CC BY
105
2012
Известия ТИНРО
Том 168
УДК 597.553.2:575
А.А. Семенченко1, Д.М. Атопкин1’ 2*
1 Дальневосточный федеральный университет,
690950, г. Владивосток, ул. Октябрьская, 27;
2 Биолого-почвенный институт ДВО РАН,
690022, г. Владивосток, просп. 100-летия Владивостока, 159
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ВИДОВ ХАРИУСОВ THYMALLUS TUGARINAE И THYMALLUS GRUBII ПО ДАННЫМ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ГЕНА ЦИТОХРОМА b МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК
Получены нуклеотидные последовательности участка гена цитохрома b митохондриальной ДНК для двух видов хариусов Дальнего Востока России, Thymallus tugarinae и T. grubii (подвид T. grubii flavomaculatus). По этим данным и последовательностям, взятым из генного банка (NCBI GenBank), проведен филогенетический анализ четырех видов хариусов, чьи родственные отношения в настоящее время считаются малоизученными. Уровень генетической дивергенции дальневосточных хариусов T. tugarinae и T. g. flavomaculatus по отношению друг к другу соответствовал уровню дивергенции между европейским (T. thymallus) и сибирским (T. arcticus) хариусами. Кроме того, между последовательностями гена цитохрома b дальневосточных видов хариусов выявлены точечные нуклеотидные замены, приводящие к изменению аминокислотного состава белковых продуктов (несинонимичные мутации). Топология деревьев, построенных с помощью байесовского анализа (BA) и метода максимальной пар-симонии (MP), показала наличие четырех независимых филогенетических линий происхождения хариусов. Кроме того, статистически поддержаны филогенетические связи между T. tugarinae и T. g. flavomaculatus. Полученные данные свидетельствуют о видовом статусе дальневосточных хариусов T. tugarinae и T. g. flavomaculatus и подтверждают их принадлежность к разным филогенетическим линиям, выявленным ранее.
Ключевые слова: Thymallus, цитохром b, байесовский анализ, филогения, хариусы.
Semenchenko A.A., Atopkin D.M. Comparative analysis of the Far-Eastern graylings Thymallus tugarinae and Thymallus grubii by mitochondrial cytochrome b gene sequence data // Izv. TINRO. — 2012. — Vol. 168. — P. 59-69.
Partial sequences of the mitochondrial gene cytochrome b are obtained for two species of graylings from the Russian Far East: Thymallus tugarinae and T. grubii flavomaculatus. Phylogenetic analysis of four Thymallus species is performed by using these new data and several sequences taken in the GenBank (NCBI). Gene differences are represented by nucleotide substitutions both neutral and those that
* Семенченко Александр Анатольевич, аспирант, e-mail: semenchenko_ alexander@mail.ru; Атопкин Дмитрий Матвеевич, кандидат биологических наук, научный сотрудник, e-mail: atop82@gmail.com.
lead to the amino acid change. Rate of the genetic divergence between Thymallus tugarinae and T. grubii flavomaculatus corresponds with the divergence between the Siberian (T. arcticus) and European (T. thymallus) graylings. Topology of phylogenetic trees constructed by Bayesian approach and maximum parsimony shows the presence of four independent phylogenetic groups. T. tugarinae and T. grubii fla-vomaculatus are recognized as distinct species belonged to different phylogenetic lineages.
Key words: Thymallus, cytochrome b, Bayesian analysis, phylogeny, grayling.
Введение
Хариусы являются специфической группой рыб, обитающей в быстро текущих водах речных систем бореальной зоны. Зона их обитания в речном бассейне располагается от периферической части верховьев рек и ручьев до нижней части реки. Это типичная стенобионтная группа рыб, которая не способна обитать в слабопроточных и солоноватых водах и мигрировать морем в соседние речные бассейны. В последнее время изучение хариусов направлено на исследование их таксономии и реконструкции исторических путей миграции предковых форм.
