CC BY
77
ИЗУЧЕНИЕ КАРДИОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ HEDYSARUM ALPINUM L. Федорова Ю.С.1, Кульпин П.В.2, Суслов Н.И.3, Мелентьева Ю.В.4,
Косенко К.К.5
1Федорова Юлия Сергеевна - кандидат фармацевтических наук, доцент, кафедра фармацевтической и общей химии, Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Кемеровский государственный медицинский университет Министерство здравоохранения Российской Федерации, г. Кемерово;
2Кульпин Павел Валерьевич - младший научный сотрудник;
ЗСуслов Николай Иннокентьевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией, лаборатория фитофармакологии и специального питания Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины
им. Е.Д. Гольдберга Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Томский национальный исследовательский медицинский центр Российская академия наук;
4Мелентьева Юлия Витальевна - преподаватель, Областное государственное бюджетное профессиональное образовательное учреждение Томский лесотехнический техникум, г. Томск;
5Косенко Ксения Константиновна - провизор, Общество с ограниченной ответственностью «Аптечный мир», г. Кемерово
Аннотация: авторами статьи были выявлены антиоксидантные и кардиопротекторные свойства экстракта травы Hedysarum alpinum L., обусловленные наличием в его составе веществ флавоноидной структуры, оксибензойных и оксикоричных кислот. Это позволяет использовать его для получения эффективного и безопасного средства, обладающего одновременно кардиопротекторной и антиоксидантной активностью, для лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний. Результаты данного исследования позволяют использовать копеечник альпийский для создания безрецептурного препарата для профилактики и комплексного лечения различных сердечно-сосудистых заболеваний. Ключевые слова: Hedysarum alpinum L., Hedysarum theinum Krasnob., высокоэффективная жидкостная хроматография, биологически активные вещества, флавоноиды, оксибензойные и оксикоричные кислоты, кардиопротекторное действие, антиоксидантная активность.
STUDY OF THE CARDIOPROTECTIVE PROPERTIES OF BIOLOGAILY ACTIVE SUBSTANCES HEDYSARUM ALPINUM L. Fedorova Yu.S.1, Kulpin P.V.2, Suslov N.I.3, Melentyeva Yu.V.4,
Kosenko K.K.5
1Fedorova Yulia Sergeevna - Candidate of Pharmaceutical Sciences, Associate Professor, DEPARTMENT OF PHARMACEUTICAL AND GENERAL CHEMISTRY, FEDERAL STATE EDUCATIONAL INSTITUTION OF HIGHER PROFESSIONAL EDUCATION KEMEROVO STATE MEDICAL UNIVERSITY MINISTRY OF HEALTH OF THE RUSSIAN FEDERATION, KEMEROVO;
2Kulpin Pavel Valerievich - Junior Researcher;
3Suslov Nikolay Innokentievich - Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Laboratory;
LABORATORY OFPHYTOPHARMACOLOGY AND SPECIAL NUTRITION,
GOLDBERG RESEARCH INSTITUTE OF PHARMACOLOGY AND REGENERATIVE MEDICINE,
FEDERAL STATE BUDGETARY INSTITUTION TOMSK NATIONAL RESEARCH MEDICAL CENTER RUSSIAN ACADEMY OF SCIENCES; 4Melentyeva Yulia Vitalevna - Lecturer, REGIONAL STATE BUDGETARY PROFESSIONAL EDUCATIONAL INSTITUTION TOMSK FORESTRY TECHNICAL SCHOOL, TOMSK;
5Kosenko Ksenia Konstantinovna - Pharmacist, LIMITED LIABILITY COMPANY «PHARMACY WORLD», KEMEROVO
Abstract: the authors of the article revealed antioxidant and cardioprotective properties of the herb extract Hedysarum alpinum L., due to the presence in its composition of substances of flavonoid structure, oxybenzoic and oxycoric acids. This makes it possible to use it to obtain an effective and safe means, which simultaneously possesses cardioprotective and antioxidant activity, for the treatment and prevention of cardiovascular diseases. The results of this study allow the use of Hedysarum alpinum L. to create a non-prescription drug for the prevention and complex treatment of various cardiovascular diseases. Keywords: Hedysarum alpinum L., high performance liquid chromatography, biologically active substances, oxybenzoic and oxycoric acids, cardioprotective action, antioxidant activity.
