого при СД 2 типа, несмотря на давнюю историю изучения, далек от ясности. Он способствует поглощению и утилизации глюкозы мышечной тканью, устраняет инсулинорезистент-ность, угнетает глюконеогенез [10]. Однако метформин эффективен и на аллок-сановой модели, по патогенетическим особенностям приближающейся к СД 1 типа, а в механизме его действия принимает участие стимуляция 12-имидазолиновых рецепторов [11, 14]. Поэтому целесообразно сравнить его с ^№-ЭБХк и ДГ, влияние которых на уровень инсулина, а также другие функциональные показатели и морфологическое состояние поджелудочной железы (ПЖ) на аллоксановой модели СД неизвестно. Выяснение особенностей этого влияния составило цель настоящей работы, что обусловлено важностью углубления знаний о механизмах действия про-тиводиабетических средств.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты проведены в весенний период на 55 белых беспородных крысах-самцах массой 155-185 г, содержавшихся согласно правилам GLP в стандартных условиях вивария ЦНИЛ Национального фармацев-
тического университета (НФаУ). Все процедуры и эвтаназию осуществляли с соблюдением принципов «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей» (Страсбург, 1986) [15].
Крысы были разделены на 5 групп: 1-я группа - интактные животные (n=8), 2-я -контрольная патология (КП): модель СД без лечения (n=18), 3-я - животные с СД, получавшие N^'-ЭБХК в дозе 11,64 мг/кг [5] (n=9), 4-я - крысы с моделью СД, получавшие ДГ в дозе 25 мг/кг (n=9) [11], 5-я -животные, получавшие метформин в дозе 100 мг/кг [11, 14] (n=11). Все исследуемые средства вводили в желудок через зонд ежедневно 2 раза в день в течение 3 суток с момента моделирования СД, первую дозу - через 90 мин после аллоксана. ДГ получен на кафедре токсикологической химии НФаУ докт. фарм. наук, проф. С.И. Мерз-ликиным. N^'-ЭБХК синтезирован на кафедре органической химии Харьковского национального университета им. В.Н. Ка-разина канд. хим. наук Б.В. Папоновым. Использовали субстанцию метформина (Sigma, США).
Аллоксановый СД моделировали подкожным введением 5% водного раствора аллоксана моногидрата (Sigma, США) однократно в дозе 150 мг/кг в виде 5% раствора в ацетатном буфере, рН 4,5 [16]. Выбор этой модели обусловлен тем, что именно она является базовой при доклиническом изучении потенциальных противо-диабетических средств [17, 18]. Животные предварительно голодали в течение 24 ч при свободном доступе к воде. Исследования выполняли в острой фазе действия ал-локсана - через 3 суток, когда разрушение ß-клеток ПЖ достигает максимума [19].
Регистрировали выживаемость животных. Через 2 часа после последнего введения препаратов выживших крыс декапити-ровали под наркозом (тиопентал натрия), получали плазму крови (антикоагулянт -гепарин in vitro), выделяли ПЖ и печень.
В плазме крови определяли инсулин с помощью набора ELISA (Германия), глюкозу - глюкозооксидазным методом с использованием стандартных наборов (ТОВ НВП "Фшат^агностика", Украина), лактат - колориметрическим методом с помощью набора ЛАКТАТ-ВИТАЛ (Россия), пируват - модифицированным методом Умбрайта. Гликоген в печени определяли
антроновым методом [20]. Для оценки интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в гомогенате печени определяли содержание ТБК-активных продуктов (ТБК-АП) по методу Стальной Г.Д. [21]. Состояние антиоксидантной системы оценивали по активности каталазы в плазме крови методом М.А. Королюка и соавт. [22] и супероксиддисмутазы (СОД) методом аутоокисления адреналина [23]. Белок в гомогенате печени определяли по методу Lowry, общий белок и альбумины в плазме крови - с помощью стандарных наборов (ТОВ НВП "Фшат^агностика", Украина). Мочевину в плазме крови определяли диацетилмонооксимным методом, маркеры цитолиза - активность аспартат-аминотрансферазы (АсАТ) и аланин-ами-нотрансферазы (АлАТ) - по методу Райт-мана-Френкеля, фактор некроза опухоли-альфа (TNF-a) - маркер воспалительного ответа, влияющий на чувствительность к инсулину, - с помощью стандартных наборов (ТОВ НВП "Фшат^агностика", Украина) [24].
Гистоструктуру ПЖ изучали светооп-тическим методом. Органы фиксировали в 10% растворе формалина, обезвоживали в спиртах возрастающей крепости, заливали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином и эозином [25]. На срезах ПЖ определяли оптическую плотность панкреатических островков (общее количество островков в препарате), островковый
профиль (количество Р-клеток в островке) и функциональный индекс (ФИ) - отношение Р-клеток к a-клеткам. С помощью программы Toupcam Granum измеряли периметр панкреатических островков (мкм). По содержанию Р-клеток и периметру островков последние распределяли на мелкие, средние и крупные, рассчитывая их соотношение. Использовали микроскоп Granum, микропрепараты фотографировали цифровой видеокамерой Granum ДСМ 310. Фотоснимки обрабатывали на компьютере Pentium 2,4GHz с помощью программы Toup View.
Результаты обрабатывали статистически с использованием стандартного пакета статистических программ «Stаtistica 6,0» [26]. При учете результатов в альтернативной форме (выживаемость/гибель) применяли угловое преобразование Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫИ ОБСУЖДЕНИЕ
Интегральным защитным эффектом исследуемого средства является выживаемость, которая на 3-й день в группе КП составила 88,9% (16 из 18 животных, р<0,05 относительно интактного контроля), на фоне метформина - 91,1% (10/11), а в группах N^'-ЭБХК и диакамфа - по 100% (р<0,05 относительно показателя КП).