В настоящее время существует множество работ, посвященных как морфологической изменчивости, так и систематике и филогении хариусов, основанных на генетических данных (Lynch, Vyse, 1979; Макоедов, 1982; Скурихина, 1984; Шубин, Захаров, 1984; Ломов, Скурихина, 1985; Скурихина и др., 1985, 1986; Hop, Gharrett, 1989; Bouvet et al., 1990; Шубин и др., 1999, 2000; Redenbach, Taylor, 1999; Susnik et al., 1999, 2001; Knizhin et al., 2000; Koskinen et al., 2000, 2002; Gross et al., 2001; Weiss et al., 2002, 2006, 2007; Книжин и др., 2004, 2008; Stamford, Taylor, 2004; Gum et al., 2005; Gum, 2006). В этих работах обсуждаются проблемы, касающиеся таксономии некоторых форм хариусов, их распространения и биогеографии. Одним из спорных вопросов систематики хариусов является таксономический статус дальневосточных форм, Thymallus tugarinae и T. grubii (включая оба подвида, верхнеамурский, T. g. grubii и желтопятнистый, T. g. flavomaculatus), обитающих в р. Амур, а также в некоторых реках, впадающих в Японское и Охотское моря. Ряд авторов считают амурских хариусов единым полифилетичным видом с множеством морфологических вариантов (Зиновьев, 2005). В одной из последних работ (Froufe et al., 2005), посвященной реконструкции филогенетических связей между всеми описанными видами хариусов, показаны отличия амурских видов рода Thymallus как друг от друга, так и относительно двух других линий происхождения хариусов (T. thymallus и остальных видов рода Thymallus). Однако выявленные различия между амурскими видами не поддержаны статистически, что не дает полных оснований считать их разными видами.
Для решения данной проблемы нами были реконструированы филогенетические связи двух представителей рода Thymallus: T. tugarinae и T. g. flavomaculatus. В качестве молекулярного маркера использованы нуклеотидные последовательности гена цитохрома b митохондриальной ДНК. Данный молекулярный маркер широко используется для оценки внутри- и межвидовой изменчивости позвоночных животных и реконструкции их филогении (Susnik et al., 2001; Doiron et al., 2002; Абрамсон, 2007; Челомина и др., 2007; Челомина, Атопкин, 2010).
Материалы и методы
В настоящей работе получены нуклеотидные последовательности гена цитохрома b мтДНК двух видов хариусов, обитающих на Дальнем Востоке России: Thymallus tugarinae (n = 13) и T. grubii flavomaculatus (n = 14). Также для анализа были использованы данные из международного генного банка (NCBI) для видов T. arcticus и T. thymallus (табл. 1).
Таблица 1
Географическое положение популяций хариусов и соответствующие им и внешней группе рыб номера в генном банке NCBI
Table 1
Geographic distribution of grayling populations included in the analysis. Numbers correspond to NCBI GenBank sequence records
Популяция, вид Бассейн Координаты n Идентификац. номер в генном банке NCBI
Р. Лангры Thymallus tugarinae Лангры ^ Татарский пролив ^ Тихий океан 52о78’ с.ш. 142о60’ в.д. 13 FR851931-FR851943
Р. Cамаpга Thymallus grubii flavomaculatus Cамаpга ^ Японское море ^ Тихий океан 47о78’ с.ш. 138о29’ в.д. 14 FR851944-FR851957
Рыбоводный завод Рауталампи Thymallus thymallus г. Турку ^ Балтийское море ^ Атлантический океан 60о47’ с.ш. 22о27’ в.д. 1 FJ853655
Юкон Thymallus arcticus г. Уайтхорс ^ Юкон ^ Берингово море ^ Тихий океан 60о71’ с.ш. 135о06’ в.д. 1 FJ872559
Thymallus arcticus Unpublished 1 GQ452036
Oncorhynchus masou 1 AF125210
Salvelinus alpinus 1 AF154851
Coregonus baunti 1 FJ589213
Coregonus chadary 1 FJ589214
Osmerus mordax dentex 1 HQ115272
Clupea harengus 1 EU552606
Engraulis encrasicolus 1 EU552563
Для молекулярно-генетического анализа использовали фрагменты сердца или туловищной мускулатуры рыб, собранных в реках Лангры (о. Сахалин) и Самарга (Приморский край) (табл. 1). Экстракцию ДНК проводили с помощью набора Genomic DNA Purification Kit фирмы Fermentas по прилагаемому протоколу. Ген цитохрома b был амплифицирован методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием прямого FishcytB-F (5’-ACC ACC GTT GTT ATT CAA CTA CAA GAA C-3’) и обратного THR-Fish2-R (5’-AAC CTC CGA CAT CCG GCT TAC AAG ACC G-3’) праймеров (Sevilla et al., 2007). Амплификацию проводили на приборе C1000, Bio-Rad в 25 мкл реакционной смеси, включающей 2,5 мкл 10-кратного буфера для Tag-полимеразы, 2,5 мкл 50 mM раствора MgCl2, 2,5 мкл 2,5 mM раствора праймера, 20-50 нг ДНК, 0,3 мкл Tag-полимеразы 5000 ед./мл и 10,5 мкл дистиллированной деионизированной воды. ПЦР-реакцию осуществляли в следующих условиях: первичная денатурация —
3 мин/94 0С, 35 циклов, включающих денатурацию — 30 с/94 0С, отжиг праймера — 30 с/57 0С, элонгацию — 1,5 мин/72 0С. Программа завершалась дополнительной элонгацией — 5 мин/68 0С с последующим охлаждением до 4 0С. Количество ДНК и продуктов ПЦР определяли методом электрофореза в 1,5 %-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием с последующей визуализацией в УФ-свете (312 нм).
