CC BY
39
Сравнительное изучение специфической активности вакцин для профилактики гепатита В методом иммуноферментного анализа с применением отечественных и зарубежных тест-систем
Н.В. Шалунова (shalunova@regmed.ru), А.С. Коровкин
ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, Москва
Резюме
Основным из методов определения специфической активности (СА) вакцин против гепатита В остается определение путем иммуноферментного анализа (ИФА) уровня содержания HBsAg. Определение СА вакцин в ИФА обязательно проводится по отношению к референс-образцу (или стандартному образцу) с последующей статистической обработкой полученных результатов по методу параллельных линий. Однако СА разных вакцин при их сравнительном изучении в рамках одновременной постановки ИФА в одном иммуносорбенте значительно отличается при использовании как отечественных тест-систем, так и зарубежных. В наших исследованиях было изучено пять вакцин против вирусного гепатита В в тест-системах «ГепаСтрип» производства ООО «Ниармедик Плюс» и Abbott Auszyme Monoclonal фирмы Abbott. При статистической обработке полученных результатов было показано, что активность вакцин отличалась в зависимости от референс-образца, а результаты определения СА вакцин против гепатита В в тест-системе ИФА «ГепаСтрип» коррелировали с результатами определения СА тех же серий вакцин в валидированной ранее тест-системе Abbott Auszyme Monoclonal. Эти данные позволили рассматривать обе тест-системы как взаимозаменяемые.
При сравнительном изучении 104 серий наименее активной в ИФА вакцины № 3 и собственного референс-образца предприятия было показано, что СА данной вакцины соответствовала требованиям нормативной документации. Для получения достоверных результатов при определении СА адсорбированной на алюминия гидроксиде вакцины против гепатита В рекомбинантной следует применять только валидированные тест-системы ИФА.
Ключевые слова: гепатит В, вакцина, контроль качества, иммуноферментный анализ, специфическая активность
Comparative Study of Hepatitis B Vaccines' Potency in Domestic and Foreign HBsAg Detection ELISA Kits
N.V. Shalunova (shalunova@regmed.ru), A.S. Korovkln
Federal State Budgetary Institution «Scientific Center for Expert Evaluation Medical Products»
of Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Moscow
Abstract
HBsAg quantification by ELISA is still the main method for hepatitis B vaccine's potency assessment. It's always assessed accordingly to a reference-preparation using the parallel-lines model. Nevertheless, potency of different preparations may vary heavily in conditions of simultaneous ELISA reaction conduction either with domestic «GepaStrip» or imported «Abbott Auszyme Monoclonal» kits application. We had studied five different vaccines. Their relative potency assessed with the parallel-lines model varied independently of the reference preparation or ELISA kit used. In the other hand, all of 104 commercial lots' potency rates of the lowest-potent vaccine layed within the approved limits while assessing it's against the manufacturer's reference preparation in domestic ELISA kit. Concluding our research, we came to a finding that each vaccine's potency should be assessed only against it's own reference-preparation, and the results may vary not only dependently of the reference preparation but of the ELISA kit used. Key words: hepatitis B, vaccine, quality assurance, immunoenzymatic assay, potency
Введение
В Российской Федерации зарегистрирован ряд отечественных и зарубежных вакцин, предназначенных для профилактики гепатита В. Все они производятся с использованием ДНК-рекомбинантной технологии путем культивирования модифицированных дрожжевых клеток, продуцирующих рекомби-нантный (генно-инженерный) поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg). Готовые вакцины должны как отвечать общим требованиям по показателям качества медицинских иммунобиологических препаратов, например по безопасности, так и об-
ладать определенными характеристиками, свойственными именно данному продукту, - специфической активностью, эпидемиологической эффективностью и др. [9 - 12].