Состояние углеводного обмена в отдельных группах существенно различалось (таблица 1). У крыс группы КП имела
Таблица 1 - Влияние ^№-(этан-1,2-диил)бис(хинолин-2-карбоксамида), диакамфа
гидрохлорида и метформина на показатели углеводного обмена на модели _ аллоксанрвого сахарного диабета у крыс (3 сутки)_
Показатели Ингактный контроль Модель сахарного диабета
Контрольная патология Ч№-(эган-1,2-диил)бис(хинолин-2-карбоксамид) Диакамфа гидрохлорид Метформин
Глюкоза крови, ммоль/л 6,23±0,23 20,26±3,91* 16,02±2,68* 13,87±2,36* 14,01±3,47*
Инсулинемия, мкМЕ/мл 2,96±0,17 0,43±0,08* 0,89±0,20*# 1,19±0,29*# 0,81±0,10*#
Гликоген печени, мг/г 15,3±5,25 5,92±0,51 27,5±5,45# 13,5±3,80 16,9±1,25#
Лактат плазмы крови, ммоль/л 1,43±0,29 2,46±0,28* 2,96±0,69 2,13±0,57 3,24±0,72*
Пируват плазмы крови, ммоль/л 0,26±0,04 0,44±0,06* 0,54±0,06* 0,41±0,04* 0,52±0,05*
Лактат/ пируват 5,63±0,65 6,00±0,60 5,23±0,69 4,99±0,69 5,64±1,06
Примечание: Статистически значимые различия (р<0,05): * - по отношению к интактному контролю, # - по отношению к контрольной патологии.
место выраженная гипергликемия (уровень глюкозы в крови возрос в среднем в 3,25 раза, р<0,01) на фоне почти семикратного снижения уровня инсулина в крови (р<0,001) и более чем двукратного уменьшения содержания гликогена в печени. Достоверно (в среднем на 72%, р<0,05) возрастала концентрация лактата в крови, однако за счет роста концентрации пирува-та, имеющего, очевидно, компенсаторный характер, коэффициент «лактат/пируват» имел лишь тенденцию к увеличению.
Все исследуемые средства способствовали снижению гипергликемии на уровне тенденции (таблица 1). Для достоверного антигипергликемического эффекта, оказываемого ими [11, 13], очевидно, необходим более продолжительный курс лечения. Но состояние углеводного обмена в соответствующих группах значительно различалось.
Прежде всего, необходимо отметить достоверно большее (в 2-3 раза по сравнению с показателем КП) содержание инсулина в крови под влиянием ^№-ЭБХК, метформина и особенно ДГ, хотя уровень гормона оставался в 2,5-3,7 раза ниже, чем в интактном контроле (р<0,001). Все они препятствовали снижению содержания
Содержание мочевины в плазме крови крыс группы КП значительно возрастало -в среднем в 4,8 раза по сравнению с показателем интактных животных (р<0,05). Гиперазотемия, очевидно, имеет ретенци-онное происхождение вследствие угнетения выделительной функции почек, характерного для аллоксановой модели СД [27]. Под влиянием всех исследуемых средств содержание мочевины в крови достоверно
гликогена в печени, содержание которого под влиянием ^№-ЭБХК даже обнаруживало тенденцию к увеличению по сравнению с интактным контролем. Метформин способствовал значительному (в среднем в 2,3 раза, р<0,05) увеличению лактаци-демии, на фоне остальных исследуемых средств это увеличение было статистически незначимым. При этом значительно увеличивался уровень пирувата, и коэффициент «лактат/пируват» ни в одной группе не имел достоверных различий с показателем как интактного контроля, так и КП, хотя в сравнении с последним проявлял тенденцию к снижению, особенно под влиянием ДГ.
Состояние белкового обмена в исследуемых группах также различалось (таблица 2). В группе КП наблюдалась тенденция к гипопротеинемии, на фоне экспериментальной терапии ^№-ЭБхК и ДГ содержание общего белка в сыворотке крови практически не изменялось, а метформин вызывал достоверную гипо-протеинемию (р<0,05 против интактного контроля) - главным образом за счет альбуминов, уровень которых оказался ниже, чем в группе ДГ.
снижалось, особенно на фоне метформи-на, хотя и не нормализовалось полностью (таблица 2).
Как видно из таблицы 3, в остром периоде аллоксанового СД содержание Т№-а в крови возрастало в среднем в 2,5 раза (р<0,001 против интактного контроля). Под влиянием всех противодиабетических средств этот показатель статистически значимо снижался в сравнении с таковым
Таблица 2 - Влияние ^№-(этан-1,2-диил)бис(хинолин-2-карбоксамида), диакамфа гидрохлорида и метформина на показатели белкового обмена на модели аллоксанового __сахарного диабета у крыс (3 сутки)_
Показатели Интактный контроль Модель сахарного диабета
Контрольная патология ^№-(этан-1,2-диил) бис(хинолин-2-карбоксамид) Диакамфа гидрохлорид Метформин
Общий белок плазмы крови, г/л 67,42±1,40 62,30±4,07 64,37±3,70 69,07±4,54 61,52±1,70*
Альбумины, г/л 29,78±0,88 30,21±1,09 30,10±1,22 31,80±1,01 28,62±0,80$
Мочевина плазмы крови, ммоль/л 5,40±0,49 26,09±10,29* 10,67±4,40# 11,35±3,67# 7,20±1,36#
Примечание: статистически значимые различия (р<0,05): * - по отношению к интактному контролю, # - по отношению к контрольной патологии, $ - по отношению к группе диакамфа гидрохлорида.