Реакцию секвенирования проводили в 10 мкл смеси, содержащей 0,5 mM праймера, 10-100 нг ПЦР-продукта и 1,5 мкл BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit V.3.1. Реакцию осуществляли в соответствии с протоколом к BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit. Продукты сиквенсовой реакции считывали на генетическом анализаторе ABI 3130xl на базе научной лаборатории кафедры клеточной биологии и генетики ДВФУ.
Сборку и выравнивание последовательностей проводили посредством программного модуля CLUSTAL-W, интегрированного в пакет MEGA 4.0 (Kumar et
al., 2004). Выбор оптимальной модели для расчета генетических дистанций осуществляли с помощью программы Modeltest v. 3.7 (Posada, Crandall, 1998). В качестве оптимальной была выбрана модель GTR (Tavare, 1986). Реконструкцию филогенетических связей осуществляли с помощью пакета PAUP 4b10 (Swofford, 2003). Филогенетические связи реконструировали с помощью методов ближайшего соседа (Neighbor-Joining, NJ), максимальной парсимонии (Maximum Parsimony, MP), максимального правдоподобия (Maximum Likelihood, ML) и бай-есового моделирования (Bayesian Analysis, BA).
Результаты и их обсуждение
Амплифицированный участок гена цитохрома b мтДНК составил примерно 1100 пар нуклеотидов (пн). После сборки и выравнивания доступная длина исследуемого фрагмента гена составила 1017 пн. У Thymallus tugarinae количество вариабельных сайтов составило 7, а парсимоний-информативных — 4. Аналогичные показатели для вида Thymallus grubii flavomaculatus составили 9 и 5 сайтов. Количество вариабельных и парсимоний-информативных сайтов исследуемого участка гена цитохрома b в объединенной выборке хариусов, включающей оба вида, значительно увеличилось — соответственно 86 и 80.
Нуклеотидный состав исследуемого участка гена цитохрома b мтДНК у разных видов хариусов практически не различался, составляя в среднем 29,8 %, 28,9, 25,3 и 16,0 % соответственно для A, T, C и G-азотистых оснований. Нуклеотидный состав полученных последовательностей по первой, второй и третьей позиции кодонов в целом у различных видов хариусов был сходным. Частоты всех азотистых оснований в первой позиции кодона были примерно равными, вторая позиция характеризовалась повышенным содержанием тимина (40,9 %), в третьей позиции кодона преобладали цитозин и аденин (соответственно 35,5 и 33,6 %). Кроме того, в третьей позиции кодона отмечалось низкое содержание гуанина (6,8 %). Количество гуанина в этой позиции было наиболее изменчивым у разных видов рода Thymallus и изменялось в пределах 5,5-8,2 %. Такое соотношение содержания нуклеотидов типично как для хариусовых (Yasuike et al., 2010), так и для лососевых рыб (Doiron et al., 2002).
Также исследованные участки гена цитохрома b у разных видов хариусов различались по частоте использования кодонов. В ряде случаев наблюдались фиксированные различия в кодировании аминокислот. Например, триплеты CAG, GAG и UGG, кодирующие соответственно глютамин, глютаминовую кислоту и триптофан, были обнаружены у T. tugarinae, но отсутствовали у T. g. flavo-maculatus (табл. 2).
Генетическая дивергенция между последовательностями гена цитохрома b мтДНК T. tugarinae и T. g. flavomaculatus составила 7,7 %, что соответствовало межвидовым значениям дивергенции для данной группы рыб. При сравнении этих видов с европейским и сибирским видами хариусов уровень дивергенции снижался незначительно (d = 7,2-7,5 %) (табл. 3).
Филогенетические связи исследованных видов хариусов были реконструированы по данным последовательностей участка гена цитохрома b длиной 1017 пн, включая данные генного банка. В качестве внешней группы были использованы последовательности участка гена цитохрома b из генного банка разных видов рыб (см. табл. 1).
