CC BY
2
НАУЧНАЯ СТАТЬЯ УДК 577.25
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДИНАМИЧЕСКОГО ПОВЕДЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФОТОРЕГУЛИРУЕМЫХ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗ bPAC И OаPAC
Мария Сергеевна Курышкина1, 2, Анна Михайловна Кулакова1, 2, Александр Александрович Московский1, 2, Мария Григорьевна Хренова1, 2
1 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, Москва, Россия
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва, Россия Автор, ответственный за переписку: Мария Григорьевна Хренова, [email protected]
Аннотация. В работе проведено сравнение фоторегулируемых аденилатциклаз bPAC и OaPAC методами классической молекулярной динамики в состояниях до и после облучения светом. Определены пути передачи сигнала из фоторецеп-торного в каталитический домен. Большее ускорение каталитической реакции в результате облучения светом в случае bPAC обусловлено как смещением равновесия в сторону закрытой конформации, так и более значительным увеличением числа субоптимальных путей аллостерической передачи сигнала от одного домена к другому.
Ключевые слова: аденилатциклаза, аллостерическая регуляция, молекулярная динамика, динамический сетевой анализ
DOI: 10.55959/MSU0579-9384-2-2024-65-4-306-311
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 19-73-20032).
Для цитирования: Курышкина М.С., Кулакова А.М., Московский А.А., Хренова М.Г. Сравнительный анализ динамического поведения бактериальных фоторегулируемых аденилатциклаз bPAC и ОаРАС // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2024. Т. 65. № 4. С. 306-311.
ORIGINAL ARTICLE
COMPARATIVE STUDY OF THE DYNAMIC BEHAVIOR OF BACTERIAL PHOTOREGULATED ADENYLATE CYCLASES BPAC AND OAPAC
1, 2 1, 2 1, 2 Maria S. Kuryshkina ' , Anna M. Kulakova ' , Alexander A. Moskovsky ' ,
1, 2
Maria G. Khrenova
1 Chemistry Department, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia
2
N.M. Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
Corresponding Author: Maria G. Khrenova, [email protected]
Abstract. Photoregulated adenylate cyclases bPAC and OaPAC are compared using classical molecular dynamics simulations in both states, before and after blue light irradiation. The pathways of signal transduction from the photoreceptor to the catalytic domain are determined. The more pronounced acceleration of the catalytic reaction rate as a result of light irradiation in the case of bPAC is explained both by a shift
© Курышкина М.С., Кулакова А.М., Московский А.А., Хренова М.Г., 2024
in equilibrium towards a closed conformation and by a larger number of suboptimal pathways of allosteric signal transduction from photoreceptor to catalytic domain.
Keywords: adenylate cyclase, allosteric regulation, molecular dynamics, dynamic network analysis
Financial Support. The work was carried out with the financial support of the Russian Science Foundation (project No. 19-73-20032).
For citation: Kuryshkina M.S., Kulakova A.M., Moskovsky А.А., Khrenova M.G. Comparative Study of the Dynamic Behavior of Bacterial Photoregulated Adenylate Cyclases bPAC and OaPAC // Vestn. Mosk. un-ta. Ser. 2. Chemistry. 2024. T. 65. № 4. S. 306-311.
Сенсорные фоторецепторы лежат в основе светозависимых адаптивных механизмов живых организмов. Используемые в оптогенетике сенсорные фоторецепторы - генетически закодированные инструменты тонкого и обратимого управления клеточными процессами. Изучение структуры и свойств природных фоторецепторов способствует развитию в области создания искусственных систем с настраиваемой светозави-симой функцией, что значительно расширяет возможности оптогенетики, позволяя направленно регулировать такие процессы в клетке, как экспрессия генов, рекомбинация ДНК, активность ферментов, каскады передачи сигнала и др. [1].
Циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) является аллостерическим эффектором протеин-киназ и ионных каналов. Контроль концентрации цАМФ позволяет осуществить тонкую настройку различных биологических процессов. В частности, цАМФ, будучи важным посредником в регуляции выработки инсулина, делает эту молекулу привлекательной мишенью при лечении диабета. В качестве инструмента контроля концентрации цАМФ может быть использована оптогенетическая система на основе фотоакти-вируемой аденилатциклазы (PAC), катализирующей реакцию превращения аденозинтрифосфата (АТФ) в цАМФ с высвобождением пирофосфата [2]. В частности, высокогомологичные PAC бактерий Beggiatoa acuminata (bPAC) и Oscillatoria acuminata (OaPAC) благодаря малым размерам и низкой активности в невозбужденном состоянии представляют особой интерес в качестве фоторецептора оптогенетических систем. Однако, если в случае bPAC повышение скорости ферментативной реакции при фотовозбуждении возрастает на два порядка и не зависит от времени возбуждения, то для OaPAC скорость возрастает на один порядок и зависит от времени возбуждения. Это отличие может быть следствием изменения механизма фоторегуляции в зависимости от системы [3].