В настоящее время одним из приоритетных направлений в изучении лекарственных растений является поиск новых видов фармакологической активности уже применяемого лекарственного растительного сырья.
На данный момент в мире насчитывается около 285 видов растений рода Копеечника (Hedysarum), на территории России встречаются 126 видов [17]. Настойки и экстракты растения рода Hedysarum широко применяются как в народной, так и в официальной медицине, их фармакологические эффекты обусловлены наличием большого количества биологически активных веществ (БАВ) [17].
Химический состав копеечников изучается с 1961 года. До 1990 года главным образом проводилось исследование полифенольных соединений и полисахаридов [2, 7, 8]. Идентификацию других классов БАВ (алкалоидов, сапонинов, кумаринов, дубильных веществ), входящих в состав растений рода Hedysarum, проводили только методом фитохимического скрининга [7].
В настоящее время продолжается изучение химического состава растений рода Hedysarum исследователями всего мира на основе самых новых хроматографических и спектральных методов (ВЭЖХ, ГЖХ-МС и др.). В начале XXI века в литературе опубликованы данные о выделении новых видов БАВ этих растений [11, 12, 13, 15, 16].
Например, в впервые найден класс оригинальных производных азулена, некоторые витамины - ретиналь, производное холекальциферола [12], токоферол [19]. Широко представлена среди БАВ группа флавоноидов и ксантонов [13]. В водно-спиртовом экстракте травы H. alpinum обнаружены производные пиразола (3-(3-аминобензамидо)-1-(2,4,6трихлорфенил)-2-пиразолин-5-он), фенола (2,4-
диметоксифенол) и эфиры жирных кислот [15].
Все вышеперечисленные БАВ растений данного рода обуславливают широкий спектр их фармакологических эффектов - кардиопротекторное, антиоксидантное, иммуномодулирующее, антитоксическое, противоопухолевое и др. [3, 4, 10, 14, 17].
На сегодняшний день известна группа флавоноидных соединений (кверцетин, рутин), обладающая антиоксидантными свойствами. Установлено, что они терминируют цепочки радикалов, участвующих в перекисном окислении липидов, тем самым освобождают от активного кислорода и защищают капилляры от ломкости. Высокая противорадикальная активность отмечена также у группы оксикоричных кислот, ксантонов, тритерпенов [9, 18].
Исследования последнего времени показали, что избыточная активация реакций свободнорадикального окисления представляет типичный патологический процесс, который встречается при самых различных заболеваниях (в том числе при сердечно -сосудистых заболеваниях) [9, 18].
В организме человека существует система защиты от повреждающего действия кислородных радикалов. Однако эта система организма в ряде патологических нарушений не в состоянии противостоять массированному выбросу кислородных радикалов. Поэтому, с целью воздействия на свободнорадикальное окисление, в последнее время стали применять антиоксиданты в лечении различных сердечнососудистых заболеваний [5].
Известно, что различные сердечно-сосудистые заболевания позволяют диагностировать на ранних стадиях биохимические показатели плазмы крови [6]. Например, креатинфосфокиназа (КФК) - это фермент, который поддерживает соотношение АТФ и АДФ, являясь катализатором преобразований АТФ. В ходе этих реакций в АТФ накапливается и выделяется энергия для всех биохимические процессов, протекающих в живых системах.
Креатинфосфокиназа представлена несколькими изоферментами:
- КФК-МВ - сердечный изофермент. Содержится в клетках сердечной мышцы. При повреждении клеток миокарда происходит высвобождение креатинкиназы и поступление ее в кровь.
- КФК-ММ - мышечный изофермент. Находится в скелетных мышцах и изменяется при повреждении скелетных мышц.