Известно, что последовательности гена цитохрома b мтДНК при попарном сравнении у большинства видов животных характеризуются насыщением третьей позиции кодона и заменами типа транзиций (замены однотипных оснований), что создает так называемый филогенетический шум и искажает реальную картину филогенетических связей (Michaux et al., 2002; Абрамсон, 2007). Поэтому мы провели анализ полученных последовательностей гена цитохрома b на
Таблица 2
Частоты кодонов (%) гена цитохром b в мтДНК двух видов хариусов
Table 2
Codon frequencies (%) of the gene cytochrome b from two species of graylings
Кодон Оба Thymallus Thymallus grubii Кодон Оба Thymallus Thymallus grubii
вида tugarinae flavomaculatus вида tugarinae flavomaculatus
UUU(F) 11,5 12,0 11,0 UAU(Y) 4,6 5,0 4,2
UUC(F) 17,6 17,0 18,1 UAC(Y) 9,4 9,0 9,8
UUA(L) 4,6 З,0 6,0 UAA(*) 0,0 0,0 0,0
UUG(L) 2,8 2,6 3,0 UAG(*) 0,0 0,0 0,0
CUU(L) 10,5 11,0 10,0 CAU(H) 1,0 1,0 1,0
CUC(L) 6,0 6,0 6,0 CAC(H) 10,0 10,0 10,0
CUA(L) 23,6 22,0 25,0 CAA(Q) 5,2 4,4 5,9
CUG(L) З,4 6,0 1,0 CAG(Q) 0,8 1,6 0,0
AUU(I) 12,6 11,0 14,0 AAU(N) 5,0 5,0 5,0
AUC(I) 13,9 14,9 13,0 AAC(N) 8,0 8,0 8,0
AUA(I) 7,0 8,1 6,0 AAA(K) 6,0 6,0 6,0
AUG(M) 2,0 1,0 3,0 AAG(K) 1,0 1,0 1,0
GUU(V) 6,4 6,0 6,9 GAU(D) 5,5 5,0 6,0
GUC(V) 5,0 5,0 5,0 GAC(D) 3,6 4,2 3,0
GUA(V) 10,0 10,0 10,0 GAA(E) 4,5 3,9 5,0
GUG(V) 2,0 3,0 1,0 GAG(E) 0,5 1,0 0,0
UCU(S) 6,4 7,0 5,9 UGU(C) 0,0 0,0 0,0
UCC(S) 5,0 5,0 5,0 UGC(C) 4,0 4,0 4,0
UCA(S) 5,5 6,0 5,0 UGA(*) 9,5 9,0 10,0
UCG(S) 1,2 0,4 2,0 UGG(W) 0,5 1,0 0,0
CCU(P) 5,4 З,8 9,0 CGU(R) 0,0 0,0 0,0
CCC(P) 5,6 6,2 5,0 CGC(R) 1,0 1,0 1,0
CCA(P) 6,3 7,0 5,6 CGA(R) 5,9 6,0 5,7
CCG(P) 0,7 1,0 0,4 CGG(R) 0,1 0,0 0,З
ACU(T) 2,6 2,0 3,1 AGU(S) 1,0 1,0 1,0
ACC(T) 10,0 11,0 9,0 AGC(S) 0,0 0,0 0,0
ACA(T) 8,9 7,7 10,0 AGA(R) 0,0 0,0 0,0
ACG(T) 0,6 1,З 0,0 AGG(R) 0,0 0,0 0,0
gcu(a) 6,4 8,0 4,9 GGU(G) 2,6 2,0 3,1
GCC(A) 16,5 16,0 17,0 GGC(G) 5,0 4,9 5,0
GCA(A) 6,0 5,0 7,0 GGA(G) 11,0 11,0 11,1
GCG(A) 1,0 1,0 1,0 GGG(G) 6,4 7,0 5,9
Таблица 3
Значения р-расстояний между разными видами хариусов, %
Table 3
The p-distances between certain species of graylings, %
Вид 1 2 3
1. Thymallus tugarinae - - -
2. Thymallus grubii flavomaculatus 7,7 - -
3. Thymallus thymallus 7,7 7,5 -
4. Thymallus arcticus 7,6 7,2 6,0
насыщение транзициями в третьей позиции кодона на разных таксономических уровнях. В результате обнаружено, что насыщение наступает при попарном сравнении таксонов высокого ранга (например, при сравнении разных семейств), на уровне дивергенции последовательностей 25 % (рис. 1). Поскольку величина дивергенции между исследованными нами видами меньше, для филогенетического анализа мы учитывали все типы замен по всем позициям кодонов.
