CC BY
49
БИОФИЗИКА
УДК 577.25
LOV- И BLUF-ФЛАВОПРОТЕИНЫ: РЕГУЛЯТОРНЫЕ ФОТОРЕЦЕПТОРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ И ФОТОСЕНСОРНЫЕ АКТИВАТОРЫ В ОПТОГЕНЕТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ
Г.Я. Фрайкин1, М.Г. Страховская12*, Н.С. Беленикина1, А.Б. Рубин1
1 Кафедра биофизики, биологический факультет, Московский государственный университет
имени М.В. Ломоносова;
Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12; 2 Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи
и медицинских технологий ФМБА;
Россия, 115682, г. Москва, Ореховый бульвар, д. 28 * e-mail: marstr@biophys.msu.ru
В последние годы показано, что LOV (light, oxygen, voltage)- и BLUF (Blue Light sensing Using FAD)-фотосенсорные белки выполняют функции фоторецепторов светорегу-лируемых процессов не только у эукариот, но и у многих прокариот. У бактериальных фоторецепторов LOV- и BLUF-домены с присоединенными флавиновыми хромофорами часто связаны с разными ферментными и другими эффекторными доменами и составляют модульные системы, переключаемые светом. К настоящему времени достигнут прогресс в раскрытии механизмов фотоактивации таких систем. Они основаны на индуцированных фотореакциями хромофоров изменениях в фотосенсорных доменных структурах и последующей трансдукции сигнала к эффекторным доменам. Знание принципов трансдукции сигнала LOV- и BLUF-фотосенсорами имеет важное значение для создания на их основе фотопереключаемых ферментов и транскрипционных систем, применяемых в оптогенетике — новой и активно развивающейся области клеточной биологии и биотехнологии. Рассматриваются структурные аспекты передачи сигнала светоактивированными LOV- и BLUF-фоторецепторами и их регуляторные функции у бактерий, а также некоторые недавние достижения в использовании LOV-и BLUF-фотосенсоров в качестве активаторов в оптогенетических системах для регуляции клеточных процессов.
Ключевые слова: LOV- и BLUF-фоторецепторы, трансдукция сигнала, бактерии, регуляция, оптогенетические системы, обзор.
Фотобиорегуляторные процессы опосредуются специализированными фоторецепторами, которые воспринимают световые сигналы и трансформируют их в биохимические сигнальные каскады, вызывающие физиологические ответы. У растений, грибов и бактерий идентифицировано несколько типов регуляторных фоторецепторов, в том числе чувствительные к красному свету фитохромы, чувствительные к синему свету криптохромы, фото-тропины и другие белки, содержащие ЬОУ- и БЬиЬ-домены [1].
Фотосенсорные БЬиЬ- и ЬОУ-домены — это короткие (100—140 аминокислотных остатков — а.о.) а/Р-модули, способные присоединять в качестве хромофоров флавины (ФАД или ФМН). ЬОУ-до-менные белки составляют обширную группу фоторецепторов, первоначально идентифицированные у фототропинов растений, а позднее — у грибов и многочисленных бактерий. Значительно менее распространенные БЬиЬ-доменные белки найдены пока только у некоторых эвгленоидов и бактерий. БЬиЬ-домены отличаются от ЬОУ-доменов осо-
бенностями вторичной структуры и специфическим типом первичных фотопревращений их флавино-вого хромофора. В БЬиЬ-доменах ФАД в фотовозбужденном состоянии инициирует сопряженный с протоном электронный транспорт между консервативным тирозиновым остатком и хромофором с последующей реорганизацией водородных связей вблизи него (рисунок). В ЬОУ-доменах ФМН под действием синего света подвергается фотоциклу, включающему формирование тиолового аддукта между изоаллоксазиновым кольцом флавина и консервативным цистеиновым остатком белка. Возникающие в фотосенсорных доменах структурные изменения индуцируют модуляцию активности эф-фекторных доменов или взаимодействующих с фоторецепторами белков [1, 2].
В последнее время достигнут прогресс в понимании механизмов восприятия света и трансдукции сигнала БЬиЬ- и ЬОУ-фоторецепторами, у бактерий выявлены и изучены опосредуемые ими свето-зависимые регуляторные процессы. Также имеются достижения в разработке на основе ЬОУ- и БЬиЬ-
фотосенсоров оптогенетических систем для световой регуляции клеточных процессов и функций. На этих актуальных вопросах функционирования ЬОУ- и БЬиБ-фоторецепторов сосредоточено внимание в настоящей обзорной статье.
Регуляторные функции БЬиГ-и ЬОУ-фоторецепторов
БЬШ-фотосенсорные белки. Многие бактериальные фоторецепторы этого класса состоят только из БЬиБ-домена с двумя С-концевыми а-спира-лями; реже они содержат связанные с ВЦОР-доме-ном эффекторные домены (см. ниже), активность которых может регулироваться фотовозбужденным ВЬИБ-доменом [3]. Короткие ВЬИБ-фотосенсоры передают сигналы и опосредуют физиологические ответы за счет формирования комплексов с сигнальными белками, т.е. путем светозависимого белок-белкового взаимодействия [4].