- КФК-ВВ - мозговой изофермент. Отражает патологию клеток головного мозга.
При повреждении сердечной мышцы наблюдается выход фермента из клеток -
повышение активности креатинкиназы в крови. Поэтому определение креатинфосфокиназы и креатинкиназы МВ в крови широко применяется в ранней диагностике инфаркта миокарда.
Также биохимическими маркерами повреждения миокарда в крови коронарного синуса являются ферменты аспартатаминотрансфераза и аланинаминотрансфераза.
Креатинин - конечный продукт распада креатина, который играет важную роль в энергетическом обмене мышечной и других тканей. Он полностью выводится почками и повышение концентрации креатинина в плазме крови всегда указывает на нарушение их фильтрационной и выделительной функций. Креатинин является своеобразным маркером почечной недостаточности при целом ряде заболеваниях почек (острый и хронический гломерулонефрит, пиелонефрит, поражение почек при сахарном диабете, артериальной гипертонии, мочекаменной болезни, амилоидозе и др.). Тимоловая проба показывает наличие токсического влияния на клетки печени.
Щелочная фосфатаза (ЩФ) широко распространена в тканях организма на клеточной мембране и принимает участие в транспорте фосфора через мембрану клеток и является показателем фосфорно-кальциевого обмена [6].
Таким образом, определение основных групп растительных БАВ копеечника альпийского (H. alpinum L.) и выявление новых фармакологических эффектов данного растительного сырья, а именно антиоксидантной активности и влияния на биохимические показатели крови, является крайне актуальным.
Материалы и методы
Объектом исследования являлся экстракт из травы копеечника альпийского (H. alpinum L.) который получали по ранее разработанному и запатентованному способу (Патент RU 2402344 С1, опубл. 27.10.2010).
Определение основных групп БАВ осуществлялся методом ВЭЖХ. Хроматографирование проводили на приборе системы Альянс («Waters») с детектором с фотодиодной матрицей на колонке Aliance C18 (4,6 x 150), 5 mkm. в режиме элюирования: 0,1% ортофосфорная кислота / ацетонитрил (78:22). Скорость потока -1мл/мин., объем инжекции - 20 мкл, температура колонки - 300С. Подготовка пробы:
раствор образца разбавляли в 5 раз 50% этиловым спиртом. Хроматографическая идентификация найденных БАВ проводилась с образцами свидетелей.
Исследование влияния суммы основных БАВ H. Alpinum на биохимические показатели крови выполнены на 32 беспородных крысах - самках (массой 250-300г). Все манипуляции осуществлялись в соответствии с Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Животных содержали в стандартных климатических условиях на стандартном рационе питания. Опыт проводили в весенний период. Животные были разделены на 2 группы: группа 1-интактный контроль; группа 2 - получала сумму экстрактивных веществ из травы H. alpinum. Расчет наиболее оптимальной дозы проводили методом подбора. Крысам ежедневно вводили в желудок через зонд экстракт травы H. alpinum в дозе 200мг/кг массы тела животного в течение 30 дней. Контрольной группе водили по 2 мл очищенной воды. Подготовка исследуемого образца - рассчитанную дозу сухого экстракта разводили в требуемом количестве воды очищенной. Оценку влияния на биохимические показатели крови крыс исследуемого экстракта осуществляли стандартными методами [1].
В основе метода исследования антиоксидантной активности лежит реакция между малоновымдиальдегидом (МДА) и тиобарбитуровой кислотой (ТБК), которая при высокой температуре и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, содержащего одну молекулу МДА и две молекулы ТБК. Максимум поглощения комплекса приходится на 532 нм [5]. Расчет концентрации МДА в гомогенате проводили по формуле:
, (т- Щ) X и 2 х и 3
С ммоль / г = ^=-,
£х IX Р X и\ х 10
где D1 - оптическая плотность образца с гомогенатом; D2 - оптическая плотность контроля; и1 - объем гомогената, взятого на определение, мл; Ш - конечный объем смеси, мл; Ш - общий объем гомогената, мл; Р - навеска ткани, г; 1 - длина кюветы, см; X коэффициент экстинкции156 мМ-1 см-1; 10 - коэффициент перевода в мл.