Филогенетические реконструкции для четырех исследованных видов в целом имели сходную топологию деревьев при использовании разных методов и демонстрировали высокую степень различий между разными видами хариусов. На всех реконструкциях сформировалось четыре кластера, соответствующих четырем видам хариусов. На филогенетическом древе, реконструированном с
Кол-во транзиций 180
160
140
120
100
80
60
40
20
ф ♦
. - -г
¥*' *
\ \ ч
**
✓ ✓ . /
/
0 2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20 22,5 25 27,5 30 32,5 35 37,5
d, %
Рис. 1. Результаты анализа последовательностей гена цитохрома b мтДНК рыб на насыщение транзициями
Fig. 1. Effect of transition mutations on sequences of cytochrome b mitochondrial gene
помощью алгоритма максимального правдоподобия, сестринскими по отношению друг к другу оказались виды T. tugarinae и T. g. flavomaculatus с достаточной бутстреп-поддержкой (74 %). T. arcticus оказался наиболее близким к группе T. tugarinae / T. g. flavomaculatus, а T. thymallus формировал отдельную базальную ветвь. Аналогичная топология была получена с помощью байесового моделирования (рис. 2). Вероятностная поддержка группы T. tugarinae / T. g. flavomaculatus при этом была выше (86 %).
Методом максимальной парсимонии было получено одно древо длиной 1031 шаг, характеризующееся следующими значениями основных индексов: CI = 0,64, RI = 0,80, RC = 0,52 и HI = 0,41 (рис. 3). Топология полученного древа также выявила наличие четырех видовых кластеров. Однако, в отличие от топологии ML, в данном случае T. g. flavomaculatus не имел общего узла с T. tugarinae и формировал отдельную ветвь. Виды T. arcticus и T. thymallus также формировали две независимые ветви, причем базальным оказался T. arcticus. Сходная с MP топология была получена методом ближайшего связывания, однако, в отличие от MP, здесь виды T. arcticus и T. thymallus были сестринскими по отношению друг к другу и формировали базальную ветвь.
Полученные результаты свидетельствуют о значительной дивергенции хариусов T. tugarinae и T. g. flavomaculatus Дальнего Востока России, сопоставимой с межвидовым уровнем. Это выражается как в высоком уровне дивергенции, так и в наличии фиксированных аминокислотных замен при попарном сравнении последовательностей гена цитохрома b мтДНК разных видов друг с другом.
В работе Фруфе с соавторами (Froufe et al., 2005) на основании совместного анализа контролирующего региона и гена АТФ6 мтДНК показана взаимосвязь всех известных в настоящее время видов и подвидов хариусов. По данным этих авторов, существует четыре основные филетические линии хариусов, которые дивергировали приблизительно одновременно и впоследствии их эволюция протекала изолированно, в промежутке 1,6—4,8 млн лет назад. В частности, по этим
0.86
0.52
1.00
1.00
Thymallus grubii flavomaculatus 1 Thymallus grubii flavomaculatus 5 [• Thymallus grubii flavomaculatus 40 Thymallus grubii flavomaculatus 41 Thymallus grubii flavomaculatus 33 Thymallus grubii flavomaculatus 38 0 81^ Thymallus grubii flavomaculatus 7 Thymallus grubii flavomaculatus 32 Thymallus grubii flavomaculatus 2 Thymallus grubii flavomaculatus 39 Thymallus grubii flavomaculatus 31 Thymallus grubii flavomaculatus 6 Thymallus grubii flavomaculatus 4 Thymallus grubii flavomaculatus 3 Thymallus tugarinae 5 Thymallus tugarinae 30 Thymallus tugarinae 29 Thymallus tugarinae 26 ■ Thymallus tugarinae 1 Thymallus tugarinae 28 Thymallus tugarinae 7 Thymallus tugarinae 2 Thymallus tugarinae 8 Thymallus tugarinae 10 Thymallus tugarinae 9 Thymallus tugarinae 27 Thymallus tugarinae 6 1.00 GQ452036 Thymallus arcticus ^ FJ872559 Thymallus arcticus
1.00
1.00
0.98
1.00
FJ853655 Thymallus thymallus
1.0^~ FJ589213 Coregonus baunti
I--- FJ589214 Coregonus chadary
------------AF125210 Oncorhynchus masou
0.99
AF154851 Salvelinus alpinus EU552606 Clupea harengus EU552563 Engraulis encrasicolus — HQ115272 Osmerus mordax dentex
0.1
Рис. 2. Филогенетическое древо, реконструированное по данным секвенирования гена цитохрома b мтДНК с помощью байесового моделирования (BA)
Fig. 2. Bayesian tree restored from the data on cytochrome b mitochondrial gene sequences
данным дальневосточные виды Т. grubii и Т. tugarinae были сестринскими по отношению друг к другу, однако эта связь имела низкую бутстреп-поддержку (менее 50 %). Между тем известно, что достоверно установленными узлами считают те, для которых значение бутстрэп-анализа превышает 70, а лучше — 90 (Лукашов, 2009).
