CC BY
54
экспериментальные исследования в Биологии и медицине
УДК 618.14-002:612.017.1:616.005.1-08:618.5-089.888.61
Л.И. Анохова, А.В. Патеюк, Б.И. Кузник, С.Т. Кохан
сравнительное влияние полипЕптидов эндометрия и тималина на некоторые показатели иммунитета и гемостаза в опытах
iN vitro и IN vivo
Читинская государственная медицинская академия (Чита) Читинский государственный университет (Чита)
Изучалось влияние полипептидов, выделенных из эндометрия и тималина на некоторые показатели иммунитета и. гемостаза в опытах in vitro, а так же возможность их применения с целью коррекции патологических нарушений в системах иммунитета и гемостаза при развитии послеродового эндометрита у животных в опытах in vivo. Применение данных препаратов приводит, к снижению гиперкоагуляции и активации некоторых показателей иммунитета как в опытах in vitro, так и in vivo, что способствовало снижению падежа и сокращению сроков лечения овцематок с послеродовым эндометритом.
Ключевые слова: иммунитет, гемостаз, послеродовый эндометрит
PoLYPEPTiDEs coMPARATivE INFLuENcE DiscHARGED FRoM ENDoMETRITis and thymaline on some immunity haemostasis indices in vitro and in vivo
L.I. Anokhova, A.V. Pateyuk, B.I. Kuznik, C.T. Kohan
Chita State Medical Academy, Chita Chita State University, Chita
Polypeptides influence discharged, from endometritis and thymaline on some immunity haemostasis indices in vitro and. in vivo was investigated. The possibility of their application to correct pathologic impairments in immunity and. haemostasis in the development of postpartum, endometritis in animals in vivo was also studies. The application of these preparations resulted, in hyper coagulation, decrease and. some immunity indices activation, both in vitro and. in vivo, that contributed to the decrease in loss and. reduction in ewes course of treatment with postpartum endometritis.
Key words: immunity, haemostasis, postpartum endometritis
введение
Послеоперационная инфекция является основной причиной смертности в хирургии. Гнойно-септические осложнения возникают после операции кесарева сечения в 8—10 раз чаще, чем после самостоятельных родов и занимают одно из первых мест в структуре материнской заболеваемости и смертности [4, 6, 9, 10, 11]. Многие авторы отводят патогенным микроорганизмам ведущую роль в развитии гнойно-воспалительных заболеваний [9, 10, 11, 13, 14]. Применяемая анти-биотикопрофилактика осложнений не разрешила проблему. Возникновению гнойного воспаления в послеоперационном периоде способствуют не только выше перечисленные трудности во время выполнения кесарева сечения, но и сама беременность, протекающая на фоне снижения активности клеточного и гуморального иммунитета, а так же развитии гиперкоагуляции [3, 6, 13, 14].
В последнее время при патологии тех или иных органов все чаще применяются полипептидные
препараты — цитомедины. Известно, что цитоме-дины обладают специфическим и неспецифическим действием. Специфическое действие связано с тем органом или клетками, из которых были получены цитомедины. В тоже время неспецифические влияния весьма многообразны и распространяются на иммунитет, неспецифическую резистентность организма, систему гемостаза, перекисное окисление липидов и регенерацию тканей. Неспецифическое действие цитомединов осуществляется на расстоянии, т.е. является дистантным [5, 15].
Цитомедины представляют из себя комплекс полипептидов, они не обладают токсичностью и антигенными свойствами, не являются канцерогенными препаратами и не вызывают нежелательных эффектов в деятельности организма. Являясь природными соединениями, образующимися в самом организме человека и животных, они практически не имеют противопоказаний для применения. Цитомедины присутствуют не только в органах, тканях, клетках, но и в биологических жидкостях.
За счет тканеспецифичности цитомедины должны регулировать тот орган, из которого выделены, кроме того, цитомедины могут действовать далеко за пределами своего органа. Их неспецифическое влияние распространяется на самые различные системы организма [5, 15].
Известно, что цитомедины, как и регуляторные пептиды, оказывают свое влияние через специфические рецепторы. Такие рецепторы выявлены на лимфоцитах, клетках тимуса, бурсы, гепатоцитах и т.д. Следует обратить внимание на то, что регуляторные пептиды могут влиять и непосредственно действуя на мембрану клетки и вторичные месенджеры, которыми являются циклические нуклеотиды. Регуляторные полипептиды живут от нескольких секунд до нескольких минут. В то же время эффект от введения цитомединов может сохраняться в течение длительного времени, а иногда проявляется через несколько дней [5, 15].
Исходя из сказанного, мы решили выделить комплекс полипептидов из эндометрия животных и исследовать их влияние на некоторые показатели иммунитета и гемостаза в опытах in vitro и in vivo.
