CC BY
69
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ НАУКИ
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ HEDYSARUM ALPINUM L. И HEDYSARUM THEINUM KRASNOB. МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ Федорова Ю.С.1, Суслов Н.И.2, Кульпин П.В.3, Мелентьева Ю.В.4, Косенко К.К.5 Email: [email protected]
1Федорова Юлия Сергеевна - кандидат фармацевтических наук, доцент, кафедра фармацевтической и общей химии, Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Кемеровский государственный медицинский университет Министерство здравоохранения Российской Федерации, г. Кемерово; 2Суслов Николай Иннокентьевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией; 3Кульпин Павел Валерьевич - младший научный сотрудник, лаборатория фитофармакологии и специального питания, Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины
им. Е.Д. Гольдберга Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Томский национальный исследовательский медицинский центр Российская академия наук; Мелентьева Юлия Витальевна - преподаватель, Областное государственное бюджетное профессиональное образовательное учреждение Томский лесотехнический техникум, г. Томск;
5Косенко Ксения Константиновна - провизор, Общество с ограниченной ответственностью «Аптечный мир», г. Кемерово
Аннотация: в данной статье приведены результаты определения биологически активных веществ водно-этанольных извлечений из травы H. Alpinum L. и травы H. Theinum Krasnob. методом хроматографии в тонких слоях сорбента. Впервые предложена система для эффективного разделения веществ-гликозидов ксантоновой структуры, предшественников изомангиферина мангиферина и 2-C,7-Oди-ß-D-глюкопиранозил-1,3,6,7-тетрагидроксиксантона и 4-C,
7-O-ди-ß-D-глюкопиранозил-1,3,6,7- тетрагидроксиксантона. По предварительным оценкам, трава H. Theinum Krasnob. не уступает H. Alpinum L. и H. Flavescens RGL. & Sohmalh. по содержанию мангиферина.
Ключевые слова: Hedysarum alpinum L., Hedysarum theinum Krasnob., тонкослойная хроматография, биологически активные вещества, мангиферин, изомангиферин, гликозиды ксантоновой структуры.
COMPARATIVE ANALYSIS OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES HEDYSARUM ALPINUM L. AND HEDYSARUM THEINUM KRASNOB. METHOD OF THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY Fedorova Yu.S.1, Suslov N.I.2, Kulpin P.V.3, Melentyeva Yu.V.4,
Kosenko K.K.5
1Fedorova Yulia Sergeevna - Candidate of Pharmaceutical Sciences, Associate Professor,
DEPARTMENT OF PHARMACEUTICAL AND GENERAL CHEMISTRY,
FEDERAL STATE EDUCATIONAL INSTITUTION OF HIGHER PROFESSIONAL EDUCATION KEMEROVO STATE MEDICAL UNIVERSITY MINISTRY OF HEALTH OF THE RUSSIAN FEDERATION, KEMEROVO;
2Suslov Nikolay Innokentievich - Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Laboratory; 3Kulpin Pavel Valerievich - Junior Researcher, LABORATORY OFPHYTOPHARMACOLOGY AND SPECIAL NUTRITION, GOLDBERG RESEARCH INSTITUTE OF PHARMACOLOGY AND REGENERATIVE MEDICINE, FEDERAL STATE BUDGETARY INSTITUTION TOMSK NATIONAL RESEARCH MEDICAL CENTER RUSSIAN ACADEMY OF SCIENCES; 4Melentyeva Yulia Vitalevna - Lecturer, REGIONAL STATE BUDGETARY PROFESSIONAL EDUCATIONAL INSTITUTION TOMSK FORESTRY TECHNICAL SCHOOL, TOMSK;
5Kosenko Ksenia Konstantinovna - Pharmacist, LIMITED LIABILITY COMPANY «PHARMACY WORLD», KEMEROVO
Abstract: this article presents the results of the determination of biologically active substances of water-ethanol extracts from H. alpinum L. grass and H. theinum Krasnob. grass by chromatography in thin layers of sorbent.