Согласно результатам молекулярного моделирования и ИК-спектроскопии при воздействии синего света на фоторецепторный домен фермента BLUF (blue light using flavin) хромофорная группа флавинмононуклеотида (FMN) не претерпевает никаких изменений, в то же время боковая цепь консервативного глутамина Gln49 хромо-фор-связывающего кармана таутомеризуется из амидной формы в имидную с вращением вокруг одинарной связи С-С. Предполагается, что данное изменение в структуре фоточувствительного домена инициирует конформационные переходы, лежащие в основе аллостерической регуляции активности фермента [4]. Ранее было установлено, что консервативный Arg278 активного сайта принимает различные конформации в состоянии до облучения светом (темном, D) и фотоактивированном (светлом, L), стабилизируя переходное состояние реакции [5].
В настоящей работе с помощью методов молекулярного моделирования выполнен сравнительный анализ ферментов OaPAС и bPAC. Для сравнения конформационных пространств этих систем было проведено молекулярно-динамиче-ское (МД) моделирование. С помощью полученных МД-траекторий посредством динамического сетевого анализа определены потенциальные пути аллостерической регуляции ферментов: аминокислотные остатки Gln49 и Arg278 были выбраны в качестве начальной и конечной точек соответственно.
Методы расчета
В качестве основы для получения полноатомных моделей ферментов bPAC и OaPAC в темном (D) и светлом (L) состояниях были выбраны кристаллические структуры PDB ID 5M2A и 5MBD, 4YUT и 5X4T из банка данных PDB. Для каждой из структур плохо разрешенные в ходе рентгеноструктурного анализа аминокислотные остатки были добавлены по данным о первичной
последовательности (UniProtA7BT71 и K9TLZ5). Атомы водорода добавляли с помощью программы Reduce в соответствии с нейтральным pH.
Полученные полноатомные модели белка с FMN сольватировались молекулами воды в прямоугольной ячейке так, чтобы расстояние от белковой молекулы до границ ячейки составляло не менее 20 А. Далее для нейтрализации общего заряда в систему добавляли ионы хлора.
Для каждой из систем проведено МД-моделирование с использованием программного пакета NAMD [6]. При описании белковой макромолекулы использовано силовое поле CHARMM36 [7], для FMN и имидной формы глутамина Gln49 ферментов в L-состоянии -CGenFF [8], для молекул воды - TIP3P [9]. Предварительно для релаксации сольватной оболочки и добавленных аминокислотных остатков был выполнен расчет траекторий с фиксированным положением атомов белка и FMN длиной 0,5 нс. В качестве стартовых структур для расчета МД были использованы структуры ближайшего локального минимума, полученные методом градиентного спуска. Все расчеты проводили в каноническом ансамбле NPT при давлении p = 1 атм и температуре T = 300 К, которые поддерживали с помощью баростата Нозе - Гувера и термостата Ланжевена соответственно. Шаг интегрирования для всех траекторий составил 1 фс, общая длина равнялась 200 нс для каждой системы.
Полученные МД-траектории обрабатывали с помощью сервиса NetworkView [10] и програм-
А1а277в А1а277А
мы УМЭ [11]. В рамках проводимого анализа все тяжелые атомы белка и БМН были разбиты на структурные фрагменты, формирующие вершины графа, которые соединялись ребрами с определенным весом, если атомы соответствующих фрагментов находились на расстоянии менее 4 А на протяжении 75% и более МД-траектории. Полученный граф разбивался на кластеры наиболее связанных между собой фрагментов с помощью алгоритма Гирвана - Ньюмена [12].
Для каждой системы определены кратчайшие пути между вершинами, относящимся к БМН и связанным с ним аминокислотным остаткам, и вершинами, относящимися к А^278 и окружающим его аминокислотным остаткам. Оптимальные пути между вершинами определяли с помощью алгоритма Флойда - Уоршелла [13]. Для полного описания системы наряду с оптимальным путем были получены и проанализированы субоптимальные пути, которые определялись как пути, длина которых не превышала длину оптимального пути более чем на 20 ед.