материалы и методы
Цитомедины получены методом уксуснокислой экстракции из эндометрия 4О здоровых небеременных свиней, полученных при забое на мясокомбинате. Влияние цитотомединов оценивали на экспрессию рецепторов Т- и В-лимфоцитов, а так же на некоторые показатели гемостаза ЗО здоровых родильниц и ЗО больных послеродовым эндометритом. Лимфоциты получали путем центрифугирования на градиенте плотности. Лимфоциты и плазму крови инкубировали с цитомединами эндометрия (1 мг/мл) в течении ЗО минут. Субпопуляции лимфоцитов определяли методом непрямой поверхностной иммунофлуоресценции. Для постановки этой реакции готовый коммерческий раствор моноклональных антител (ТОО «МедБиоСпектр», Москва).
Так же мы сравнили влияние цитомединов эндометрия и известного пептидного иммуномодулятора
— тималина на некоторые показатели иммунитета и гемостаза у 9О больных послеродовым эндометритом овец в племенном совхозе им. Карла Маркса Краснокаменского района Читинской области. Диагноз эндометрита у животных выставлялся ветеринарным врачом, по общепринятым критериям.
Все животные были разделены на З группы по ЗО животных: 1-я группа (контрольная) — овцематки, больные послеродовым эндометритом, получавшие стандартное лечение (Тилобел-5О в дозе О1 мл/кг массы тела) [1, 11, 12, 14], 2-я группа
— овцематки, больные послеродовым эндометритом, получавшие тималин, З-я группа — овцематки, больные послеродовым эндометритом, получавшие пептид эндометрия. Тималин и пептид эндометрия вводили внутримышечно по 1 мг/кг массы тела 1 раз в сутки в течение 1О дней.
Изучаемые пептиды вводили внутримышечно (1О мг/кг массы тела) 1 раз в сутки в течение 1О
дней. Эффективность терапии оценивали по следующим показателям: срокам лечения, прибыли живой массы, сохранности овец, уровню гемаглю-тининов и гемолизинов, содержанию лейкоцитов в периферической крови и антителообразующих клеток (АОК) в селезенке, а так же некоторым показателям гемостаза [5].
При изучении общей коагуляционной активности крови и отдельных фаз коагуляции и фибринолиза использовали гемокоагулометр со стандартным набором реактивов [2, 3, 7].
Все работы проведены в соответствии с Приказом МИНЗДРАВА СССР ОТ 12.08.1977 N 755 «Мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных».
Статистическую обработку материалов осуществляли на ПК, результаты абсолютных значений и Т-критериев по всем параметрам представляли в виде среднего ± среднеквадратичное отклонения от среднего (М ± SD).
результаты
Установлено, что у родильниц с эндометритом происходит снижение числа CD3 + , СD4 + , CD22 +. Пептиды эндометрия при инкубировании с лимфоцитами здоровых родильниц вызывали незначительное увеличение рецепторов на СD4 + , CD22 + , в то время как при инкубировании с лимфоцитами рожениц, больных послеродовым эндометритом отмечено более значительное увеличение экспрессии рецепторов на CD3 + , СD4 + , CD22+ (табл. 1).
Послеродовой период сопровождается признаками гиперкоагуляции, что выражается в сокращении времени свертывания крови и рекальцификации плазмы, АЧТВ, каолин-кефалинового, протромбинового и тромбинового времени, а так же тормозится фибринолиз. При послеродовом эндометрите вследствие кесарева сечения гиперкоагуляция более выражена, что может привести к развитию ряда осложнений.
При инкубации плазмы крови, полученной от здоровых родильниц, с полипептидом эндометрия наблюдалось незначительное удлинение времени свертывания крови и рекальцификации плазмы, каолинового, протромбинового и тромбинового времени, АЧТВ и практически не изменялся эугло-булиновый фибринолиз.
Пептиды из эндометрия проинкубированные с плазмой, полученной от родильниц больных послеродовым эндометритом с вызывали, более значительное увеличение исследуемых времен. Так время рекальцификации плазмы удлинялось и протомбиновое удлинялось в 1,2 раза, каолиновое в 1,4 раза, тромбиновое время — в 2,7 раза, АЧТВ — в 1,8 раза, а эуглобулиновый фибринолиз тормозился почти в 2 раза.