10С
99
99
5С
52
10С
50
100
10
к
67
---- Thymallus grubii flavomaculatus33
---- Thymallus grubii flavomaculatus38
Thymallus grubii flavomaculatus1 Thymallus grubii flavomaculatus41 Thymallus grubii flavomaculatus40 Thymallus grubii flavomaculatus39 Thymallus grubii flavomaculatus32 Thymallus grubii flavomaculatus31 Thymallus grubii flavomaculatus7 Thymallus grubii flavomaculatus6 Thymallus grubii flavomaculatus5 Thymallus grubii flavomaculatus4 Thymallus grubii flavomaculatus3 Thymallus grubii flavomaculatus2 Thymallus tugarinae 1 Thymallus tugarinae 30 Thymallus tugarinae 29 Thymallus tugarinae 28 Thymallus tugarinae 26 Thymallus tugarinae 7 Thymallus tugarinae 5 Thymallus tugarinae 2
— Thymallus tugarinae 8 Thymallus tugarinae 10 Thymallus tugarinae 9
100r
51
95
------ Thymallus tugarinae 27
Thymallus tugarinae 6
FJ853655 Thymallus thymallus
GQ452036 Thymallus arcticus FJ872559 Thymallus arcticus FJ589213 Coregonus baunti FJ589214 Coregonus chadary AF125210 Oncorhynchus masou AF154851 Salvelinus alpinus
----- EU552563 Engraulis encrasicolus
EU552606 Clupea harengus
— HQ115272 Osmerus mordax dentex
Рис. 3. Филогенетическое древо, реконструированное по данным секвенирования гена цитохрома b мтДНК с помощью метода максимальной парсимонии (MP)
Fig. 3. Maximum parsimony tree restored from the data on cytochrome b mitochondrial gene sequences
Филогенетические связи, реконструированные нами с помощью МР и ВА-методов, наиболее полно соответствовали данным, полученным ранее на основе совместного анализа последовательностей контрольной области ф-петли) и гена АТФ6 мтДНК фго^е е! а1., 2005). В нашей работе поддержка филогенетических связей дальневосточных видов хариусов составила 86 % при использовании бай-есового моделирования, что статистически подтверждает точку зрения Froufe с
соавторами (2005). Топология филогенетических реконструкций, полученная методами максимальной парсимонии и ближайшего связывания, предполагала независимую эволюционную историю T. g. flavomaculatus и T. tugarinae с бут-стрэп-поддержкой 99 % (рис. 3). Уровень генетической дивергенции кластеров, включающих T. g. flavomaculatus и T. tugarinae, по данным Фруфе с соавторами (2005) составлял 4,8 и 5,3 % (соответственно по данным секвенирования участков гена АТФ6 и D-петли), что превышало значения дивергенции между другими кластерами в 2-3 раза. По нашим данным, значение р-расстояний между T. g. flavomaculatus и T. tugarinae, также включенными в разные кластеры, незначительно превышало уровень дивергенции, выявленный при сравнении последовательностей этих двух видов с европейским и сибирским хариусами (см. табл. 3). Согласно мнению Е.А. Зиновьева (2005), основанному на морфологических данных других авторов, нет четких диагностических признаков, различающих амурские виды хариусов (T. g. flavomaculatus, T. g. grubii, T. tugarinae и T. burejensis), а вариации их морфотипа находятся на внутривидовом уровне. На основании собственных и литературных генетических данных считаем, что дивергенция между амурскими видами хариусов находится на уровне, сопоставимом с видами, различающимися по морфологическим признакам (например, T. thymallus и T. arcticus complex). Значение р-расстояния, равное 7,7 % (табл. 3), несомненно, указывает на их видовую самостоятельность.
Результаты филогенетического анализа по данным секвенирования гена цитохрома b мтДНК согласуются с данными Фруфе с соавторами (2005) о существовании четырех основных филогенетических линий хариусов. При этом дивергенция T. g. flavomaculatus и T. tugarinae, возможно, произошла несколько позже относительно представителей остальных филогенетических линий. Для решения данной проблемы необходимо применение молекулярных маркеров ядерной ДНК, что является предметом нашего дальнейшего исследования.
Работа выполнена при поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 20092013 гг., Государственный контракт П273 от 29 апреля 2010 г.
Список литературы
Абрамсон Н.И. Филогеография: итоги, проблемы, перспективы // Вестн. ВОГиС. — 2007. — Т. 11, № 2. — С. 307-331.
Зиновьев Е.А. Экотипы у хариусовых рыб (Thymallidae Salmoniformes) // Экология. — 2005. — № 5. — С. 385-389.
Книжин И.Б., Вайс С.Дж., Антонов А.Л., Фруфе Э. Морфологическое и генетическое разнообразие амурских хариусов (Thymallus, Thymallidae) // Вопр. ихтиол. — 2004. — Т. 44, вып. 1. — С. 59-76.