Как отмечено выше, в ВЬИБ-доменах фотоцикл ФАД включает сопряженный с протоном перенос
электрона от тирозинового остатка на фотовозбужденный флавин с переходом его в нейтральный радикал. Это инициирует реориентацию водородных связей вблизи флавинового хромофора, вследствие чего образуется обратимый в темноте интер-медиат (ФАДгей) со сдвинутым на 10—15 нм в красную область спектром поглощения. Водородная связь, ответственная за образование интерме-диата, формируется консервативным глутаминовым остатком, который таутомеризуется при световом возбуждении ВЬИБ-домена [5] (рисунок). Локальные изменения в ориентации водородных связей вызывают конформационные изменения в флавин-связывающем кармане, которые, распространяясь через в5-лист и С-концевые а-спирали ВЬИБ-до-мена, оказывают модулирующее влияние на активность эффекторных доменов [6].
Согласно недавно полученным данным, фотовозбужденный ВЦУР-домен регулирует каталитическую активность ферментных эффекторных доменов, участвующих в синтезе и распаде вторич-
Рисунок. Индуцированное светом (Ьу) формирование в ЬОУ-домене обратимого в темноте (Т) ФМН-цистеинильного аддукта, выявляемого по сдвигу максимума поглощения от 447 нм (ЬОУ447) к 390 нм (ЬОУ390) (а); индуцированная светом (Ъу) реорганизация сети водородных связей между ФАД и тирозиновым/глутаминовым остатками вызывает образование в БШТ-домене
обратимого в темноте (Т) интермедиата ФАДгед (б)
ных мессенджеров. У фотосенсорного белка из бактерий Klebsiella pneumonia, BlrPi (blue-light regulated phosphodiesterase) (табл. 1), BLUF- домен модулирует ц-ди-ГМФ-фосфодиэстеразную активность ковалентно присоединенного к нему EAL-домена [7]. Кристаллографический анализ BlrP1 свидетельствует о димерном устройстве EAL-доменов с консервативным контактом, создаваемым составной спиралью, формируемой из коротких спиралей каждого протомера. Фотосенсорные BLUF-домены расположены близко к участку димеризации, и при поглощении света BLUF-доменом одной субъединицы антипараллельного гомодимера стимулируется фосфодиэстеразная активность EAL-домена другой субъединицы [7]. Регуляция активности EAL-домена BLUF-сенсором осуществляется посредством двусторонней аллостерической связи между фотоиндуцированными структурными изменениями и активным центром EAL [8]. Световые сигналы от обоих BLUF-доменов объединяются в консервативном участке димеризации EAL и передаются к активному центру ферментного домена, вызывая его активацию.
У выявленного у бактерий Beggiatoa sp. фотосенсорного белка, содержащего BLUF-домен, связанный с аденилилциклазой, bPAC (photoacti-vated adenylyl cyclase) [9] (или BlaC [10]), обнаружено светоиндуцированное повышение активности этого фермента и уровня клеточного цАМФ (табл. 1). Представляют интерес данные о превращении BlaC в гуанилатциклазу путем сконструированной модели нуклеотидилциклазного домена, в котором заменено несколько а. о. Тройной мутант, BlgC, обладает фотоактивированной гуани-латциклазой in vitro. Синий свет вызывает у мутанта Escherichia coli, экспрессирующего BlaC, значительное повышение уровня цГМФ [10].
В последнее время появились сведения о фотофизиологических функциях BLUF-фоторецепто-ров, которые контролируют такие биологические ответы, как фототаксис (Pix D у Synechocystis sp.), формирование биопленок (YcgF у E. coli, PapB у Rhodopseudomonas palustris), вирулентность (BlsA у Acinetobacter baumannii) и синтез компонентов аппарата фотосинтеза (AppA у R sphaeroides) [6]. Действие отмеченных фоторецепторов основано на светозависимых белок-белковых взаимодействиях. В недавних исследованиях получена новая информация о молекулярных деталях этих свето-регулируемых процессов.
Участвующий в контроле фототаксиса у Synechocystis sp. короткий BLUF-фотосенсор PixD (табл. 1) взаимодействует в темноте с регулятор-ным белком PixE, который индуцирует формирование олигомерного комплекса, состоящего из 10 субъединиц PixD и 5 субъединиц PixE [11]. При световом возбуждении PixD происходят конфор-мационные изменения, сопровождаемые распадом комплекса на димеры PixD и мономеры PixE [4]. Предполагается, что именно этот светоиндуциро-
ванный процесс запускает сигнальный каскад, контролирующий фототаксис бактерий [11].
У другого короткого BLUF-белка — PapB из R. palustris, фотофизиологическая функция связана с отрицательной регуляцией формирования биопленки. В основе фотоответа лежит взаимодействие PapB с ц-ди-ГМФ-специфичной фосфодиэ-стеразой PapA, активность которой повышается при световом возбуждении фотосенсора. PapB, в отличие от рассмотренного выше PixD, образующего комплекс с белком PixE только в темноте [11], взаимодействует с PapA и на свету. Это свидетельствует о различиях в механизмах взаимодействия двух фотосенсоров с соответствующими белками в сигнальных каскадах, контролирующих разные фотобиологические процессы — фототаксис или формирование биопленки [6, 12].