Полученные данные свидетельствуют о том, что пептиды эндометрия обладают антикоагулянтным действием, в связи с чем, было решено проследить, способны ли они связываться со специфическим
ингибитором гепарина — протамин-сульфатом. С этой целью мы брали 0,5 мл пептида в концентрации 1 мг/мл, добавляли 0,1 мл протамин-сульфата, после чего определяли некоторые показатели свертывания крови. Нами установлено, что пептиды эндометрия удлиняли исследуемые времена, что свидетельствует о присутствии в выделенных пептидах из эндометрия животных фракций, подобных гепарину. Особо следует отметить тот факт, что пептиды из эндометрия почти в 2 раза тормозили эуглобулиновый фибринолиз, а присутствии про-тамин-сульфата фибринолитическая активность эуглобулиновой фракции возвращалась к исходным значениям. Влияние пептидов эндометрия во всех опытах было более выражено при инкубации с кровью рожениц, больных послеродовым эндометритом, нежели чем с кровью здоровых рожениц.
Полученные данные свидетельствуют о том, что цитомедины из эндометрия обладают антико-агулянтным эффектом, ингибируют фибринолити-ческую активность плазмы, а так же стимулируют экспрессию рецепторов на CD3 + , CD4 + , CD22 + .
Следующей нашей задачей было исследовать возможность применения полипептидов эндометрия у животных больных послеродовым эндометритом с целью коррекции нарушений иммунитета и гемостаза возникших на фоне воспаления. Для решения этой задачи мы решили сравнить активность известного пептидного иммуномодулятора
— тималина и полученного нами пептида эндометрия на течение послеродового эндометрита у овец. Применение тималина при инфекционных и воспалительных заболеваниях у животных вполне оправдано, так как дает высокий экономический эффект [5, 15].
У овцематок во время беременности отмечались признаки гиперкоагуляции, что выражалось в укорочении времени свертывания крови (в 1,3 раза), рекальцификации плазмы, протомбинового и тромбинового времени (в 1,4 раза), АЧТВ (в 1,3 раза), и одновременно тормозился фибринолиз (в 1,5 раза) и повышалась концентрация фибриногена (в 2 раза). У таких животных в 4 раза чаще появлялась положительная реакция на этанол. Отмечены изменения и в морфологическом составе крови — снижение количества эритроцитов (в 1,2, раза) гемоглобина (в 1,3 раза), общее количество лейкоцитов не изменялось, хотя уменьшалось абсолютное и относительное содержание лимфоцитов.
При развитии эндометрита у овцематок число лейкоцитов возрастало в 2 раза, в 1,6 раза снижался уровень гемаглютининов и гемолизинов, в 1,8 раза уменьшалось содержание АОК в селезенке. Кроме того, развивалась выраженная гиперкоагуляция, нарастало содержание фибриногена, снижалась активность естественных антикоагулянтов и тормозился фибринолиз.
Таблица 1
Влияние пептидов эндометрия на экспрессию рецепторов некоторых популяций лимфоцитов крови здоровых и с послеродовым эндометритом родильниц в опытах in vitro (М ± SD)
Кровь родильниц
Изучаемые показатели 1 Здоровые n = 30 2 здоровые + пептид эндометрия n = 30 1 больные эндометритом n = 30 2 больные эндометритом + пептид эндометрия n = 30
CD3+, % 57,0 і 2,7 61,4 ± 3,1 46,2 ± 2,8 55,7 ± 2,5*
CD4+, % 62,6 і 1,3 67,3 ± 2,2* 21,2 ± 1,3 37,4 ± 2,2*
CD22+, % 18,0 і 2,8 25,4 ± 2,5* 28,2 ± 2,4 39,7 ± 2,1*
примечание: * - достоверность различий между 1 и 2.
Таблица 2
Влияние антибиотиков, тималина и пептидов эндометрия на течение послеродового эндометрита у овцематок
(М ± SD)
Исследуемые показатели Овцематки с эндометритом, получавшие
1 до лечения n = 30 2 стандартная терапия n = 30 З тималин n = ЗО 4 пептид эндометрия n = 30
Сроки лечения (дни) 18-20 14-16 12-14
Сохранность овец, шт. 30 3 0 0
Изменение средней живой массы животных, % Снижение на 4 % Прибыль на 5 % Прибыль на 5 %
Уровень гемаглютининов и гемолизинов, log2 5,6 ± 0,6 4,1 ± 0,7 6,7 і 0,6* 6,9 ± 0,5*
Содержание АОК после лечения, % 13,2 ± 2,4 10,5 ± 1,6* 17,1 і 2,1* 18,2 ± 2,0*
Время свертывания крови, с. 183,3 ± 75,5 216,6 ± 16,5* 251,2 і 19,7* 258,2 ± 16,9*
Количество лейкоцитов в мазке (абс.) 12679 ± 374 10635± 261* 10050 і 826* 9490 ± 643**
примечание: * - достоверность различий между 1 и 2, 3, 4; ** - между 2 и 3, 4.