For the first time, a system has been proposed for the effective separation of the a-glycosides of the xanthone structure, the precursors of isomangipherin and mangiferi-, 2-C,7-O-di-ß-D-glucopyranosyl-1,4,6-tetrahydroxycantone and 4-C, 7-O-di-ß-D-glucopyranosyl-1,3,6,7-tetrahydroxyxanthone. According to preliminary estimates, the grass is H. theinum Krasnob. not inferior to H. alpinum L. and H. flavescens RGL. & Sohmalh. on the content of mangiferin.
Keywords: hedysarum alpinum L., Hedysarum theinum Krasnob., thin-layer chromatography, biologically active substances, mangiferin, isomangiferin, glycosides of a xanthone structure.
Род растений Hedysarum (семейство Fabaceae) в настоящее время насчитывает примерно 309 видов, которые произрастают в различных регионах мира, в том числе и на территории Российской Федерации (примерно 100 видов). В Сибирском федеральном округе произрастает от 20 до 21 вида рода Hedysarum [2].
В 1985 году в СССР на базе ВИЛАР из травы H. flavescens RGL. & Sohmalh. был выделен и рекомендован к производству противовирусный препарат «Алпизарин®» (Alpisarinum), действующим веществом которого является ксантон мангиферин (Mangiferinum).
Данное биологически активное вещество (БАВ) влияет на выработку у-интерферона, обладает иммуностимулирующей, антиоксидантной, кардио- и радиопротектной активностью [6, 8].
Позже в ВИЛАР было предложено получать мангиферин из травы H. alpinum L. однако после перерегистрации препарата, к этому вопросу не возвращались из-за отсутствия объективных данных о химическом составе данных растений и недостаточного обеспечения сырьем.
Сейчас мангиферин производится компаниями ЗАО «Фармцентр ВИЛАР» (Российская Федерация) под торговым наименованием «Алпизарин®» в 3 лекарственных формах, и BV Pharma Joint Venture Company (Социалистическая Республика Вьетнам) под торговым наименованием «Мангогерпин®» в 6 лекарственных формах. В настоящее время сырьем для производства препарата «Мангогерпин®» и «Алпизарин®» являются листья Mango indica L., поскольку виды рода Hedysarum L., ранее используемые в производстве мангиферина, были занесены в списки исчезающих растений - не обеспечена сырьевая база. Недостатком мангиферина, получаемого из листьев Mango indica L. является содержание в нем от
5 до 12% трудноотделяемой примеси гомоизомангиферина - метилированного структурного изомера мангиферина, отличающегося отсутствием фармакологической активности и повышенной токсичностью, по сравнению с мангиферином [5].
В настоящее время из некоторых видов рода Hedysarum L. (Н. neglectum Ledeb, H. alpinum L., H. theinum Krasnob. и др.) выпускается большое количество биологически активных добавок: таблетки «Красный корень», чайный напиток «Красный корень» ЗАО «Эвалар», г. Бийск, таблетки «Копеечник-М» ООО «Алтай», г. Барнаул, чайный напиток «Красный корень» ООО «Зеленое золото Алтая», г. Барнаул и др.
В 2011 году в качестве лекарственного средства зарегистрирована настойка «Красный корень плюс®» ЗАО «Эвалар» (ЛП-000717), при этом в качестве сырья для получения данной настойки используются корневища и корни Н. neglectum Ledeb. [1], хотя, согласно современной классификации, под «красным корнем» принято считать именно корневища и корни H. theinum Krasnob. [10], в то время как корневища и корни Н. neglectum Ledeb. именуются «медвежий корень». Согласно информации на официальном сайте компании, в качестве сырья для производства их настойки допустимо так же использовать корни H. theinum Krasnob., а так же других растений рода Hedysarum L. На данное лекарственное растительное сырье отсутствует какая-либо нормативная документация, что само по себе - нонсенс; компания ЗАО «Эвалар» отказывается от каких-либо комментариев по этому поводу. Недавние проведенные исследования этого объекта дают повод усомниться в качестве данного лекарственного средства [7].