С учетом более чем 20-летнего опыта применения ДНК-рекомбинантных дрожжевых вакцин против гепатита В рядом организаций (ВОЗ, Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA), а также Агентством по продовольствию и медикаментам США (FDA)) был предложен способ количественного определения специфической активности (СА) вакцин методом иммуноферментного
анализа (ИФА) в качестве альтернативы обязательным испытаниям СА in vivo на биологических моделях - мышах и морских свинках. Определение содержания HBsAg в вакцинах при испытании в ИФА возможно лишь с применением аттестованных (валидированных) для этой задачи иммунофер-ментных тест-систем (ИФТС) [8].
Ранее нами на основании представленных экспериментальных данных была показана возможность применения отечественной ИФТС «Гепа-Стрип» (ООО «Ниармедик Плюс», Москва) для определения СА вакцин против гепатита В, так как она демонстрировала удовлетворительные аналитические показатели [4].
Цель данной работы - сравнительное изучение СА вакцин против гепатита В в отечественной ИФТС «ГепаСтрип» и референсной тест-системе Abbott Auszyme Monoclonal, широко применявшейся ранее для этих целей.
Материалы и методы
В сравнительных опытах было изучено пять из шести зарегистрированных на территории России вакцин для профилактики гепатита В (две - отечественного и три - зарубежного производства). Номинальное (расчетное) содержание рекомбинантно-го HBsAg (субтипов «ad» и «ay») во всех препаратах составляло 20 мкг/мл. Все вышеперечисленные препараты содержали вспомогательные компоненты: адъювант (гидроксид алюминия) и консервант (тиомерсал). Разведения образцов вакцин готовили в двух независимых повторах от 1:1000 до 1:64 000. В качестве разбавителя для приготовления разведений применяли фосфатно-соле-вой буферный раствор (pH = 7,4) с добавлением 0,2%-ного бычьего сывороточного альбумина (БСА), приготовленный по следующей прописи: на 1 литр дистиллированной воды - 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,15 г Na2HPO4, 0,2 г KH2PO4 и 2 г БСА. Каждое последующее разведение готовили независимо от предыдущего в отдельных пробирках Eppendorf. Содержимое каждой пробирки перемешивали в миксере типа Vortex в течение 8 - 10 секунд. Исследуемые пробы вносили в лунки иммуносорбента в случайном порядке. Режим постановки реакции ИФА определяли в соответствии с инструкциями по применению тест-систем. Исследование выполнялось одновременно в обеих тест-системах одним оператором с использованием одного и того же проверенного оборудования.
Статистическую обработку результатов проводили с применением валидированной компьютерной программы «Паралайн», разработанной главным метрологом ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» В.Г. Петуховым, зарегистрированной в реестре программ для ЭВМ (номер свидетельства 2006612065 от 15 июня 2006 г.) и предназначенной для определения активности препаратов в ИФА. Результат оценивали по отношению к референс-препарату методом параллельных линий [7]. Для определения
активности изучаемых вакцин по отношению к ре-ференс-препарату в программу вводили значения оптической плотности (ОП), полученные при постановке ИФА в двух повторах на каждое разведение вакцины.
Результаты определения СА, полученные в программе «Паралайн», валидировали по критериям линейности и параллельности, определяемым программой [7]. Для оценки совпадения результатов, полученных в изученных тест-системах, применяли коэффициент корреляции Пирсона (г) [5].
Все исследованные вакцины были пронумерованы от 1 до 5.
Результаты и обсуждение
Задачей нашего исследования являлось установление корреляции количественного содержания HBsAg в вакцинах против гепатита В при одновременном определении в двух ИФТС в условиях повторяемости. Учитывая, что в настоящее время отсутствуют единые стандартные образцы ВОЗ для определения иммуногенности вакцин против гепатита В [13], в качестве препарата сравнения нами была выбрана вакцина № 1 с номинальным содержанием HBsAg 20,56 мкг/мл в соответствии с паспортом данной серии. СА референс-вакцины в наших исследованиях всегда принимали за 1,0 и в сравнительных опытах по отношению к ней определяли СА других изучаемых препаратов. Результаты определения СА вакцин по отношению к референс-препарату № 1 представлены на рисунке 1.