В опытной группе сохранность овцематок была выше, чем в контроле, что, безусловно, связано с улучшением показателей иммунитета и гемостаза. Так необходимо отметить, что при лечении овцематок тималином и пептидом эндометрия случаев падежа животных не наблюдалось. В контрольной группе отмечался падеж овцематок в 3-х случаях, снижение живой массы в среднем до 4 %. Введение овцематкам тималина или пептида эндометрия способствовало более быстрому выздоровлению животных, а так же увеличению живой массы в среднем на 5 %. Так тималин и пептиды эндометрия увеличивали гемагглютининов и гемолизинов на 15 и 17 %, а содержание АОК повышали в 1,3 и 1,4 раза соответственно. Кроме того, исследуемые пептиды увеличивали время тотального свертывания крови, что характеризует отсутствие гиперкоагуляции, обусловленной воспалением, а так же снижали содержание лейкоцитов в периферической крови до нормальных значений (табл. 2).
заключение
Таким образом, экспериментальные наблюдения за течением послеродового эндометрита у овцематок при использовании тималина и пептида эндометрия доказали эффективность и целесообразность их применения приданной патологии. В дальнейшем есть все основания предлагать выделенный нами из эндометрия комплекс пептидов для лечения эндометрита у животных, что возможно снизит падеж и даст определенный экономический эффект при лечении данного заболевания.
литература
1. Ахмадеев Р.Н., Набиев Ф.Г. Лекарственные препараты для ветеринарии. — Казань, 2000. — 348 с.
2. Балуда В.П., Деянов И.И., Балуда М.В. и др. Профилактика тромбозов. — Саратов: Изд-во Са-рат. ун-та. — 1992. — 176 с.
Сведения об авторах
3. Баркаган З.С. Геморрагические заболевания и синдромы. — М.: Медицина, 1989. — 480 с.
4. Гуртовой Б.Л. Гнойно-воспалительные заболевания в акушерстве // Вестник Росс. ассоц. акуш.-гин. - 1994. - Т. 1, № 1. - С. 16-21.
5. Кузник Б.И., Будажабон Г.Б., Цыбиков Н.Н. и др. Тималин как модулятор иммуногенеза и гемостаза // Фармакол. токсикол. - 1984. - № 1. -С. 67-71.
6. Куперт М.А., Куперт А.Ф. О патогенезе эндометритов после родов // Сиб. мед. журнал (Иркутск). - 2004. - № 7. - С. 35-36.
7. Мачабели М.С. Коагулопатические синдромы. - М.: Медицина, 1970. - 304 с.
8. Никитин В.Я. Ветеринарное акушерство, гинекология и биотехника размножения. - М.: Колос, 2000. - 217 с.
9. Серов В.Н. Профилактика и лечение перитонита после кесарева сечения. Методы гравитационной хирургии крови и интенсивной терапии в акушерстве и гинекологии / Под ред. В.И. Кулакова, В.Н. Серова. - М., 1996. - С. 23-36.
10. Серов В.Н. Профилактика осложнений беременности и родов // РМЖ. - 2003. - № 16. -С. 889-892.
11. Смекуна Ф.А., Туманова В.А., Зак И.Р. Профилактика эндометрита после кесарева сечения // Акуш. и гин. - 1991. - № 10. - С. 10-13.
12. Субботин В.М., Субботина С.Г., Александров И.Д. Современные лекарственные средства в ветеринарии. - Ростов-на-Дону: Феникс, 2001. -600 с.
13. Токова З.З., Фролова О.Г. Абдоминальное родоразрешение и материнские потери // Вестник новых мед. технологий. - 2004. - № 4. - С. 38-40.
14. Тютюнник В.Л., Гуртовой Б.Л. Профилактика и лечение эндометрита после родов и кесарева сечения // РМЖ - 2002. - Т. 10. - С. 18-20.
15. Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Южаков В.В. Пептидергическая регуляция гомеостаза. - СПб.: Наука, 2003. - 197 с.
АноховаЛюдмила Ильинична - к.м.н., ассистент кафедры акушерства и гинекологии педиатрического факультета ФПК ППС ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия (672000, г. Чита, ул. Горького, 39а)
ПатеюкАндрей Владимирович - д.м.н., профессор кафедры основ медицины ГОУ вПо Читинского государственного университета (672039, г Чита, ул. Александро-Заводская, 30; е-таН: PateykAnd@yandex.ru)
Кузник Борис Ильич - д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия (672000, г. Чита, ул. Горького, 39а)
Кохан Сергей Тихонович - к.м.н., Заслуженный врач РФ, зав. кафедрой основ медицины ГОУ ВПО Читинского государственного университета (672039, г. Чита, ул. Александро-Заводская, 30)