в группе КП (в 1,5-1,65 раза), оставаясь, однако, достоверно выше, чем в интактном контроле. Будучи многофункциональным провоспалительным маркером, ТЫЫБ-а влияет на липидный метаболизм, гемоко-агуляцию и чувствительность к инсулину [28, 29]. Нормализация его содержания в крови свидетельствует об иммунотропных свойствах всех трех исследуемых средств,
что способствует уменьшению инсулино-резистентности.
Значительные изменения маркеров цитолиза (активность АлАТ и АсАТ) отсутствовали. Выявлена лишь тенденция к ее повышению в крови в группе КП, тогда как на фоне всех противодиабети-ческих средств она не превышает норму (таблица 3).
Таблица 3 - Влияние Ы,Ы'-(этан-1,2-диил)бис(хинолин-2-карбоксамида), диакамфа гидрохлорида и метформина на содержание ТЫЫБ-а, маркеры цитолиза и прооксидантно-
Показатели Интактный контроль Модель сахарного диабета
Контрольная патология Ы,Ы'-(этан-1,2-диил)бис(хинолин-2-карбоксамид) Диакамфа гидрохлорид Метформин
Плазма крови
ТЫБ-а, пг/мл 28,23±0,76 69,89±4,70* 42,28±6,45*# 46,49±8,32*# 43,29 ±5,09*#
АлАТ, ммоль/ (чл) 0,78±0,02 0,85±0,08 0,74±0,02 0,74±0,03 0,76±0,02
АсАТ, ммоль/(чл) 1,41±0,08 1,51±0,20 1,26±0,09 1,24±0,20 1,27±0,04
Коэффициент де Ритиса 1,78±0,06 1,79±0,05 1,70±0,13 1,60±0,10 1,69±0,07
Печень
ТБК-АП, нмоль/г ткани 21,53 ±2,89 38,13 ±4,94* 27,79±3,99# 25,30±3,00# 24,23±2,90#
Каталаза, мкмольН2О2/г ткани за с 0,74±0,23 2,79±1,17 1,36±0,42 1,57±0,41 2,00±0,86
СОД, у.е. /г ткани 143,4±8,95 137,6±12,2 128, 9±10,9 112,5±25,7 167,2±32,5
контролю, # - по отношению к контрольной патологии.
к интактному
В механизме диабетогенного действия аллоксана значительная роль принадлежит активации процессов ПОЛ [30-32]. В группе КП отмечалось значительное увеличение концентрации ТБК-АП в печени в среднем в 1,8 раза (р<0,05), все исследуемые противодиабетические средства достоверно нормализовали этот показатель (таблица 3).
Гистологически в ПЖ интактных крыс четко дифференцируются преобладающая экзокринная паренхима и инкреторный аппарат - островки с оптической плотностью 19,8±1,53, среди которых количественно преобладают средние (таблица 4).
Ацинарные структуры плотно прилегают друг к другу, состоят из одного слоя железистых клеток, имеющих две по-разному прокрашенные зоны: базальную базофиль-
ную, где находятся ядра, и апикальную эо-зинофильную с мелкими зернами зимогена (рисунок 1а, см. обложку журнала). Соотношение зон колеблется в пределах 1:1,5 -1:2,5. Междольковая соединительная ткань представлена скудно, внутри- и междоль-ковые выводные протоки, артерии и вены не изменены. Панкреатические островки округлой или овальной формы, четко отделены от окружающей ацинарной паренхимы. Эпителиоциты в островках расположены тяжами, разделенными капиллярами. Центральная часть островков плотно и равномерно заполнена Р-клетками (80-90% общего количества инсулоцитов), периферия - а-клетками (рисунок 1б, см. обложку журнала). Такая локализация островковых клеток типична для крыс [33]. ФИ составил 5,13±0,04 (таблица 4).
Таблица 4 - Морфометрический анализ состояния инкреторного аппарата поджелудочной железы крыс через 3 дня после моделирования аллоксанового сахарного диабета и коррекции исследуемыми противодиабетическими средствами
Группа Оптическая плотность островков Распределение панкреатических островков по содержанию Р-клеток и периметру, % Ме ^0;и0) ФИ (Р-/а- клетки)
мелкие -до 20 клеток, 300-550 мкм средние -21-60 клеток, 600-1200 мкм крупные ->60 клеток, 1400-2500 мкм
Интактный контроль 19,8±1,53 25,9±2,46 55,2±1,92 18,9±3,31 5,13±0,04
Контрольная патология (диабет) 5,25±0,37* 73,0±8,26* 23,16±4,65* 3,86±1,50* 0,28±0,01*
Диабет + ^№-ЭБХК 12,2±1,34*# 54,8±3,35*# 43,0±3,93*# 2,20±1,39* 2,08±0,35*#
Диабет + ДГ 11,6±1,53*# 52,9±3,03*# 44,5±2,39*# 2,60±0,26* 2,09±0,43*#
Диабет + метформин 12,4±0,96*# 52,2±2,56*# 44,6±2,61*# 3,20±1,53* 2,05±0,10*#
Примечание: N ,№-ЭБХК - ^№-(этан-1,2-диил)бис(хинолин-2-карбоксамид), Д Г - диакамфа
гидрохлорид, ФИ - функциональный индекс; статистически значимые различия (р<0,05): * - по отношению к интактному контролю, # - по отношению к контрольной патологии.