Результаты и обсуждение
Фотоактивируемые аденилатциклазы ЬРАС и ОаРАС - гомодимерные белки, каждая субъединица (А и В) которых состоит из Н-концевого фо-торецепторного ВЬИБ-домена и С-концевого аде-нилатциклазного каталитического домена (АС), соединенных перемычкой. АТФ-связывающий карман формируется каталитическими доменами каждой из субъединиц белка. При анализе
Ф
bPAC(D) bPAC(L) OaPAC(D) OaPAC(L)
Рис. 1. Строение фермента PAC (слева). Распределение усредненного значения характеристических углов фА и фв (град.) для bPAC и OaPAC в темном (D) и светлом (L) состоянии (справа)
МД-траекторий ЬРАС и ОаРАС в состояниях Б и Ь были обнаружены структуры, соответствующие открытой и закрытой формам АТФ-связывающего сайта. В качестве характеристической координаты этих форм были выбраны два угла: фА - между Са-атомами А1а277 каталитического домена субъединицы А, Рго146 перемычки субъединицы А и А1а277 каталитического домена субъединицы В; фВ - между Са-атомами А1а277 (А), Рго146 (В) и А1а277 (В) (рис. 1). При переходе из состояния Б в состояние Ь для ОаРАС распределение между открытой и закрытой формами АТФ-связывающего сайта не меняется, для ЬРАС преобладающей становится закрытая форма. Полученные результаты согласуются с экспериментальными данными: закрытая форма связывающего сайта может способствовать связыванию субстрата в более реак-ционноспособной конформации и, как следствие, преобладание этой формы может привести к повышению активности фермента.
Проведено разбиение на кластеры с помощью динамического сетевого анализа ЬРАС и ОаРАС в темном и светлом состояниях. Для ЬРАС в обоих состояниях было получено по 7 кластеров. Для ОаРАС при переходе от темного состояния к светлому число кластеров увеличилось с 8 до 10. Для
ЬРАС разбиения симметричны и соответствуют доменной структуре белка в обоих состояниях. Для ОаРАС разбиение несимметрично. Большее число кластеров для ОаРАС можно интерпретировать как меньшую связность этой структуры по сравнению с ЬРАС.
Далее для каждой из систем проводили поиск оптимальных путей фоторегуляции. По результатам этого анализа выделены следующие ключевые аминокислотные остатки аллостериче-ского пути переноса сигнала от ОаРАС к ЬРАС: С1п49 ^ Туг7 ^ Ьеи75 ^ Ии124 ^ Туг126 ^ ^ А1а276 ^ А^278 (рис. 2).
Передача сигнала в фоторецепторном домене весьма консервативна вне зависимости от системы (рис. 3). Пути передачи сигнала как по перемычке между функциональными доменами, так и внутри каталитического домена, более вариативны и зависят от состояния и типа системы. Аминокислотные остатки перемычки А^121-С1и145 являются ключевыми участниками передачи сигнала, однако при переходе из состояния Б в состояние Ь вероятность прохождения пути через С1и124 и Туг126 снижается и более часто встречаются остатки А8п136 для ЬРАС и 11е131 для ОаРАС. Наряду с указанными аминокислотными
Рис. 2. Пример кратчайшего пути передачи сигнала с выделенными ключевыми аминокислотными остатками
Рис. 3. Вероятность прохождения пути от флавин-связывающей области ВШР-домена (в1и49) до активного центра АС-домена (А^278) через заданный аминокислотный остаток ЬРАС (слева) и ОаРАС (справа)
в состояниях Б (серый) и Ь (черный)
остатками для каждой из систем становится важным и остаток 11е153. Стоит отметить существенное различие аллостерических путей регуляции ЬРАС и ОаРАС, заключающееся в высокой степени вовлеченности остатков а2-спирали (С1и172-Туг191), Р2 (С1и194-РИе 198), и Р3 (Уа1203-РИе207) листов каталитического домена в состоянии Б и Ь, в частности РИе198 и Уа1203. принимающих участие в формировании гидрофобного кармана для связывания аденина [14]. Кроме того, распределения вероятности участия в сигнальном пути различаются также у остатков Р4 (ТИг244-8ег260) и Р5 (Ме1264-Ьеи269) листов, выстилающих активные сайты каталитических доменов. Для ЬРАС эти структурные мотивы значительно вовлечены в сигнальные пути, ОаРАС соответствует высокая вероятность участия отдельных аминокислот этих структурных фрагментов. Ключевым участником сигнального пути ЬРАС в темном состоянии Р4 и Р5 листов является А8р265, при переходе в светлое состояние роль А8р265 становится незначительной. Для ОаРАС вне зависимости от состояния важную роль играет остаток №8266, при этом при переходе из Б в Ь
важный остаток С1и255 с меньшей вероятностью встречается в сигнальных путях. Различия в составе участников сигнальных путей и их изменение при переходе из Б в Ь позволяют объяснить тот факт, что для ЬРАС в процессе эксперимента наблюдается большее повышение активности при фотовозбуждении, чем для ОаРАС.