Антиоксидантную активность исследуемых образцов оценивали по степени ингибирования образования МДА. В качестве контроля использовали пробирку с теми же растворами и гомогенатом без добавления образца (количество образовавшегося МДА принимали за 100%). В качестве образцов сравнения применяли капли «Красный корень» (Россия, г. Бийск), настойка «Красный корень» (Россия, г. Москва), Эмоксипин 1 % (глазные капли), Танин аптечный, 1% раствор.
Статистический анализ экспериментальных данных проводили методами вариационной статистики по Стъюденту для связанных и несвязанных между собой величин и рангового корреляционного анализа по Спирмену. Уровень значимости устанавливался равным 0,05.
Результаты и их обсуждения
Методом ВЭЖХ в исследуемом образце определена группа основных БАВ, результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1. Содержание БАВ в экстракте травы копеечника альпийского
Группа БАВ Идентифицированные соединения Концентр ация, С, мг/100 мл
Оксибензойные кислоты галловая кислота 0,12
Оксикоричные кислоты хлорогеновая кислота 0,94
Флавоноиды гиперозид 13,4
рутин 6,1
кверцетин 0,79
Результаты исследования биохимических показателей крови приведены в таблице 2. Статистически достоверных изменений уровней альбумина и мочевины в
плазме крови животных отмечено не было. Тимоловая проба показывает отсутствие токсического влияния экстракта копеечника на клетки печени (значения < 4,0).
Таблица 2. Влияние экстракта травы копеечника альпийского на биохимические показатели
крови крыс
Показатель Единица измерения Контроль Н. артит
Щелочная фосфатаза Ед/л 322,19 362,84*
Альбумин г/л 55,34 52,54
Креатинин мкмоль/л 63,2 61,44
Мочевина мкмоль/л 7,73 8,06
Аланин-аминотрансфераза Ед/л 121,56 113,11
Аспартат-аминотрансфераза Ед/л 318,37 290,67
Креатин-фосфокиназа Ед/л 2243,329 1289,4*
Креатин-фосфокиназа MB Ед/л 87,13 73,77*
Тимоловая проба ЕдЯ 0,9 0,726*
* - достоверные отличия данных по отношению к контролю Р< 0,5
Значительное повышение уровня активности щелочной фосфатазы в сравнении с контрольной группой может быть результатом участия костной ткани в регуляции гемостатического потенциала крови животных.
Креатинфосфокиназа, креатинфосфокиназа сердечная фракция МВ, аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза являются биохимическими маркерами повреждения миокарда в крови коронарного синуса. Снижение данных показателей свидетельствует об их положительном действии на энергетический обмен и стабилизацию мембран клеток, в том числе и кардиомиоцитов.
Таким образом, вышеизложенные результаты позволяют предположить наличие кардиопротекторного действия.
Исследования последнего времени показали, что избыточная активация реакций свободнорадикального окисления представляет типичный патологический процесс, встречающийся при атеросклерозе, нарушении мозгового, коронарного и периферического кровообращения, сахарном диабете, воспалительных и дегенеративных заболеваниях опорно-двигательной системы и др. Также реакции, протекающие с участием свободнорадикальных производных кислорода, играют важную роль в процессе старения и озлокачествлении клеток [9, 18].
Наиболее частым образующимся в ходе различных метаболических процессов кислородным радикалом является супероксид (О-2). Это производное кислорода, как и перекись водорода, не является высокотоксичным для макромолекул и клеточных мембран. В результате реакции этих двух веществ, протекающей в присутствии ионов Fe+2 (реакция Габера-Вайса), образуется гидроксильный радикал -ОН, обладающий выраженным цитотоксическим действием. Образование гидроксильного радикала приводит к инактивации различных белков, деструктивным изменениям полисахаридов и стимуляции мутагенеза за счет повреждения ДНК. Активные формы кислорода инициируют перекисное окисление жирных кислот и их дериватов, что приводит к образованию карбонильных соединений, связывающихся с нуклеиновыми кислотами и белками [9, 18].