Через 3 дня после введения аллоксана в ПЖ крыс группы КП достоверно (р<0,001) уменьшалось количество островков - их оптическая плотность снизилась в среднем в 3,8 раза (таблица 4). В оставшихся островках имел место отек стромы, дегенеративные изменения и гибель Р-клеток в виде апоптоза, карио- и цитолиза. При массивном характере поражения страдали и а-клетки - цитоплазма становилась ацидофильной, конденсированной, ядерный материал имел вид фрагментов разной величины (рисунок 2, см. обложку журнала).
В группе КП выявлены почти «пустые» островки - очевидно, после массовой гибели клеток (рисунок 3 а, см. обложку журнала). Иногда островки практически исчезали (рисунок 3б, см. обложку журнала). Наряду с дегенеративно или апоптотиче-ски измененными Р-клетками видны про-лифераты в местах локализации а-клеток или бессистемно по всему островку (рисунок 4, см. обложку журнала). Это могут быть а-клетки, а также дельта-клетки. В результате гибели Р-клеток ФИ снизился (таблица 4) в 18,3 раза - до 0,28 (р<0,001). Периметр островков часто не совпадал с островковым профилем. Например, островок с периметром 2019 мкм содержал не более 30 клеток, а с периметром 442 мкм -23 клетки. Это затрудняло распределение островков на мелкие, средние и крупные, но визуально и морфометрически значительно уменьшилось количество сред-
них (на 32%, р<0,01) и крупных (на 15%, р<0,05), а мелких - увеличилось в 2,8 раза, р<0,01 (таблица 4). Часто островки приобретали неправильную форму, четкая граница с окружающей ацинозной паренхимой отсутствовала.
Типично значительное уменьшение базофильно окрашенной зоны ацинарных клеток, деструкция ацинусов (рисунок 5 а, см. обложку журнала). В междольковых артериях имеет место фибриноидное набухание сосудистой стенки, повышение проницаемости с периваскулярными плаз-моррагиями, макрофагальная реакция (рисунок 5б, см. обложку журнала).
У 40% животных, получавших ЭБХК, эндокринная составляющая в дольках ПЖ по сравнению с показателями группы КП увеличена (до 13-16 на микропрепарат). Островки в основном типичной формы, густо и равномерно заполнены клетками с тенденцией к характерному расположению тяжами (исходя из локализации - Р-инсулиноцитами), четко отделены от ацинозной ткани. Большинство островковых клеток без признаков деструкции и дистрофии, ядра их мономорф-ны (рисунок 6, см. обложку журнала). Количество Р-клеток от 33 до 70 на островок, хотя периметр последних не превышал 870 мкм (у интактных животных периметр островков с таким количеством клеток составлял 900-1600 мкм). В части островков наблюдалась умеренная пролиферация
а-клеток. ФИ инкреторного аппарата у этих крыс возрос до 3,19.
У остальных 60% животных на фоне Ы,Ы'-ЭБХК возрастало количество панкреатических островков (до 10,66 на микропрепарат), но среди них много мелких, нередко с дистрофически измененными клетками и зонами опустошения (рисунок 7, см. обложку журнала). Количество Р-клеток не превышало 30, периметр островков - от 250 до 400 мкм, ФИ составлял 1,35. В сравнении с КП оптическая плотность островков возросла в 2,3 раза (р<0,001), доля средних островков - в 1,86 раза (р<0,02), количество мелких островков снизилось в 1,75 раза (таблица 4).
У большинства животных, получавших ЫЫ'-ЭБХК, имели место пролиферация протокового эпителия, мелкие участки дезорганизации ацинусов, нарушения целостности стенки междольковых артерий. Отмечались единичные диапедезные кровоизлияния, фибриноидное набухание артериальной стенки, плазморрагии (рисунок 8, см. обложку журнала). Мозаично обнаруживались участки с разным функциональным состоянием ацинарных клеток (рисунок 9, см. обложку журнала).
Аналогичное влияние оказал ДГ. У 2 из 5 животных (40%) повышалась численность панкреатических островков (15-16), насыщенность их Р-клетками с нормальными морфологическими характеристиками. Имели место и островки с опустошением центральных отделов, признаками карио- и цитолиза инсулиноцитов, отеком стромы (рисунок 10, см. обложку журнала). Содержание Р-клеток на островок колебалось от 25 до 77, периметр островка - от 701 до 1318 мкм. ФИ инкреторного аппарата этих крыс достигал 3,04.
У остальных 60% крыс панкреатические островки относительно немногочисленны (8-10) с преобладанием мелких, клетки часто с признаками деструкции, видны зоны опустошения (рисунок 11а, см. обложку журнала). Но и в таких островках прослеживалось стимулирующее влияние ДГ на Р-клетки в виде митоза последних (рисунок 11б, см. обложку журнала). Количество Р-клеток редко превышало 26, периметр островков - от 200 до 500 мкм, функциональный индекс составлял 1,47. В среднем в группе животных, получавших ДГ, оптическая плотность островков ПЖ составила 11,6 (р<0,01 против КП),
количество средних островков превысило таковое в КП в 1,92 раза (р<0,01), мелких - снизилось в 1,38 раза, ФИ составил 2,09 (таблица 4).
В экзокринной части ПЖ у всех крыс обнаруживались обширные участки, содержащие ацинусы, в клетках которых расширена зимогенсодержащая зона цитоплазмы, что приводило к очаговому нарушению рисунка ткани. Отмечена умеренная пролиферация эпителия меж- и внутридольковых выводных протоков. Состояние стенки междольковых артерий без изменений (рисунок 12, см. обложку журнала).