Длина кратчайшего пути как для ЬРАС, так и для ОаРАС, при переходе к структуре светлого состояния увеличивается. Однако значение длины оптимального пути для ЬРАС в состоянии как Б (203), так и Ь (246), а также степень ее увеличения оказываются меньшими, чем для ОаРАС (251 в Б и 368 в Ь). Кроме того, число субоптимальных путей для ЬРАС в каждом состоянии (372 в Б и 512 в Ь) и увеличение этого показателя при переходе из одного состояния в другое больше по сравнению с ОаРАС (39 в Б и 88 в Ь). Это различие может способствовать большему синергизму по пути ал-лостерической регуляции для системы ЬРАС.
Таким образом, в работе рассчитаны и проанализированы разными методами классические мо-лекулярно-динамические траектории. Это дало возможность объяснить изменение скорости
реакции при переходе рассматриваемых фото-регулируемых аденилатциклаз OaPAC и bPAC, а также охарактеризовать различия между ними. В bPAC в светлом состоянии равновесие смещается в сторону закрытой конформации, что, вероятно, связано с более эффективной передачей аллостерического сигнала в светлом состоянии
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Losi A. et al. // Chem Rev. 2018. Vol. 118. P. 10659 (DOI: 10.1021/acs.chemrev.8b00163).
2. Zhang F., Tzanakakis E.S. // Sci. Rep. 2017. Vol. 7. Р. 9357 (DOI: 10.1038/s41598-017-09937-0).
3. Stierl M. et al. // J. Biol. Chem. 2011, Vol. 286. P. 1181 (DOI: 10.1074/jbc.M110.185496).
4. Domratcheva T., Hartmann E., Schlichting I., Kottke, T. // Sci. Rep. 2016, Vol. 6. 22669 (DOI: 10.1038/ srep22669).
5. Khrenova, M.G., Kulakova, A.M., Nemukhin, A.V // J. Chem. Inf. Model. 2021. Vol. 61. P. 1215 (DOI: 10.1021/acs.jcim.0c01308).
6. Phillips J.C. et al. // J. Chem. Phys. 2020. Vol. 153. 044130 (DOI: 10.1063/5.0014475).
7. MacKerell A.D. et al. // J. Phys. Chem. B. 1998. Vol. 102. P. 3586 (DOI: 10.1021/jp973084f).
по сравнению с темным. В ОаРАС фоторегуляция проявляется слабее, что находит отражение в похожем распределении между закрытой и открытой конформациями, а также в меньшем числе субоптимальных путей переноса сигнала и их изменении при переходе от темного состояния к светлому.
8. Vanommeslaeghe K. et al. // J. Comput. Chem. 2010. Vol. 31. P. 671 (DOI: 10.1002/jcc.21367).
9. Jorgensen W.L. // J. Chem. Phys. 1983, Vol. 79. P. 926 (DOI: 10.1063/1.445869).
10. Eargle J., Luthey-Schulten Z. // Bioinformatics. 2012. Vol. 28. P. 3000 (DOI: 10.1093/bioinformatics/ bts546).
11. Humphrey W., Dalke A., Schulten K. // J. Mol. Graph. 1996. Vol. 14. P. 33 (DOI: 10.1016/0263-7855(96)00018-5).
12. Van Wart A.T. et al. // J. Chem. Theory Comput. 2014. Vol. 10. P. 511 (DOI: 10.1021/ct4008603).
13. Floyd R.W. // Commun. ACM. ACM, 1962. Vol. 5. P. 345 (DOI: 10.1145/367766.368168).
14. Lindner R. et al. // J. Mol. Biol. 2017.Vol. 429. P. 1336 (DOI: 10.1016/j.jmb.2017.03.020).
Информация об авторах
Мария Сергеевна Курышкина - аспирант лаборатории квантовой химии и молекулярного моделирования кафедры физической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, мл. науч. сотр. Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН ([email protected]);
Анна Михайловна Кулакова - доцент кафедры физической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, мл. науч. сотр. Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН ([email protected]);
Александр Александрович Московский - вед. инженер лаборатории квантовой химии и молекулярного моделирования кафедры физической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, ст. науч. сотр. Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН ([email protected]);
Мария Григорьевна Хренова - профессор кафедры физической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, вед. науч. сотр. Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН ([email protected]).
Вклад авторов
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Соблюдение этических стандартов
В данной работе отсутствуют исследования человека и животных.
Статья поступила в редакцию 10.03.2024; одобрена после рецензирования 16.03.2024; принята к публикации 25.03.2024.