BLUF-белок E. coli YcgF (табл. 1) содержит EAL-домен, однако, в отличие от сходного с ним по доменной организации фоторецептора BlrP1 (см. выше), YcgF не связывается с ц-ди-ГМФ и его EAL-домен не обладает светоиндуцированной фос-фодиэстеразной активностью. Установлено, что YcgF функционирует как антагонист транскрипционного регулятора YcgE [13]. Действие YcgE в качестве репрессора осуществляется путем его связывания с промоторами в опероне, кодирующем белки, которые могут активировать вещества матрикса биопленки. Фотовозбужденный YcgF временно формирует гомодимеры, вызывая диссоциацию комплекса YcgE — YcgF и высвобождая репрессор из оперона. Это указывает на фотосенсорную функцию YcgF при модуляции формирования биопленки клетками E. coli [13].
Результаты этого исследования показывают, что у BLUF-белка с вырожденным EAL-доменом синий свет может активировать биологическую функцию, отличную от ферментативной, за счет светозависимого белок-белкового взаимодействия.
Фоторецептор бактерий R. sphaeroides AppA (табл. 1) — свето- и редокс-регулятор экспрессии фотосинтетических генов, состоит из BLUF-до-мена и редокс-сенсорного домена SCHIC (Sensor Containing Heme Instead of Cobalamin) [6]. Свет и кислород воспринимаются посредством AppA — PpsR-регуляторной системы, где PpsR — репрессор фотосинтетических генов, содержащий (HTH)-мотив (helix — turn — helix — motiv) для связывания с ДНК, а AppA — антирепрессор, способный через SCHIC-домен образовывать нековалентный AppA — PpsR2-комплекс.
В недавней работе на основе анализа кристаллических структур обоих белков и их комплекса показано, что световая активация AppA изменяет эффекторную область PpsR внутри комплекса. Кроме того, продемонстрировано формирование светочувствительного тройного комплекса AppA — PpsR — DNA, через который может передаваться сигнал посредством аллостерических структурных изменений. Согласно предложенному механизму,
фотомодифицированный комплекс AppA — PpsR2 взаимодействует с сайтами связывания PpsR на ДНК, предотвращая формирование PpsR—DNA-репрессорного комплекса, что приводит к активации экспрессии фотосинтетических генов [14].
LOV-фотосенсорные белки. Фотосенсорная функция LOV-домена была впервые выявлена при идентификации фототропина, содержащего два ФМН-связывающих LOV-домена, из которых основным в регуляции активности фоторецептора является LOV2, соединенный Ja-спиралью с эф-фекторным серин-треонин-киназным доменом. Фотоцикл ФМН с максимумом поглощения при 447 нм (LOV447) включает обратимое в темноте образование ФМН-цистеинильного аддукта (LOV390) (рисунок). Эта форма является сигнальным состоянием фоторецептора, которое связано с индуцированной формированием аддукта деструктуризацей Ja-спирали и последующим повышением киназ-ной активности [1, 2].
Важно отметить, что аналогичный принцип световой активации LOV-белков (за исключением некоторых деталей структурных механизмов трансдукции сигнала) сохранен среди отдаленных филогенетических групп организмов, включая грибы и бактерии [1, 2, 15, 16]. Все LOV-фото-рецепторы грибов и бактерий содержат один LOV-домен, причем у многих прокариот он тесно связан с различными эффекторными доменами, образуя модульные системы, активность которых может регулироваться светом.
У грибов базовыми представителями LOV-фо-торецепторной системы являются два ФАД-содер-жащих LOV-доменных белка: WC-1 (White Collar) и VVD, опосредующие световую регуляцию запуска и фазы циркадного ритма у Neurospora crassa [17]. Фотосенсорный белок WC-1 представляет собой транскрипционный фактор, формирующий с другим транскрипционным фактором WC-2 гетеро-димерный комплекс WCC. Фотоактивация WC-1 в этом комплексе вызывает гомодимеризацию WCC [18]. Активированный светом WC-комплекс индуцирует транскрипцию многих светоиндуцибель-ных генов, включая ген, кодирующий фотосенсор VVD, необходимый для правильной регуляции циркадных ритмов [17, 19]. Индуцированные формированием фотоаддукта конформационные изменения в LOV/ VVD сопровождаются гомодиме-ризацией VVD и его взаимодействием с WCC [20], что определяет образование отрицательной обратной связи с WCC при контроле суточной экспрессии генов.
Современная модель антагонистического действия VVD по отношению к WC-комплексу основана на прямом взаимодействии и конкурентной гетеродимеризации между VVD — VVD/LOV и WC-1/LOV [18, 19]. Образование гетеродимера VVD:WC-1 обеспечивает адаптацию организма к свету, поскольку блокирует первоначально ини-
циированную волну генной экспрессии в условиях продолжающегося освещения, препятствуя тем самым сверхэкспрессии WCC-транскрибируемых генов [18, 19, 21].