При лечении метформином у всех крыс заметны положительные изменения состояния инкреторного аппарата ПЖ. Оптическая плотность панкреатических островков возросла в 2,36 раза, но их состояние значительно различалось - встречались и нормальные островки, и с деструктивно измененными Р-клетками (рисунок 13, см. обложку журнала), и опустошенные, и заполненные пролиферирующими а-клетками (рисунок 14, см. обложку журнала).
Число мелких островков уменьшилось в сравнении с КП на 20,8% (р<0,05) средних - возросло в 1,92 раза (р<0,02), хотя их периметр и островковый профиль не всегда соответствовали норме. ФИ составил 2,05, р<0,001 против КП (таблица 4).
Экзокринная часть железистой ткани у всех крыс этой группы не имела видимых нарушений структуры. В цитоплазме ацинозных клеток объем базофильной и эозинофильной зон часто значительно колеблется, стенки артерий не повреждены (рисунок 15, см. обложку журнала).
Обобщение результатов показывает, что через 3 суток после введения аллок-сана в ПЖ выявляются грубые структурно-функциональные изменения в виде значительного (в 3,77 раза) уменьшения оптической плотности панкреатических островков, их деформации, массивной гибели Р-клеток в виде апоптоза и некроза, пролиферации а-клеток. В результате резко уменьшается ФИ инкреторного аппарата, уменьшается периметр островков, возникает несоответствие островкового профиля периметру островков. В стенке междольковых артерий выявляются дистрофические изменения в виде фибрино-идного набухания, повышения проницае-
мости и периваскулярных плазморрагий. По данным литературы [34], такие изменения связаны с наблюдаемой гипоинсули-немией, нарушающей усвоение глюкозы клетками, и развитием дистрофических изменений в артериальной стенке. Отсутствием селективности влияния аллоксана только на Р-клетки [30] поясняется выраженное функциональное напряжение аци-нарных клеток экзокринной части ПЖ с появлением участков их деструкции.
Эти выраженные нарушения гисто-структуры ПЖ соответствуют тяжести состояния, приведшей к гибели 11,1% животных группы КП, и значительным метаболическим изменениям у выживших животных - резкой гипоинсулинемии и гипергликемии, лактоацидозу, истощению запаса гликогена в печени. Роль проокси-дантных свойств аллоксана в механизме повреждения ПЖ подтверждает повышение содержания ТБК-АП в крови. О развитии воспалительного процесса с вовлечением сложных иммунологических механизмов свидетельствует более чем двукратное увеличение концентрации ТЫЫБ-а в плазме крови. Кроме прямых про-воспалительных и иммунорегулирующих свойств, ТЫБ-а демонстрирует широкий спектр эффектов в сфере регуляции апоп-тоза, метаболических процессов. Он ослабляет трансдукцию инсулинового сигнала, снижая активность тирозинкиназы рецептора инсулина, уменьшает экспрессию внутриклеточных переносчиков глюкозы и снижает поступление глюкозы в мышечную и жировую ткань [28, 29].
Потенциальное противодиабетическое средство Ы,Ы'-ЭБХК проявляет лечебный эффект, повышая выживаемость крыс в критическом периоде экспериментального СД за счет увеличения устойчивости Р-клеток к токсическому действию аллок-сана. Морфологически это проявляется возрастанием количества островков в ПЖ, снижением выраженности апоптоза и некроза Р-клеток, появлением функционально более полноценных, чем в группе КП, инсулиноцитов, соответствием остров-кового профиля периметру островков, уменьшением пролиферации а-клеток, увеличением ФИ инкреторного аппарата. Указанные изменения хорошо согласуются с двукратным повышением инсулине-мии относительно показателя группы КП, а также с возрастанием запаса гликогена в
печени, снижением выраженности ПОЛ, количества ТЫБ-а и мочевины в крови. Уменьшение уровня ТЫБ-а может быть предиктором ослабления инсулинорези-стентности и эффективности Ы,Ы'-ЭБХК при СД 2 типа, что требует дальнейшего исследования.
Экспериментальная терапия диабетических животных ДГ также способствует 100% выживаемости в критическом периоде аллоксанового СД. Исследуемое антидиабетическое средство аналогично ЫЫ'-ЭБХК улучшает морфофункциональ-ное состояние ПЖ, причем особенно вы-раженно (почти в 3 раза) увеличивает содержание инсулина в крови. Остальные биохимические и иммунологические маркеры противодиабетического эффекта ДГ выражены в такой же степени, что и на фоне ЫЫ'-ЭБХК. Снижение уровня ТЫБ-а в крови согласуется с установленным ранее уменьшением инсулинорезистентно-сти под влиянием диакамфа [10].
Результаты исследования являются новым доказательством эффективности метформина на модели аллоксанового СД. Метформин не обеспечил полный защитный эффект по показателю летальности, что, возможно, связано с типичной для этого противодиабетического средства гипер-лактацидемией (таблица 1). Однако у выживших животных отмечается улучшение гистоструктуры ПЖ и функциональных показателей, характеризующих состояние углеводного обмена, ПОЛ и иммунного ответа в сравнении с КП. Неблагоприятным эффектом метформина, кроме гиперлакта-цидемии, является гипопротеинемия, отсутствующая на фоне Ы,Ы'-ЭБХК и ДГ.
Таким образом, перспективные про-тиводиабетические средства Ы,Ы'-ЭБХК и ДГ на модели аллоксанового диабета у крыс характеризуются политропным механизмом действия и не уступают, а по ряду показателей превосходят метформин.