Книжин И.Б., Вайс С.Дж., Богданов Б.Э. и др. Хариусы (Thymallidae) водоемов Западной Монголии: морфологическое и генетическое разнообразие // Вопр. ихтиол. — 2008. — Т. 48, вып. 6. — С. 745-766.
Ломов А.А., Скурихина Л.А. Организация генома обыкновенного хариуса (Thymallus thymallus) // Науч. докл. высш. шк. Биол. науки. — 1985. — Т. 6. — С. 22-26.
Лукашов В.В. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ : монография. — М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. — 256 с.
Макоедов А.Н. Хромосомный полиморфизм восточносибирского хариуса и некоторые вопросы эволюции кариотипа в подсемействе хариусовых // Цитология и генетика. — 1982. — Вып. 5. — С. 53-56.
Скурихина Л.А. Генетическая дивергенция хариусов (род Thymallus Cuvier, 1829) Евразии в свете данных молекулярной гибридизации ДНК х ДНК : автореф. дис. ... канд. биол. наук. — М. : МГУ, 1984. — 23 с.
Скурихина Л.А., Медников Б.М., Тугарина П.Я. Генетическая дивергенция хариусов (Thymallus) Евразии и «сети видов» // Зоол. журн. — 1985. — Т. 64, вып. 2. — С. 245-251.
Скурихина Л.А., Тугарина П.Я., Медников Б.М. К положению в системе Thymallidae (Salmoniformes) в свете данных молекулярной гибридизации ДНКхДНК // Вопр. ихтиол. — 1986. — Т. 26, вып. 1. — С. 56-60.
Челомина Г.Н., Атопкин Д.М. Молекулярно-генетические свидетельства глубокого филогенетического разрыва между европейской и азиатской расами малой лесной мыши по данным изменчивости гена цитохрома b мтДНК // Молекулярная биология. — 2010. — Т. 44, № 5. — С. 792-803.
Челомина Г.Н., Атопкин Д.М., Богданов А.С. Филогенетические связи видов и внутривидовых форм лесных мышей рода Sylvaemus по данным частичного секвенирова-ния гена цитохрома b митохондриальной ДНК // Докл. РАН. — 2007. — Т. 416, № 2. — С. 282-285.
Шубин П.Н., Ефимцева Э.А., Челпанова Т.И., Шубин Ю.П. Аллозимная изменчивость лососевидных рыб европейского севера : монография. — Сыктывкар : Коми науч. центр УрО РАН, 2000. — 100 с.
Шубин П.Н., Захаров А.Б. Гибридизация европейского Thymallus thymallus (L.) и сибирского Thymallus arcticus (Pallas) хариусов (Thymallidae) в зоне вторичного контакта видов // Вопр. ихтиол. — 1984. — Т. 24, вып. 3. — С. 502-504.
Шубин П.Н., Захаров А.Б., Шубин Ю.П. Генетическая изменчивость суперок-сиддисмутазы в популяциях сибирского (Thymallus arcticus Pall.) и европейского (Thymallus thymallus L.) хариуса // Генетика. — 1999. — Т. 35, № 3. — С. 405-408.
Bouvet Y., Soewardi K., Patte E. Genetic divergence within natural population of grayling (Thymallus thymallus) from two French river systems // Arch. Hydrobiol. — 1990. — Bd 119, H. 1. — P. 89-101.
Doiron S., Blier P.U., Bernatchez L. A comparative mitogenomic analysis of the potential adaptive value of Arctic charr mtDNA introgression in brook charr populations (Salvelinus fontinalis Mitchill) // Mol. Biol. Evol. — 2002. — Vol. 19. — P. 1902-1909.
Froufe E., Knizhin I., Weiss S. Phylogenetic analysis of the genus Thymallus (grayling) based on mtDNA control region and ATPase 6 genes, with inferences on control region constrains and broad-scale Eurasian phylogeography // Mol. Phylog. Evol. — 2005. — Vol. 34. — P. 106-117.
Gross R., Kuhn R., Baars R. et al. Genetic differentiation of European grayling populations across the Main, Danube and Elbe drainages in Bavaria // J. Fish. Biol. —
2001. — Vol. 58. — P. 264-280.
Gum B. Genetic characterization of European grayling populations (Thymallus thymallus L.): Implications for conservation and management : Dissertation. — Tech. Univ. Munchen, 2006. — 175 p.
Gum B., Gross R., Kuehn R. Mitochondrial and nuclear DNA phylogeography of European grayling (Thymallus thymallus): evidence for secondary contact zones in central Europe // Mol. Ecol. — 2005. — V. 14. — P. 1707-1725.