У бактериальных LOV-фоторецепторов, содержащих связанные с фотосенсорным доменом различные эффекторные домены, в последние годы выявлена регулируемая светом активность, а для некоторых из них обнаружены фотобиологические функции [2, 15]. LOV-гистидин (Н)-киназы, содержащиеся у бактерий Caulobacter crescentus (LovK), Brucella abortus (LOV-HK) (табл. 2) и Pseudomonas syringae, проявляют типичные для LOV-доме-нов фотоциклы флавинового хромофора, которые сопровождаются изменением третичной структуры и аутофосфорилированием киназ in vitro, а также переносом фосфатной группы на соответствующие белки — регуляторы ответов (RRs) (табл. 2). Таким образом, у LOV-киназ RRs составляют двухкомпонентную систему трансдукции светового сигнала [3]. Фотоактивация LovK и LOV-HK вызывает физиологические ответы у бактерий: у B. abortus наблюдается 10-кратное повышение уровня пролиферации клеток в макрофагах, а у C. crescentus — резкое увеличение адгезии клеток [15].
У цианобактерий Synechococcus elongatus LOV-домен, связанный с GGDEF-EAL-доменами, опосредует фотоиндуцированную регуляцию фос-фодиэстеразной активности EAL in vitro [22] (табл. 2). На основании этого факта предполагается, что активированный синим светом LOV-домен может контролировать уровень клеточного ц-ди-ГМФ, который участвует как вторичный мессенджер в регуляции ряда физиологических функций (подвижность, вирулентность и др.).
У бактерий Bacillus subtilis LOV-STAS (Sulfate transporter/antisigma-factor antagonist)-белок YtvA (табл. 2) функционирует как фоторецептор in vitro и in vivo. STAS-домен определяет модулируемое синим светом свойство YtvA связывать in vitro ГТФ, который является вторичным мессенджером в ответах на стресс B. subtilis. Кроме того, фотоактивированный YtvA in vivo действует как положительный регулятор транскрипционного фактора общего стресса oB [23]. Поскольку мутации, нарушающие связывание ГТФ в STAS-домене или междоменное распространение светоиндуцированного сигнала в фоторецепторе, подавляют активированную синим светом oB-зависимую транскрипцию in vivo, считается, что связывание ГТФ необходимо для проявления функциональной активности YtvA [23—25].
Исследования структурных изменений, происходящих в LOV-домене YtvA, который соединен с эффекторным STAS-доменом Ja-спиралью, показали, что, в отличие от таковых у фототропинов, они не затрагивают деструктуризацию Ja-спирали [24, 26]. Это связано с различиями в четвертичной структуре и ориентации Ja, которая у YtvA-LOV-домена образует "coiled-coil''-конфигурацию [23]. Изолированные YtvA-LOV-домены представляют
Таблица 1
Первичные фотоиндуцированные процессы и регуляторные функции у отдельных BLUF-фоторецепторов бактерий
Тип фоторецептора Первичные фотоиндуци-рован-ные процессы в ВМ И -фотосенсорах Структурные основы трансдукции сигнала Регуляция клеточных процессов и функций
PixD (BLUF) Сопряжённый с протоном перенос электрона от Тир-остатка на фотовозбуждённый флавпн с переходом его в нейтральный радикал; реориентация водородных связей вблизи хромофора и образование интермеди-ата ФАДгес1; конформационные изменения в С-концевых а-спи-ралях ВЦир-домена [1, 2, 6] Изменение конформации РгхВ и распад олигомерного комплекса РгхВ с регуляторным белком РгхЕ [11] Контроль фототаксиса Synechocystis sp. [11]
BlrPl (BLUF - EAL) Аллостерическая двусторонняя связь между изменениями структуры ВЕир-домена и активным центром ЕАЕ в димерном В1гР1 [8] Стимуляция фосфодиэстеразной активности EAL-домена у К. pneumonia [7]
YcgF (BLUF - EAL) Диссоциация комплекса димера YcgF с транскрипционным репрес-сором YcgE, сопровождаемая его высвобождением из оперона [13] Формирование биоплёнки клетками Е. coli [13]
AppA (BLUF - SCHIC) Аллостерические структурные изменения в комплексе АррА — РрвИ. — ДНК. Взаимодействие комплекса АррА — РрвЯ с сайтами связывания репрессора РрвИ. на ДНК предотвращает формирование РрвИ. — ДНК-репрессорного комплекса [14] Активация экспрессии фотосинтетических генов. Синтез компонентов аппарата фотосинтеза у R. sphaeroides [6, 14]
bPAC (BLUF - AC) Не исследованы Повышение активности аденилилциклазы (АС) и уровня сАМР у Beggiatoa sp. [9]
Таблица 2
Первичные фотоиндуцированные процессы и регуляторные функции у некоторых выбранных ЬОУ-фоторецепторов бактерий
Тип фоторецептора Первичные фотоиндуциро-ванные процессы в ЬОУ-доменах Структурные основы трансдукции сигнала Регуляция клеточных процессов и функций
LovK (LOV — Н-киназа) Фотовозбуждённый ФМН подвергается фотоциклу, который включает образование тиолового аддукта между изоаллоксази-новым кольцом хромофора и Цис-остат-ком белка; конформационные изменения в ПЗУ-домене, инициируемые реориента-цией глутаминового остатка и изменением водородных связей с участием периферических а.о. — специфических трансмиттеров сигнала [1,2, 15] Изменения третичной структуры Н-киназного домена [2, 15] Фосфорилирование Н-киназы и трансфосфорилиро-вание белка — регулятора ответа (RR). Увеличение степени адгезии клеток С. crescentus [3, 15]
LOV - НК (LOV - Н-киназа) Изменения третичной структуры Н-киназного домена [2, 15] Фосфорилирование Н-киназы и трансфосфорилиро-вание белка — регулятора ответа (RR). Повышение уровня пролиферации клеток В. abortus [3, 15]
YtrA(LOV-STAS) Конформационные изменения в ИЭУ-димере вызывают поворот двух мономеров на 4—5° относительно друг друга [26]. Влияние этих структурных изменений на конформацию вТАв-домена не исследовано Связывание ГТФ STAS-доменом. Положительная регуляция транскрипционного фактора общего стресса аВ у В. subtilis [23]
LOV - GGDEF-EAL Не исследованы Регуляция фосфодиэстеразной активности EAL у LOV-фоторецептора из S. elongates in vitro [22]
собой конститутивные димеры, мономеры которых при фотоактивации поворачиваются относительно друг друга на 4—5° [26]. В распространении светоиндуцированных структурных перестроек в УуЛ-ЬОУ, как и в ЬОУ-доменах фототропина и УУО, первостепенную роль играет глутаминовый остаток, подвергающийся реориентации в своей боковой цепи.