ВЫВОДЫ
1. На модели аллоксанового сахарного диабета у крыс установлено, что в остром периоде (3 сутки), когда отмечается массовая гибель панкреатических Р-клеток, Ы,Ы'-(этан-1,2-диил)бис(хинолин-2-карбоксамид), диакамфа гидрохлорид и метформин оказывают терапевтический эффект.
2. ^№-(этан-1,2-диил)бис(хинолин-2-карбоксамид) и диакамфа гидрохлорид устраняют раннюю летальность диабетических животных, уменьшают выраженность гипергликемии, гипоинсулине-мии, степень повреждения островковых Р-клеток и нарушений гистоструктуры поджелудочной железы, способствуют нормализации содержания гликогена в печени, проявляют антиоксидантные свойства.
3. В механизме действия ^№-(этан-1,2-диил)бис(хинолин-2-карбоксамида) и диакамфа гидрохлорида принимает участие уменьшение уровня TNF-a в крови.
4. ^№-(этан-1,2-диил)бис(хинолин-2-карбоксамид) и диакамфа гидрохлорид имеют преимущества перед метформи-ном, который, несмотря на существенное уменьшение степени повреждения поджелудочной железы, не обеспечивает достоверное снижение ранней летальности, вызывает гиперлакацидемию и гипопроте-инемию.
SUMMARY
E. N. Kalapko, S. Yu. Shtrygol, T. V. Gorbatch, Yu. B. Laryanovskaya, S. I. Merzlikin A COMPARATIVE ANALYSIS OF N,N-(ETHANE-1,2-DYYIL) BIS(QUINOLINE-2-CARBOXAMIDE), DIAKAMPH HYDROCHLORIDE, AND METFORMIN EFFICACY IN THE ACUTE PERIOD OF ALLOXAN-INDUCED DIABETES IN RATS Being one of the most important problems of modern medicine and pharmacy, the treatment of diabetes mellitus requires the search for new drugs and in-depth study of the mechanisms of action of the known drugs. The objective of this study is to conduct comparative analysis of the influence of new drugs N,N'-(ethane-1,2-dyyil)bis(quinoline-2-carboxam-ide) and diakamph hydrochloride, as well as metformin (11.64 mg/kg, 25 mg/kg, 100 mg/ kg respectively), administered intragastri-cally using a treatment regimen, on survival rate, carbohydrate and protein metabolism, the intensity of lipid peroxidation, the level of TNF-a, as well as histological structure of the pancreas in the acute period of alloxan-induced diabetes in rats. N,N'-(ethane-1,2-dyyil)bis(quinoline-2-carboxamide) and di-akamph hydrochloride cause a statistically
significant increase in survival rate, reduction of hyperglycemia, hypoinsulinemia, TNF-a content in the blood, decrease in the degree of damage to islet P-cells as well as in the disturbances of histostructure of pancreas, normalize the hepatic glycogen levels and exhibit antioxidant properties. Both new drugs show advantages over metformin, which reduces the degree of damage to the pancreas, still not being able to reduce early mortality and causing hypoproteinemia and hyperlactacidemia.
Keywords: alloxan-induced diabetes, N,N'-(ethane-1,2-dyyil)bis(quinoline-2-car-boxamide), diakamph, metformin.
ЛИТЕРА ТУРА
1. Чернобров, А. Д. Довщник основних показниюв дiяльностi ендокринолопчно! служби Украши за 2011 рш / А. Д. Чернобров // Ендокринолопя. - 2012. - Т. 17. -№ 1. - 36 с.
2. Califf, R. M. Insulin resistance: a global epidemic in need of effective therapies / R. M. Califf // Eur. Heart J. Supplements. -2003. - Vol. 5. - Р. 13-18.
3. Kozak, B. M. International Diabetes Federation (IDF) highlights growing global impact of diabetes in 5th edition of the Diabetes Atlas / B. M. Kozak, M. Y. Tjota, K. L. Close // J. Diabetes - 2012. - Vol. 4. -P. 8-17.
4. Echeverria, M. Synthesis and biological evaluation of heteroaryl diamines as cytotoxic agents, apoptosis inducers and caspase-3 activators / M. Echeverria, B. Mendivil, L. Cordeuetal // Arch. Pharm. Chem. Life Sci. - 2006. - Vol. 339. - P. 182-192.
5. Гостра токсичшсть та гiпоглiкемiчна актившсть ^№-(етан-1,2-дшл)бю(хшолш-2-карбоксамщу) / О. М. Калапко [ra шш.] // КлЫчна фармащя. - 2014. - Т. 18. - №12. -С. 41-45.
6. Застосування ^№-(етан-1,2-дшл) бю(хшолш-2-карбоксамщу) як засобу з гiпоглiкемiчною дieю: пат. 89726UA Украина: МПК A61P 5/50 (2006. 01) A61K31/33 (2006. 01) A61K 31/195 (2006.01) / О. М. Калапко, С. Ю. Штриголь, Б. В. Папо-нов, С. В. Львов; заявник та власник НФаУ -u 2013 14600; заявл. 13.12.2013; дата опубл. 25. 04. 2014 р. - Бюл. №8, 2014. - 3 с.
7. Калапко, О. М. 1нновацшш пер-спективи використання ^№-(етан-1,2-дшл)бю(хшолш-2-карбоксамщу) як потенцшного гiпоглiкемiчного засобу
/ О. М. Калапко, С. Ю. Штриголь, Б. В. Папонов, С. В. Львов - 1нформ. лист Укрмедпатентшформу МОЗ Украши № 120-2014 вщ 19.02.2014 р. про ново-введення в системi охорони здоров'я. - К., 2014. - 5 с.