Наиболее частым механизмом, посредством которого реализуется разрушающее действие кислородных радикалов, является перекисное окисление липидов. Поэтому критерием, позволяющим судить об интенсивности свободнорадикальных реакций, является измерение уровня содержания МДА -продукта окисления полиненасыщенных жирных кислот в клетках, тканях и биологических жидкостях организма.
Антиоксидантная система организма в ряде патологических нарушений не в состоянии противостоять массированному выбросу кислородных радикалов. Поэтому, с целью воздействия на свободнорадикальное окисление, в последнее время стали применять антиоксиданты в лечении различных заболеваний.
Широкое применение нашли такие вещества с антиоксидантной активностью, как а-токоферол, дибутинол, оксипиридины. Однако многие известные антиоксиданты имеют серьезные недостатки: они действуют лишь на конечном этапе свободнорадикального окисления, а при разложении свободных радикалов полиненасыщенных жирных кислот образуют токсичные продукты. В связи со сказанным, поиск более эффективных антиоксидантов является актуальной проблемой.
В данной работе в качестве препаратов сравнения использовались широко известные препараты, обладающие антиоксидантным действием: капли «Красный корень» (Россия, г. Бийск), настойка «Красный корень» (Россия, г. Москва), Эмоксипин 1% (глазные капли) а также 1% раствор танина аптечного. Наличие антиоксидантной активности оценивали по степени ингибирования образования МДА. Положительным результатом считали подавление перекисного окисления липидов более чем на 30%. Результаты эксперимента представлены в таблице 3.
Анализ представленных данных позволяет говорить о наличии антиоксидантной активности у всех исследуемых препаратов. Наибольшая антиоксидантная активность отмечена у экстракта травы копеечника альпийского (83%), наименьшую активность проявил 1% раствор танина аптечного (36,2%).
Таблица 3. Сравнительная характеристика антиоксидантной активности
Исследуемый образец Д 1=532нм С МДА моль/г Ингибирование МДА % Наличие активности
Экстракт копеечника альпийского 0,1* 0,0004 83 +
Капли «Красный корень» 0,22* 0,00115 51 +
Настойка «Красный корень» 0,23* 0,0012 49 +
Эмоксипин 1 % (глазные капли) 0,24* 0,0013 45,7 +
Танин аптечный, 1% р-р 0,28* 0,0015 36,2 +
Контроль1 0,43 0,00235 - -
Контроль2 0,03 - - -
контроль 1 - с гомогенатом ткани; контроль 2 - без гомогената ткани; (+) - наличие активности; (-) - отсутствие активности
* - различие достоверно по сравнению с контролем Р<0,01.
Важно отметить, что у экстракта травы копеечника альпийского антиоксидантная активность значительно выше, чем у препаратов сравнения.
Таким образом, исследование показало, что экстракт травы копеечника альпийского (Н. alpinum L.) обладает как кардиопротекторной, так и высокой антиоксидантной активностью. Уникальное сочетание этих двух фармакологических свойств обусловлено наличием в составе веществ флавоноидной структуры. Результаты данного исследования позволяют использовать копеечник альпийский для создания безрецептурного препарата для профилактики и комплексного лечения различных сердечно-сосудистых заболеваний.
Исследования выполнены с помощью средств фонда содействия инновациям, по программе «Умник», договор 11862ГУ/2017.
Список литературы /References
1. Анализы. Полный справочник / под ред. Ю.Ю. Елисеева. М.: Эксмо, 2007. 767 с.
2. Амангельдин ЕА. К фотохимическому изучению копеечника желтоватого / Е.А. Амангельдин // Труды Института Физиологии АН Каз.ССР, 1968. Т. 11. С. 144.
3. Амосова Е.Н. Антиметастатическая активность препаратов природного происхождения: автореф. дис. ... д-ра биол. наук: 14.00.25 / Е.Н. Амосова. Томск, 2007. 49 с.