Анализ данных, полученных при изучении структурных аспектов передачи сигнала в ЬОУ-фо-торецепторах, показывает, что у бактериальных, как и эукариотных, ЬОУ-белков трансдукция светового сигнала на начальных стадиях происходит по общему механизму. В его основе лежат вызываемые формированием фотоаддукта конформаци-онные изменения Р-листа ЬОУ-ядра. В их инициации важное значение имеет консервативный остаток глутамина, непосредственно взаимодействующий с фотоактивированным флавиновым хромофором. Перестройка глутамина индуцирует изменение водородных связей с участием нескольких периферических а.о., которые отличаются у разных ЬОУ-белков и действуют как специфические трансмиттеры сигнала (табл. 2). Также различаются структурные механизмы последующих этапов передачи сигнала, обеспечивающие способность ЬОУ-доменов регулировать активность эффекторных доменов [15].
Применение ЬОУ- и БЬиЕ-фотосенсоров в онтогенетических системах
Оптогенетика — новая область биологии клетки, объединяющая оптические и генетические подходы для регуляции клеточных процессов светом с использованием фотосенсорных белков. В последние годы оптогенетика становится одной из ключевых биотехнологий, поскольку генетически закодированные фотосенсорные активаторы могут быть функционально введены в клетки любого типа, где после световой активации, происходящей с высокой пространственно-временной точностью, они способны индуцировать регуляцию экспрессии генов, ферментативной активности и других биологических функций [27].
ЬОУ- и ВЬиЬ-фотосенсоры обладают ключевыми свойствами, идеально подходящими для применения в оптогенетике. Они имеют малый размер и используют в качестве хромофоров фотохимически активные флавиновые кофакторы, присутствующие во всех типах клеток. Кроме того, способность ЬОУ-и ВЬиЬ-фотосенсоров образовывать функциональные модульные структуры с эффекторными доменами служит основой для конструирования их комбинаций с другими белками/ферментами, активность которых подлежит светоиндуцирован-ному аллостерическому контролю [28 — 31].
В ряде исследований для аллостерического контроля функций белков использован ЬОУ2-до-мен растительного фототропина, который подвер-
гается большим структурным изменениям при фотовозбуждении. LOV2-Ja присоединяется к белку — мишени таким образом, что конформацион-ные изменения в LOV2 индуцируют конформаци-онные изменения в белке. По такому механизму LOV2-Ja вызывает светозависимую регуляцию активности ряда ферментов, в том числе при экспрессии в животные клетки [32 — 34].
Особый интерес представляют данные о регуляции светом ГТФазы Racl в фибробластах, экс-прессирующих гибридный LOV2-Ja— Racl-белок [33]. Показано, что в темноте LOV2 стерически инги-бирует активность Rac1, блокируя его связывание с эффекторными белками. Действие сфокусированного лазерного света вызывает деструктуризацию Ja-спирали, снимая стерическое ингибирование и обеспечивая тем самым взаимодействие Rac1 с эф-фекторными молекулами. Поскольку Racl является ключевым белком, регулирующим динамику ци-тоскелета, полученные результаты демонстрируют, что световое воздействие может быть использовано для дистанционного контроля подвижности клеток, экспрессирующих фотоактивируемый Racl [33].
Фоторегуляторное действие LOV2-Ja показано также в отношении ДНК-связывающей активности гибридного белка, включающего бактериальный репрессор триптофана TrpR [35]. В основе светоиндуцированного связывания лежит отсоединение Ja-спирали от LOV-ядра, сопровождаемое конформационным изменением и активацией эф-фекторного домена (TrpR).