8. Investigation of the role of I1- and I2-imidazoline receptors in the mechanism of hypoglycemic action of N,N'-(ethane-1,2-dyyil) bis(quinoline-2-carboxamide) / O.N. Kalapko [et al.] // News of Pharmacy. - 2014. - №3 -Vol. 79 - P. 74-77.
9. Калапко, О. М. Мехашзм антиriперглiкемiчноi дп потенцiйного оригiнального протидiабетичного препарату ^№-(етан-1,2-дшл)бю(хшолш-2-карбоксамiду) / О. М. Калапко, С. Ю. Штриголь // Досягнення та перспек-тиви експериментально'1 та кшшчно'1 ендокринологл (Чотирнадцятi Данилевсью читання), 2-3 березня 2015 року. -Харюв: Видавництво 1нституту проблем ендокринно'1 патологи iм. В. Я. Данилевсь-кого НАМН Украши, 2015. - С. 72-73.
10. Сучасш аспекти перорально'1 фармакотерапп цукрового дiабету 2 типу. Досягнення НФаУ: монографiя / В. П. Чер-них, Л. М. Малоштан, Н. I. Горбенко [та шш.] // Х.: БУРУН i К, 2010. - 208 с.
11. Роль iмiдазолiнових рецепторiв I1 та I2 титв у реалiзацii механiзму цукроз-нижувально'1 дп дiакамфу гiдрохлориду та метформ^ / О. М. Калапко [та iнш.] // Украшський бiофармацевтичний журнал. -2014. - № 3. - Т. 32. - С. 41-44.
12. Шатшова, О. А. Експерименталь-не вивчення церебропротекторних та пси-хотропних властивостей дiакамфу: авто-реф. дис. ... канд. фарм. наук / О. А. Шатилова. - Х., 2010. - 20 с.
13. Шведський, В. В. Корекщя дiакам-фу гщрохлоридом порушень мозкового кровообiгу на тл цукрового дiабету (екс-периментальне дослщження): автореф. дис. . канд. мед. наук / В. В. Шведський. -Х., 2012. - 20 с.
14. Novel mechanism for plasma glucose-lowering action of metformin in strep-tozotocin-induced diabetic rats / J. T. Cheng [et al.] // Diabetes. - 2006. - Vol. 55. -P. 819-825.
15. Council of Europe. 1986. "European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes". In Strasbourg: Council of Europe, Obtainable London: HMSO.
16. Dave, K. R. Effect of alloxan-induced diabetes on serum and cardiac butyril cholines terases in the rat / K. R. Dave, S. S. Katyare // J. Endocrinol. - 2002. - Vol. 175. - № 1. -Р. 241-250.
17. Доклшчш дослщження лшарських 3aco6iB: Метод. рекоменд. / За ред. чл.-кор. НАМН Украши, акад. О.В. Стефанова. -К.: Авщенна, 2001. - 400 с.
18. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. д-ра мед. наук А. Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - Часть первая. - 944 с.
19. Алеева, Г. Н. Клеточные механизмы развития гипергликемии и её фармакологическая коррекция при аллоксановом диабете : автореф. дис. ... канд. мед. наук / Г. Н. Алеева. - Казань, 2002. - 20 с.
20. Templeton, M. Microdetermination of glycogen with anthrone reagent / M. Templeton // J. Histochem. Cytochem. -1961. - Vol. 9. - P. 670-672.
21. Стальная, И. Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тио-барбитуровой кислоты / И. Д. Стальная, Т. Г. Гаришвили // Современные методы в биохимии / ред. В. Н. Орехович. - М.: Медицина, 1977. - С.66-68.
22. Королюк, М. А. Метод определения активности каталазы / М. А. Королюк // Лаб. дело. - 1988. - № 1.- С. 16-19.
23. Сирота, Т. В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использования его для измерения активности супероксиддисмутазы / Т. В. Сирота // Вопр. мед. химии. - 1999. - Т. 45, № 3. - С. 263-272.
24. Камышников, В. С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: в 2 т. / В. С. Камышников. -Минск: «Беларусь», 2000. - Т. 1 - 495 с.
25. Меркулов, Г. А. Курс патологоги-стологической техники / Г. А. Меркулов. -М.: Медицина, Ленингр. отд-ние, 1969. -424 с.
26. Халафян, А. А. STATISTICA 6. Статистический анализ данных. 3-е изд. Учебник / А. А. Халафян. - М.: ООО «Бином-Пресс», 2007. - 512 с.
27. Штрыголь, В. С. Нефропротек-торные свойства диакамфа на модели ал-локсанового сахарного диабета у мышей / В. С. Штрыголь, О. В. Товчига, С. И. Мерз-ликин // Журнал клшчно!' та лабораторно'1 медицини. - 2009. - Т. 4, № 2. - С. 101-104.
28. Adipose tissue tumor necrosis factor and interleukin-6 expression in human obesity and insulin resistance / P. A. Kern [et al.] // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. - 2001. -Vol. 280. - P. 745-751.
29. Lion, C. J. Minireview: Adiposity, Inflammation, and Atherogenesis / C. J. Lion, R. E. Law, W. A. Hsueh // Endocrinology. -2003. - Vol. 144, N. 6. - P. 2195-2200.
30. Lenzet, S. Alloxan: history and mechanism of action / S. Lenzet, V. Panten // Diabetol. - 1988. - Vol. 31. - P. 337-342.
31. Effect of zinc on the lipid peroxidation and the antioxidant defense systems of the alloxan-induced diabetic rabbits // Free Radical Biology and Medicine. - 2007. - Vol. 42, Issue 10. - P. 1481-1486.