4. Антиоксидантная активность видов флоры Алтая / А.Л. Шаварда, И.И. Чемесова, Л.М. Беленовская и др. // Растительные ресурсы, 1998. Т. 34,.Вып. 2. С. 1-8.
5. Биохимия: Учеб. для вузов, под ред. Е.С. Северина, 2003. 779 с.
6. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия 3-е изд., испр. М: Высшая школа, 2000. 479 с.
7. Киселев В.Е. Азотсодержащие вещества некоторых представителей рода копечник /
B.Е. Киселев, Е.Г. Пеккер // Известия СО АН СССР. Сер. биол., 1978. № 1. С. 75-82.
8. Павлова Н.С. Полисахариды дальневосточных видов Hedysarum L. и их хемотаксономическое значение // Растительные ресурсы, 1971. Т. 7. Вып. 4. С. 561.
9. Рогинский В.А. Фенольные антиоксиданты: реакционная способность и эффективность // М.: Наука, 2002. 247 с.
10. Федорова Ю.С. Влияние фитопрепаратов копеечников (H. neglectum, H. theinum, H. alpinum) на картину периферической крови / Ю.С. Федорова, О.А. Карелина // Вестник ПГФА, 2010. № 7. С. 208-209.
11. Федорова Ю.С. К проблеме сравнительного изучения некоторых фитопрепаратов рода Hedysarum / Ю.С. Федорова // Современные технологии профилактики, диагностики и лечения основных заболеваний человека: тез. Всерос. науч. - практ. конф.-Ленинск-Кузнецкий, 2009. С. 245.
12. Федорова Ю.С. К сравнительной оценке биологически активных веществ некоторых видов копеечника методом газожидкостной масс-спектрометрии / Ю.С. Фёдорова, П.В. Кузнецов // Фармацевтическая наука, образование и практика: реалии и перспективы развития: материалы межрегион. сб. Тюмень, 2009. С. 241-244.
13. Федорова Ю.С. К феномену сравнительного исследования ВЭЖХ некоторых видов биологически активных веществ в фитопрепаратах копеечников Н. neglectum, H.ininum, H. alpinum / Ю.С. Федорова, П.В. Кузнецов А.С. Сухих, К.М. Минаев // Ползуновский вестник, 2010. №3. - P.215-217.
14. Федорова Ю.С. О феномене антитоксического эффекта водно-спиртовых экстрактов некоторых растений рода Hedysarum / Ю.С. Федорова, Ю.В. Мелентьева // Медицина в Кузбассе. Кемерово, 2010. Вып. 1. С. 211.
15. Федорова Ю.С. Сравнительный анализ методом газожидкостной масс-спектрометрии летучих компонентов фитопрепаратов от трех видов копеечников (H. neglectum, H. theinum, H. alpinum) / Ю.С. Федорова, П.В. Кузнецов А.С. Сухих // Ползуновский вестник, 2010. № 3. С. 213-215.
16. Федорова Ю.С. Сравнительный фитохимический анализ биологически активных веществ некоторых фитопрепаратов рода Hedysarum / Ю.С. Федорова, П.В. Кузнецов // Вестник Российской академии естественных наук (ЗСО), 2010. Проблема. 12. С. 183-186.
17. Флора Сибири Fabaceae (Leguminosae) / под ред. А.В. Положий, Л.И. Малышевой. Новосибирск: Наука, 1994. Т. 9. С. 280.
18. Цыдендамбаев П.Б. Биологические эффекты флавоноидов / П.Б. Цыдендамбаев, Б.С. Хышиктуев, С.М. Николаев// Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2006. № 6 (52).
C. 229-233.
19. Study of the fatty acid and tocochromanol patterns of some Fabaceae (Leguminosae) plants from Turkey / E. Bagci, L. Bruehl, H. Ozcelik et al. // Grasas y Aceites, 2004. Vol. 55. Iss. 4. P. 378-384.