Отметим, что помимо использования фото-тропинового LOV2 в качестве светозависимого регулятора биологических процессов, на основе этого домена созданы флуоресцентные репортерные молекулы [2, 27, 30]. Они успешно применяются для контроля популяций бактерий в анаэробных условиях либо вирусных инфекций растений. В этих случаях LOV-доменный репортер с достаточно интенсивной зелёной флуоресценцией флавинового хромофора превосходит GFP (green fluorescent protein), у которого для образования флуоресцирующего хромофора требуется присутствие кислорода. Хотя флуоресценция флавинового хромофора исчезает при фотохимическом образовании ци-стеинильного аддукта, этот процесс может быть предотвращен путём замены цистеинового остатка на аланин или серин, что обеспечивает постоянно флуоресцирующую молекулу.
Наряду с LOV2-Ja для оптогенетических применений исследуются также бактериальные LOV-фотосенсоры. На основе свойства бактериальных LOV-доменных фоторецепторов включать в состав в качестве эффекторного домена H-киназу сконструирована синтетическая регулируемая светом H-киназа, у которой нефоточувствительный PAS-домен от сенсора кислорода FixL из бактерий Bradyrhizobium japonicum заменен на LOV-домен фоторецептора YtvA из B. subtilis [36]. Дальнейшее применение этого гибридного белка связано с ин-
женерией плазмид для светорегулируемой индукции (pDawn) или репрессии (pDusk) бактериальных генов [37].
Недавно с помощью генной инженерии созданы и другие контролируемые светом транскрипционные системы. Весьма перспективной представляется конструкция, состоящая из LOV-фотосенсорного белка VVD из N. crassa, ДНК-связывающего и ак-тивационного доменов, которая используется для контроля экспрессии генов в животных клетках [38]. Также значительный интерес вызывает изучение LOV-доменов, идентифицированных недавно в геномах бактерий, выделенных из разных мест обитания, в том числе экстремальных [39]. Соединение этих фотосенсорных модулей с различными эффекторными доменами может предоставить обширный выбор конструкций для оптогенетических систем.
Исследование BLUF-фотосенсоров для применения в оптогенетике инициировали работы с использованием PAC из Euglena gracilis — фоторецептора, содержащего цАМФ-циклазу. Экспрессиро-ванный в нейроны животных, BLUF-фоторецептор вызывает светозависимую активацию циклазы,
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Fraikin G.Ya., Strakhovskaya M.G., Rubin A.B. Biological photoreceptors of light-dependent regulatory processes // Biochemistry (Mosc.). 2013. Vol. 78. N 11. P. 1238-1253.
2. Losi A., Gartner W. Old chromophores, new photo-activation paradigms, trendy applications: flavins in blue light-sensing photoreceptors // Photochem. Photobiol. 2011. Vol. 87. N 3. P. 491-510.
3. Losi A., Gartner W. Bacterial bilin- and flavin-binding photoreceptors // Photochem. Photobiol. Sci. 2008. Vol. 7. N 10. P. 1168-1178.
4. Yuan H., Dragnea V., Wu Q., Gardner K.H., Bauer C.E. Mutational and structure studies of the PixD BLUF output signal that affects light-regulated interaction with PixE // Biochemistry. 2011. Vol. 50. N 29. P. 6365-6375.
5.Khrenova M.G., Nemukhin A.V., Domratcheva T. Pho-toinduced electron transfer facilitates tautomerization of the conserved signaling glutamine side chain in BLUF protein light sensors // J. Phys. Chem. B. 2013. Vol. 117. N 8. P 2369-2377.
6. Masuda S. Light detection and signal transduction in the BLUF photoreceptors //Plant Cell Physiol. 2013. Vol. 54. N 2. P. 171-179.
7. Barends T.R.M., Hartmann E., Griese J.J., Beitlich T., Kirienko N.V., Ryjenkov D.A., Reinstein J., Shoeman R.L., Gomelsky M., Schlichting I. Structure and mechanism of a bacterial light-regulated cyclic nucleotide phosphodiesterase // Nature. 2009. Vol. 459. N 7249. P. 1015-1018.
8. Winkler A., Udvarhelyi A., Hartmann E., Reinstein J., Menzel A., Shoeman R.L., Schlichting I. Characterization of elements involved in allosteric light regulation of phospho-diesterase activity by comparison of different functional BlrP1 states // J. Mol. Biol. 2014. Vol. 426. N 4. P. 853-868.
9. Stierl M., Stumpf P., Udvari D., Gueta R., Hagedorn R., Losi A., Gartner W., Petereit L., Efetova M., Schwarzel M., Oertner T.G., Nagel G., Hegemann P. Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa // J. Biol. Chem. 2011. Vol. 286. N 2. P. 1181-1188.
сопровождаемую быстрым повышением уровня цАМФ, который посредством каскада фосфорили-рования регулирует генную экспрессию и ряд биологических процессов [40].
Рассмотренная выше BLUF-аденилилциклаза (bPAC/BlaC) бактерий Beggiatoa sp. перспективна для последующего применения в оптогенетике. Действительно, светоактивированная bPAC проявляет высокую эффективность в цАМФ-регули-руемых процессах, включая поведенческие реакции, при интеграции c нейронами некоторых животных
[9]. Кроме того, BlaC посредством мутации может быть конвертирована в фотоактивируемую цГМФ-циклазу (BlgC), расширяя область ее применения
[10]. Как известно, продукты аденилил- и гуани-лилциклаз, цАМФ и цГМФ, являются универсальными вторичными мессенджерами, которые регулируют многие процессы у организмов. Поэтому свойство бактериальных PAC контролировать под действием света синтез цАМФ/цГТФ в сочетании с их малым размером и высокой степенью световой активации открывает перспективы для применения этих BLUF-циклазных фоторецепторов в оптогенетике.