32. Ahmadvand, H. Amelioration of altered antioxidant enzymes activity and glomerulosclerosis by coenzyme Q10 in alloxan-induced diabetic rats / H. Ahmadvand, M. Tavafi, A. Khosrowbeygi // J. of Diabetes
and its Complications. - 2012. - Vol. 26, iss. 6. - P. 476-482.
33. Хэм, А. Гистология: Пер. с англ. / А. Хэм, Д. Кормак. - М.: Мир, 1983. -Т. 5. - 296 с.
34. Михайличенко, В. Ю. Роль инсу-лярных и контринсулярных гормонов в патогенезе аллоксанового диабета у крыс в эксперименте / В. Ю. Михайличенко, С. С. Столяров // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - № 4. -C. 27-34.
Адрес для корреспонденции:
61002, Украина,
г. Харьков, ул. Пушкинская, 53,
Национальный фармацевтический университет,
кафедра фармакологии
и лекарственной токсикологии,
тел. (+38099) 7936630,
e-mail: shtrygol@mail.ru,
Штрыголь С. Ю.
Поступила 14.03.2016 г.
С. С. Скринаус, С. С. Лазуко
ВЛИЯНИЕ ТЕТРАЭТИЛАММОНИЯ НА ТОНУС КОРОНАРНЫХ СОСУДОВ В УСЛОВИЯХ БЛОКАДЫ КОНСТИТУЦИОНАЛЬНОЙ И ИНДУЦИРУЕМОЙ Ш-СИНТАЗЫ ДО И ПОСЛЕ ИММОБИЛИЗАЦИОННОГО СТРЕССА
Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет
Целью работы было выяснить влияние тетраэтиламмония на объемную скорость коронарного потока, индекс ауторегуляции, максимальный гиперемический поток, коронарный расширительный резерв и интенсивность перфузии в условиях блокады конституциональной и индуцируемой NO-синтазы. В результате исследования было показано, что стресс снижает влияние тетраэтиламмония на тонус коронарных сосудов. После перенесенного стресса на фоне блокады конституциональной NO-синтазы действие тетраэтиламмония на сосудистый тонус выражено в большей степени, чем в группе животных, перенесших стресс, с интактной системой синтеза NO, но при этом оставалось ниже, чем в контроле. После иммобилизации на фоне блокады индуцируемого монооксида азота влияние тетраэтиламмония на тонус сосудов восстанавливается до величин, обнаруженных в сердцах контрольных животных, не обработанных блокаторами синтеза монооксида азота. Таким образом, постстрессорное нарушение тонуса коронарных сосудов в значительной степени вызывается индуцируемой NO-синтазой, образующейся при стрессе.
Ключевые слова: тонус сосудов, монооксид азота, тетраэтиламмоний, калиевые каналы.
ВВЕДЕНИЕ стве экономически развитых стран явля-
ются сердечно-сосудистые заболевания.
Одной из главных причин заболевае- В связи с этим, по-прежнему, актуальной мости и смертности населения в большин- проблемой физиологии сердечно-сосуди-
Рисунки к статье Е. Н. Калапко, С. Ю. Штрыголь, Т. В. Горбач, Ю. Б. Ларьяновская, С. И. Мерзликин «Сравнительный анализ эффективности ^№-(этан-1,2-диил)бис(хинолин-2-карбоксамида), диакамфа гидрохлорида и метформина в остром периоде аллоксанового сахарного диабета у крыс» (С. 67-77)
а - увеличение количества панкреатических островков (стрелки); б - нормальное содержание Р-клеток, мелкий участок пролиферации а-клеток на периферии островка (стрелки); в - уменьшение содержания деструктивно и апоптотически измененных Р-клеток Рисунок 13 - Поджелудочная железа крыс, получавших метформин, через 3 дня после моделирования аллоксанового диабета. Гематоксилин-эозин. х 100 (а), х 200 (б), х 200 (в)
а - опустошение панкреатического островка, зональная пролиферация а-клеток (стрелка); б - диффузная пролиферация
а-клеток в полностью опустошенном островке (стрелка) Рисунок 14 - Поджелудочная железа крыс, получавших метформин, через 3 дня после моделирования аллоксанового диабета. Гематоксилин-эозин. х 200 (а), х 250 (б)
а - большая и б - меньшая выраженность по-разному прокрашенных зон в цитоплазме ацинозных клеток; в - нормальное состояние стенки междольковой артерии Рисунок 15 - Поджелудочная железа крыс, получавших метформин, через 3 дня после моделирования аллоксанового диабета. Гематоксилин-эозин. х 400 (а), х 250 (б, в)
Рисунки к статье Е. В. Должикова, Л. Н. Малоштан Изучение влияния суппозиториев вагинальных «Меланизол» на репродуктивную систему кроликов при длительном применении (С. 87-91)
V ii ' /Ла
h ■ ' >i.* ■ ■
в
■■
а - интактного; б - после введения суппозиториев «Меланизол»; в - а - интактного; б - после введения суппозиториев «Меланизол»
после введения плацебо. Яйцевые фолликулы разной степени развития. в - после введения плацебо. Гематоксилин-эозин х 200.
Гематоксилин-эозин. х 200. Рисунок 3 - Яичник кролика-самки
Рисунок 4 - Эндометрий кролика-самки
Дистальная часть (а-в), проксимальная часть (г-е): а, г - интактного кролика; б, д - после введения суппозиториев «Меланизол»; в, е - после введения плацебо. Слизистая без изменений. Гематоксилин-эозин х 200. Рисунок 5 - Влагалище кролика-самки