В современной литературе отсутствуют явные отличия H. alpinum L. от H. theinum Krasnob., кроме критерия «цвет корневищ». Однако, во-первых, существуют подвиды данных растений с различным содержанием пигментов, вследствие чего иногда нет возможности отличить один вид от другого по цвету корневищ. Во-вторых, лекарственным растительным сырьем для получения лекарственных средств является именно трава H. alpinum L., и корневища не должны присутствовать в сырье.
Материалы и методы
В качестве объектов исследования были выбраны водно -этанольные извлечения из травы H. alpinum L. и травы H. theinum Krasnob. [3].
Определение биологически активных веществ проводили методом хроматографии в тонких слоях сорбента (ТСХ). Использовали хроматографические пластины «Sorbfil ПТСХ-АФ-А» 10 х 15 см, «Silufol UV-254» 20 х 20 см и 5 х 15 см. Процесс разделения проводили в хроматографической камере 22,5 х 22 х 6 см с притертой крышкой.
Для хроматографирования использовали системы различного состава, описанные в специализированной литературе (хлороформ-этанол-уксусная кислота (15: 5: 1), н-бутанол-уксусная кислота-вода (40:12:28)), а так же - впервые предложенные в ходе проведения работы (бензол- этилацетат-хлороформ-ацетонитрил (9:3:1:1), н-бутанол-ацетон-хлороформ (80:10:3)) [9].
Пластины проявляли опрыскиванием различными реактивами (2 % спиртовой раствор кислоты азотной, 1 % спиртовой раствор алюминия хлорида, 2 % раствор железа (III) хлорида, реактив Драгендорфа, 1 % раствор кислоты пикриновой, 1 % раствор ванилина в кислоте хлористоводородной и др.), а так же парами йода и UV-облучением (люминесцентная лампа УФ-А).
Результаты и их обсуждение
Результаты исследования водно-этанольных извлечений с использованием метода тонкослойной хроматографии приведены в таблице 1.
Значение Цвет хроматограф жческой области
Н. а1ртит Ь. Н. Летит КтаэпоЪ.
До проявления После проявления До проявления После проявления
Система 1: хлороформ-этанол-уксусная кислота (15 : 5 : 1)
0 Коричнево-зеленый В УФ-свете: Оранжевый Коричнево-зеленый В УФ-свете: Оранжевый
0,361 Сине-зеленый В УФ-свете: Сине-зеленый Сине-зеленый В УФ-свете: Сине-зеленый
0,483 Желто-зеленый В УФ-свете: желто-зеленый Желто-зеленый В УФ-свете: желто-зеленый
0,641 - В УФ-свете: зелено-голубой; с ^Ь: желтый - В УФ-свете: зелено-голубой; с ^Ь: желтый
1 Желто-оранжевый Голубой Желто-оранжевый Голубой
Система 2: бутанол-уксусная кислота-вода (40 : 12 : 28)
0 Коричнево-зеленый В УФ-свете: Оранжевый Коричнево-зеленый В УФ-свете: Оранжевый
0,430 - С FeClз фиолетовый - С FeClз фиолетовый
0,643 - С FeCl3 бледно-оранжевый - С FeCl3 бледно-оранжевый
0,796 В УФ-свете: зелено-голубой В УФ-свете: зелено-голубой
1 Серый В УФ-свете: голубой Серый В УФ-свете: голубой
Система 3: бензол-этилацетат-хлороформ-ацетонитрил (9 : 3 : 1 : 1)
0 Коричневый В УФ-свете: голубой Коричневый В УФ-свете: голубой
0,189 Бледно-оранжевый В УФ-свете: оранжевый Бледно-оранжевый В УФ-свете: оранжевый