Обработка результатов в компьютерной программе «Паралайн» подтвердила их линейность и параллельность для одних и тех же препаратов в обеих тест-системах, что свидетельствовало о правильности выполнения исследования и валидности полученных данных.
Было показано, что значения СА (т.е. количество HBsAg) каждой вакцины, полученные в обеих тест-системах, сопоставимы, так как при оценке корреляции полученных результатов по методу Пирсона коэффициент корреляции г составил 0,994, что свидетельствовало о тесной связи между рядами [5]. При анализе данных был сделан вывод о том, что результаты, полученные в обеих тест-системах, позволяют рассматривать данные ИФТС как взаимозаменяемые. На основании этого вывода было сделано заключение о возможности применения тест-системы «ГепаСтрип» для определения специфической активности вакцин против гепатита В. Эта ИФТС была рекомендована и в дальнейшем использована для определения СА при проведении сертификационного контроля коммерческих серий вакцин против гепатита В в ГИСК им Л.А. Тарасевича и на отечественных производственных предприятиях.
Тем не менее отдельного внимания заслуживал тот факт, что все изученные вакцины различа-
Рисунок 1.
Результаты определения специфической активности вакцин по отношению креференс-препарату - вакцине № 1 в тест-системах «ГепаСтрип» и Abbott Auszyme Monoclonal с учетом фактора разведения
Рисунок 2.
Результаты определения специфической активности вакцин по отношению к разным референс-препаратам
□ Abbott Auszyme Monoclonal □ ГепаСтрип
ю от
от
ГиП og
сэ СЭ
ш
^ 4' 4:
<э
J¡> ¿F ¿p
JP & /
оо
ОО LO
от
от
от
ос^ о"
л
со
со ЮС^ -■-.о-
л
п° пП
N \ <Ъ <Ъ <о # % # # # #
Ч. (9ч.1 гк. гк. гк. гк.
Jp Jp J¡>
rsr . OvT . f£T
v/
Jp
& >¡P
яГ
ОТ
CN -O O
CD
O OT~ СО
o
<э \ <Ъ <Ъ N # # # #
o¿S ГК. ГК. CK. CK.
¿p Jf Jp
//V
v/
У /
o»
'Ъ \ N <э
# # # #
o¿S ГК. ГК. CK. CK.
¿p oí? Jp
v/
У /
o»
Примечание: По результатам одного определения в каждой из тест-систем были получены показатели специфической активности вакцин с учетом поочередного выбора каждой из них в качестве референс-препарата.
0
Таблица 1.
Результаты определения специфической активности вакцины № 3 в тест-системе «ГепаСтрип»
Определяемый показатель Значение
Среднее значение специфической активности по отношению к референс-препарату в выборке 1,58
Минимальное значение специфической активности по отношению к референс-препарату в выборке 0,91
Максимальное значение специфической активности по отношению к референс-препарату в выборке 2,55
Число наблюдений 104
лись по специфической активности, определенной по отношению к референс-препарату № 1, особенно вакцина № 3, активность которой была значительно ниже, чем у остальных препаратов. В обеих тест-системах активность вакцин № 2 и № 4 значительно превышала активность эталонного препарата № 1. Такую разницу в активности изучаемых препаратов можно было бы объяснить тем, что они различались по своему штаммовому составу, технологиям получения рекомбинантного HBsAg, его выделения, концентрирования, очистки и сведения серий [10 - 12]. При этом все изученные вакцины были зарегистрированы в России на основании проведенных клинических исследований на здоровых добровольцах, в которых были подтверждены их безопасность и иммуногенная активность [1 - 3, 6].