10. Ryu M.-H, Moskvin O.V., Siltberg-Liberies J., Gomelsky M. Natural and engineered photoactivated nucleotidyl cyclases for optogenetic applications // J. Biol. Chem. 2010. Vol. 285. N 53. P. 41501-41508.
11. Tanaka K., Nakasone Y., Okajima K., Ikeuchi M., Tokutomi S., Terazima M. Time-resolved tracking of interprotein signal transduction: Synechocystis PixD — PixE complex as a sensor of light intensity // J. Amer. Chem. Soc. 2012. Vol. 134. N 20. P. 8336-8339.
12. Ren S., Sawada M., Hasegawa K., Hayakawa Y., Ohta H., Masuda S.A. PixD — PapB chimeric protein reveals the function of the BLUF domain C-terminal a-helices for light-signal transduction // Plant Cell Physiol. 2012. Vol. 53. N 9. P. 1638-1647.
13. Tschowri N., Linderberg S., Hengge R. Molecular function and potencial evolution of the biofilm-modulating blue light-signaling pathway of Escherichia coli // Mol. Microbiol. 2012. Vol. 85. N 5. P. 893-906.
14. Winkler A., Heintz U., Lindner R., Reinstein J., Shoeman R.L., Schlichting I. A ternary AppA — PpsR — DNA complex mediates light-regulation of photosynthesis-related gene expression // Nat. Struct. Mol. Biol. 2013. Vol. 20. N 7. P. 859-867.
15. Herrou J., Crosson S. Function, structure, and mechanism in bacterial photosensory LOV proteins // Nat. Rev. Microbiol. 2011. Vol. 9. N 10. P. 713-723.
16. Losi A., Gartner W. The evolution of flavin-binding photoreceptors: an ancient chromophore serving trendy blue-light sensors // Ann. Rev. Plant Biol. 2012. Vol. 63. P. 49-72.
17. Chen C.-H., Loros J.J. Neurospora sees the light // Commun. Integrat. Biol. 2009. Vol. 2. N 5. P. 448-451.
18. Malzahn E., Ciprianidis S., Kaldi K., Schafmeier T., Brunner M. Photoadaptation in Neurospora by competitive interaction of activating and inhibitory LOV domains // Cell. 2010. Vol. 142. N 5. P. 762-772.
19. Chen C.H., DeMay B.S., Gladfelter A.S., Dunlap J.C., Loros J.J. Physical interaction between VIVID and white
collar complex regulates phoroadaptation in Neurospora // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107. N 38. P. 16715-1672.
20. Zoltowski B.D., Crane B.R. Light activation of the LOV protein VTVID generates a rapidly exchanging dimer // Biochemistry. 2008. Vol. 47. N 27. P. 7012-7019.
21. Hunt S., Thompson S., Elvin M., Heintzen C. VIVID interacts with the WHITE COLLAR complex and FREQUENCY-interacting RNA helicase to alter light and clock responses in Neurospora // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107. N 38. P. 16709-16714.
22. Cao Z., Livoti E., Losi A., Gartner W.A blue light-in-ducible phosphodiesterase activity in the cyanobacterium Synechococcus elongatus // Photochem. Photobiol. 2010. Vol. 86. N 5. P. 606-611.
23. Avila-Perez M., Vreede J., Tang Y., Bende O., Losi A., Gartner W., Hellingwerf K. In vivo mutational analysis of YtvA from Bacillus subtilis: mechanism of light activation of the general stress response // J. Biol. Chem. 2009. Vol. 284. N 37. P. 24958-24964.
24. Tang Y., Cao Z., Livoti E., Krauss U., Jaeger K.-E., Gartner W., Losi A. Tnterdomain signaling in the blue-light sensing and GTP-binding protein YtvA: a mutagenesis study uncovering the importance of specific protein sites // Photochem. Photobiol. Sci. 2010. Vol. 9. N 1. P. 47-56.
25. Nakasone Y., Hellingwerf K.J. On the binding of BODTPY — GTP by the photosensory protein YtvA from the common soil bacterium Bacillus subtilis // Photochem. Photobiol. 2011. Vol. 87. N 3. P. 542-547.
26. Jurk M., Dorn M., Kekhney A., Svergun D., Gartner W., Schmieder P. The switch that does not flip: the blue-light receptor YtvA from Bacillus subtilis adopts an elongated dimer conformation independent of the activation state as revealed by combined AUC and SAXS study // J. Mol. Biol. 2010. Vol. 403. N 1. P. 78-87.
27. Pathak G.P., Vrana J.D., Tucker C.L. Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors // Biol. Cell. 2013. Vol. 105. N 2. P. 59-72.
28. Moglich A., Moffat K. Engineered photoreceptors as novel optogenetic tools // Photochem. Photobiol. Sci. 2010. Vol. 9. N 10. P. 1286-1300.
29. Zoltowski B.D., Gardner K.H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmen-
tally modulated protein — protein interactions // Biochemistry. 2011. Vol. 50. N 1. P. 4-16.