0,375 - В УФ-свете: зелено-голубой; с ^Ь: желтый - В УФ-свете: зелено-голубой; с ^Ь: желтый
0,53 Бледно-желтый В УФ-свете: оранжевый
0,69 Бледно-желтый В УФ-свете: оранжевый Бледно-желтый В УФ-свете: оранжевый
0,76 Бледно-желтый В УФ-свете: оранжевый
0,81 Бледно-желтый В УФ-свете: оранжевый Бледно-желтый В УФ-свете: оранжевый
1 Коричнево-зеленый В УФ-свете: голубой Коричнево-зеленый В УФ-свете: голубой
Система 4: н-бутанол-ацетон-хло] эоформ (80:10:3)
0,189 Бледно-оранжевый В УФ-свете: оранжевый Бледно-оранжевый В УФ-свете: оранжевый
0,53 Бледно-желтый В УФ-свете: оранжевый
0,69 Бледно-желтый В УФ-свете: оранжевый Бледно-желтый В УФ-свете: оранжевый
0,76 Бледно-желтый В УФ-свете: оранжевый
0,81 Бледно-желтый В УФ-свете: оранжевый Бледно-желтый В УФ-свете: оранжевый
По результатам хроматографии в тонких слоях сорбента подтверждено наличие в обоих видах исследуемого сырья нескольких групп растительных БАВ: по меньшей мере, двух дубильных веществ (система 2, Rf = 0,430; 0,643), двух флавоноидов (система 1, Rf = 0,641; линия фронта), а- и ß-хлорофилла (система 1, Rf = 0,361; 0,483).
Впервые предложена система для эффективного разделения веществ-гликозидов ксантоновой структуры; все окрашенные зоны равномерно распределены на хроматограмме, полностью элюируются с линии старта.
В извлечениях, полученных по авторской методике, согласно данным хроматографии в тонких слоях сорбента, отсутствуют иные биологически активные вещества, кроме ксантонов. Не наблюдается изменения окраски пятен ксантонов при обработке их парами йода. В качестве стандарта использовали ацетоновый раствор мангиферина, соответствующего требованиям НД 008603/09 «Алпизарин». На хроматограмме в системе бензол-этилацетат-хлороформ-ацетонитрил (9 : 3 : 1 : 1) данному веществу соответствовала зона Rf = 0,81. Нормируемой примесью к мангиферину (2-C-yв-D-глюкопиранозил- 1,3,6,7-тетрагидроксиксантон) является гомоизо-мангиферин (3-C-yв-D-глюкопиранозил-1,6,7-тригидрокси-2-метоксиксантон).
Содержание данной примеси нормируется, согласно нормативной документации на данную субстанцию, поскольку эта примесь является трудноотделяемой при использовании классических методик очистки. В норме ее содержание не должно превышать 9 % от общей массы субстанции. На хроматограмме данной примеси соответствовала область Rf = 0,71 (интенсивность окраски флюоресценции меньше, чем у мангиферина).
При обработке извлечения перед хроматографированием последовательно гидроксидом натрия при нагревании, кислотой серной, а затем - водой, в конечном итоге на хроматограмме не обнаруживаются зоны Rf = 0,53; 0,69. Данный результат позволяет предположить, что вещества, элюируемые в области Rf = 0,53; 0,69 являются O-гликозидами двух известных ксантонов - мангиферина и изомангиферина: 2-C,7-O-ди-yв-D-глюкопиранозил -1, 3, 6, 7-тетрагидроксиксантона и 4-C,7-O-ди-J#-D-глюкопиранозил-1, 3, 6, 7- тетрагидроксиксантона. Вследствие их гидролиза, образуются мангиферин и изомангиферин.