Hop H., Gharrett A.J. Genetic relationships of Arctic grayling in the Koyukuk and Tanana Rivers, Alaska // Trans. Amer. Fish. Soc. — 1989. — Vol. 118. — P. 290-295.
Knizhin I.B., Weiss S.J., Kirilchik S.V. mtDNA sequence diversity across the genus Thymallus both within and surrounding the Lake Baikal basin // Biodiversity and Dynamics of Ecosystems in North Eurasia. — 2000. — Vol. 5. — P. 180-182.
Koskinen M.T., Knizhin I., Primmer C.R. et al. Mitochondrial and nuclear DNA phylogeography of Thymallus spp. (grayling) provides evidence of ice-age mediated environmental perturbations in the world’s oldest body of freshwater, Lake Baikal // Mol. Ecol. —
2002. — Vol. 11. — P. 2599-2611.
Koskinen M.T., Ranta E., Piironen J. et al. Genetic lineages and postglacial colonization of grayling (Thymallus thymallus, Salmonidae) in Europe, as revealed by mitochondrial DNA analyses // Mol. Ecol. — 2000. — Vol. 9. — P. 1609-1624.
Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA 3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment // Brief. in Bioinformatics. — 2004. — Vol. 5. № 2. — P. 150-163.
Lynch J.C., Vyse E.R. Genetic variability and divergence in grayling, Thymallus arcticus // Genetics. — 1979. — Vol. 92. — P. 263-278.
Michaux J.R., Chevret P., Filipucci M.-G., Macholan M. Phylogeny of the genus Apodemus with a special emphasis on the subgenus Sylvaemus using the nuclear IRBP gene and two mitochondrial markers: cytochrome b and 12S rRNA // Mol. Phylog. Evol. — 2002. — Vol. 23. — P. 123-136.
Posada D., Crandall K.A. Modeltest: testing the model of DNA substitution // Bioinformatic. — 1998. — Vol. 14, № 9. — P. 817-818.
Redenbach Z., Taylor E.B. Zoogeographical implications of variation in mitochondrial DNA of Arctic grayling (Thymallus arcticus) // Mol. Ecol. — 1999. — Vol. 8. — P. 23-25.
Sevilla R.G., Diez A., Noren M. et al. Primers and polymerase chain reaction conditions for DNA barcoding teleost fish based on the mitochondrial cytochrome b and nuclear rhodopsin genes // Molecular Ecology Notes. — 2007. — Vol. 7. — P. 730-734.
Stamford M.D., Taylor E.B. Phylogeographical lineages of Arctic grayling (Thymallus arcticus) in North America: divergence, origins and affinities with Eurasian Thymallus // Mol. Ecol. — 2004. — Vol. 13. — P. 1533-1549.
Susnik S., Snoj A., Dove P. Evolutionary distinctness of grayling (Thymallus thymallus) inhabiting the Adriatic river system, as based on mtDNA variation // Biol. J. Linn. Soc. — 2001. — Vol. 74. — P. 375-385.
Susnik S., Snoj A., Dove P. Microsatellites in grayling (Thymallus thymallus): Comparison of two geographically remote populations from the Danubian and Adriatic river basin in Slovenia // Mol. Ecol. — 1999. — Vol. 8. — P. 1753-1768.
Swofford D.L. PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods). Version 4. — Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts, 2003.
Tavare S. Some probabilistic and statistical problems on the analysis of DNA sequences // Lect. Math. Life Sci. — 1986. — Vol. 17. — P. 57-86.
Weiss S., Knizhin I., Kirillov A., Froufe E. Phenotypic and genetic differentiation of two major phylogeographic lineages of arctic grayling Thymallus arcticus in the Lena River, and surrounding Arctic drainages // Biol. J. Linn. Soc. — 2006. — Vol. 88. — P. 511-525.
Weiss S., Knizhin I., Romanov V., Kopun T. Secondary contact between two divergent lineages of grayling Thymallus in the lower Enisey basin and its taxonomic implications // J. Fish. Biol. — 2007. — Vol. 71, Supl. C. — P. 371-386.
Weiss S., Persat H., Eppe R. et al. Complex patterns of colonization and refugia revealed for European grayling Thymallus thymallus, based on complete sequencing of the mitochondrial DNA control region // Mol. Ecol. — 2002. — Vol. 11. — P. 1393-1407.
Yasuike M., Jantzen S., Cooper G.A. et al. Grayling (Thymallinae) phylogeny within salmonids: complete mitochondrial DNA sequences of Thymallus arcticus and Thymallus thymallus // J. Fish. Biol. — 2010. — Vol. 76. — P. 395-400.
Поступила в редакцию 2.11.11 г.