30. Christie J.M., Gawthorne J., Young G., Fraser N.J., Roe A.J. LOV to BLUF: flavoproteins contributions to the optogenetic toolkit // Mol. Plant. 2012.Vol. 5. N 3. P. 533-544.
31. Krauss U., Drepper T., Jaeger K.E. Enlightened enzymes: strategies to create novel photoresponsive proteins // Chem. Eur. J. 2011.Vol. 17. N 9. P. 2552-2560.
32. Krauss U., Lee J., Benkovic S.J., Jaeger K.E. LOVely enzymes — towards engineering light-controable biocata-lysts // Microb. Biotech. 2010. Vol. 3. N 1. P. 15-23.
33. Wu Y.I., Frey D., Lungu O.I., JaehrigA., Schlichting I., Kuhlman B., Hahn K.M. A genetically encoded photoactivat-able Rac controls the motility of living cells // Nature. 2009. Vol. 461. N 7260. P. 104-108.
34. Wang X., He L, Wu Y.I, Hahn K.M., Montell D.J. Light-mediated activation reveals a key role for Rac in collective guidance of cell movement in vivo // Nat. Cell Biol. 2010. Vol. 12. N 6. P. 591-597.
35. Strickland D., Yao X., Gawlak G., Rosen M.K., Gardner K.H., Sosnick T.R. Rationally improving LOV domain-based photoswitches // Nat. Methods. 2010. Vol. 7. N 8. P. 623-626.
36. Moglich A., Ayers R.A., Moffat K. Design and signaling mechanism of light- regulated histidine kinases // J. Mol. Biol. 2009. Vol. 385. N 7. P. 1433-1444.
37. Ohlendorf R., Vidavski R.R., Eldar A., Moffat K., Moglich A. From Dusk till Dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression // J. Mol. Biol. 2012. Vol. 416. N 3. P. 534-542.
38. Wang X., Chen X., Yang Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system // Nat. Methods. 2012. Vol. 9. N 3. P. 266-269.
39. Pathak G.P., Losi A., Gartner WKMetagenome-based screening reveals worldwide distribution of LOV-domain proteins // Photochem. Photobiol. 2012. Vol. 88. N 1. P. 107-118.
40. Weissenberger S., Schultheis C., Liewald J.F., Erb-guth K., Nagal G, Gottschalk A. PACa — an optogenetic tool for in vivo manipulation of cellular cAMP levels, neurotransmitter release, and behavior in Caenorhabditis elegans // J. Neurochem. 2011. Vol. 116. N 6. P. 616-625.
Поступила в редакцию 06.07.2015 г.
LOV AND BLUF FLAVOPROTEINS: REGULATORY PHOTORECEPTORS
OF MICROORGANISMS AND PHOTOSENSORY ACTUATORS IN OPTOGENETIC SYSTEMS
G.Ya. Fraikin1, M.G. Strakhovskaya1>2 *, N.S. Belenikina1, A.B.Rubin1
1 Department of Biophysics, School of Biology, M.V. Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1—12, Moscow, 119234, Russia;
2 Federal Scientific and Clinical Center for Specialized Medical Service and Medical Technologies FMBA, Orehovii bulvar 28, Moscow, 115682, Russia; * e-mail: marstr@biophys.msu.ru
In recent years, it has been shown that LOV (light, oxygen, voltage) and BLUF (Blue Light sensing Using FAD) photosensory proteins are functioning as photoreceptors of light-regulated processes not only in eukaryotes but also in numerous prokaryotes. In bacterial photoreceptors, LOV and BLUF domains with attached flavin chromophores are often associated with different effector domains, which possess enzymatic and other functions, constituting modular light-switchable systems. Nowadays, progress has been achieved in uncovering the photoactivation mechanisms of such systems, which based on the chromophore photoreaction-induced changes
in the photosensory domain structures and subsequent signal transduction to the effector domains. Knowledge of signal transduction principles in LOV and BLUF photosensors is important for designing on their basis photo-switchable enzymes and transcriptional systems, which have been applied in optogenetics — a new field in cell biology and biotechnology. The structural aspects of signal transduction by light-activated LOV and BLUF photoreceptors and their regulatory functions in bacteria as well as on some recent advances in using LOV and BLUF photosensors as actuators in optogenetic systems for regulation of cellular processes are discussed.
Key words: LOV and BLUF photoreceptors, signal transduction, bacteria, regulation, optogenetic systems, review.
Сведения об авторах:
Фрайкин Григорий Яковлевич — докт. биол. наук, проф., вед. науч. сотр. кафедры биофизики биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-39-68; e-mail: gfraikin@yandex.ru
Страховская Марина Глебовна — докт. биол. наук, вед. науч. сотр. кафедры биофизики биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-39-68; e-mail: marstr@biophys.msu.ru Беленикина Наталья Серафимовна — канд. биол. наук, науч. сотр. кафедры биофизики биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-39-68; e-mail: nata.belenikina@ya.ru
Рубин Андрей Борисович — докт. биол. наук, чл.-корр. РАН, проф., зав. кафедрой биофизики биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-11-16; e-mail: rubin@biophys.msu.ru