В траве H. theinum Krasnob., изомангиферин и его гликозид не были обнаружены. Данный факт является исключительно важным и позволяет предложить метод хроматографии в тонких слоях сорбента в качестве экспрессного в анализе разных видов рода Hedysarum L. С его помощью можно провести анализ на подлинность сырья и исключить фальсификацию, а так же не допустить сбор редких и охраняемых видов растений (H. alpinum L.).
Данная проблема являлась основной причиной перехода ВИЛАР на импортное сырье: H. alpinum L. и H. flavescens RGL. & Sohmalh. были в начале 90-х годов прошлого века включены в различные списки исчезающих видов, а успехи в их культивировании не были достигнуты до сих пор. Напротив, H. theinum Krasnob. не является охраняемым видом; кроме того, он успешно культивируется во многих регионах Российской Федерации. Его корни, полученные от культивируемых растений, служат сырьем для производства различных биологически активных добавок, а надземная часть является отходами и используется для корма крупного рогатого скота [4].
Таким образом, по предварительным оценкам, трава H. theinum Krasnob. не уступает H. alpinum L. и H. flavescens RGL. & Sohmalh. по содержанию мангиферина. Существенным плюсом возможного ее использования в качестве сырья для производства мангиферина является отсутствие в ней трудноотделяемых изомеров мангиферина.
Исследования выполнены с помощью средств фонда содействия инновациям, по программе «Умник», договор 11862ГУ/2017.
Список литературы /References
1. Государственный реестр лекарственных средств состоянию на 11 апреля 2018 года) Часть 1. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_119873/ (дата обращения: 28.11.2018).
2. Курбатский В.И. Флора Сибири. Новосибирск, 1994. Т. 9. С. 165.
3. Патент 2402344 Российская Федерация, Способ получения фитопрепаратов из некоторых видов копеечника (копеечник чайный - hedysarum theinum, копеечник забытый - hedysarum neglectum) / Ю. С. Федорова, А. С. Сухих, П. В. Кузнецов; заявитель и патентообладатель Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кемеровская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, - № 2009121364/21; заявл. 04.06.2009; опубл. 27.10.2010.
4. Сыева С.Я. Нетрадиционные кормовые растения из родов Hedysarum L. и Pentaphylloides Hill. Центрального Алтая и перспективы их использования: автореф. дис. ... канд. биол. наук : 03.00.05 / С. Я. Сыева. Новосибирск, 2005. 16 с.
5. Тихонова Е.Д. Алпизарин - современный препарат противовирусного действия. Усовершенствование технологии получения препарата / Е.Д. Тихонова, Т.Б. Шемерянкина, Т.А. Сокольская // Журнал научных статей «Здоровье и образование в XXI веке», 2008. Т. 10. № 3. С. 395-396.
6. Федорова Ю.С. Влияние фитопрепаратов копеечников (H. neglectum, H. theinum, H. alpinum) на картину периферической крови / Ю.С. Федорова, О.А. Карелина // Вестник ПГФА, 2010. № 7. С. 208-209.
7. Федорова Ю.С. К феномену сравнительного изучения методом ВЭЖХ некоторых типов биологически активных веществ в фитопрепаратах копеечников H. neglectum, H. theinum, H. alpinum / Ю.С. Федорова, П.В. Кузнецов, А.С. Сухих, К.М. Минаев // Ползуновский вестник, 2010. № 3. С. 215-217.
8. Федорова Ю.С. О феномене антитоксического эффекта водно-спиртовых экстрактов некоторых растений рода Hedysarum / Ю.С. Федорова, Ю.В. Мелентьева // Тез. докл. межрегиональной научно-практической конференции «Проблемы медицины и биологии». Кемерово. Вып. 1, 2010. С. 211.
9. Химический анализ лекарственных растений / под ред. Н. И. Гринкевич. М.: «Высшая школа», 1983. 176 с.
10. ЯковлевГ.П. Бобовые земного шара. Л.: Наука, 2011. 144 с.