Нами была проведена более детальная обработка полученных результатов с применением программы «Паралайн», а именно определение СА вакцин, с использованием поочередно каждого из изученных препаратов в качестве референс-образца. Полученные результаты представлены на рисунке 2. Очевидно, что значение СА вакцины зависит не только от тест-системы, но и от референс-препарата. Так, при применении вакцины № 3 в качестве рефе-ренс-препарата СА всех исследованных препаратов превышала 1,0 в обеих тест-системах; при применении вакцины № 5 в качестве референс-препарата СА всех вакцин превышала 1,0 или преближалась к 1,0 в обеих тест-системах. При этом показатели СА вакцин № 2 и № 4 во всех случаях значительно превышали активность референс-препарата.
В соответствии с требованиями нормативной документации на вакцины для профилактики гепатита В активность препарата, определяемая методом ИФА, должна составлять не ниже 85% от активности референс-образца. Дальнейшее изучение 104 серий вакцины № 3 с применением ИФТС «ГепаСтрип» и использованием в качестве референс-препарата стандартного образца предприятия, предоставленного производством, выпускающим данную вакцину, показало, что во всех случаях приведенные в таблице 1 данные отвечали критериям линейности и параллельности. Среди изученных серий вакцины минимальная активность составила 0,91 по отношению к референс-препарату, или 91% от активности стандартного образца; максимальная - 2,55, или 255% от активности стандартного образца, что соответствовало требованиям норма-
тивной документации на данный препарат. Среднее значение активности по результатам контроля 104 серий вакцины составило 1,58 по отношению к референс-препарату.
Таким образом, определение активности вакцины против вирусного гепатита В № 3, показавшей наименьшую СА в ИФА по сравнению с референс-препаратом № 1, при контроле 104 серий продемонстрировало стабильное качество по отношению к референс-образцу собственного предприятия в обеих тест-системах. Дальнейшее изучение разных серий вакцин, выпускаемых одним и тем же предприятием, показало, что значения СА, определяемой по отношению к референс-образцу предприятия, могут колебаться от серии к серии, но тем не менее находится в определенных рамках и соответствовать требованиям отечественной и зарубежной нормативной документации. Эти данные позволили нам сделать вывод, что определение СА в ИФА должно проводиться с применением различных ре-ференс-образцов производственных серий вакцин различного производства. Дальнейшие контрольные испытания препаратов проводили только по отношению к стандартным образцам предприятия, приготовленным по одной и той же технологии из одного и того же производственного штамма. Наши данные впоследствии были подтверждены в рекомендациях ВОЗ [13]. Была предложена возможность использования в опытах ИФА препаратов сравнения, специфичных для одной и той же конкретной технологии с использованием одного и того же штамма-продуцента и в ИФТС, сконструированной и валидированной на выявление HBsAg в сорбированной вакцине.
В Европейской фармакопее имеются требования к референс-препарату: при его выборе необходимы предварительные исследования с целью оценки показателей иммуногенной (специфической) активности [10].
Кроме того, в качестве референс-препарата должна быть выбрана такая серия вакцины, которая обладает наименьшей в пределах заложенных требований активностью в ИФА, но при этом вызывает адекватный иммунный ответ у лабораторных животных и, главным образом, у привитых лиц. В настоящее время при контроле вакцины гепатита В рекомбинантной в качестве референс-образца используется стандартный образец предприятия.
Иммуноферментная тест-система «ГепаСтрип» используется в практической работе ФГБУ НЦЭСМП
Минздрава России и отечественных производственных предприятий, выпускающих вакцины, для определения СА вакцин против вирусного гепатита В.
Выводы
1. Результаты определения СА вакцин против гепатита В в тест-системе ИФА «ГепаСтрип» коррелировали с результатами определения СА тех же серий вакцин в валидированной ранее тест-системе Abbott Auszyme Monoclonal, что позво-
ляет рассматривать обе тест-системы как взаимозаменяемые.
2. На основании проведенных исследований установлено, что для определения СА в ИФА зарегистрированных в РФ рекомбинантных вакцин против гепатита В следует применять референс-препарат, специфический для данного продукта, приготовленный на основе штамма-продуцента вакцины и аттестованный регулирующими органами в качестве стандартного образца предприятия. ш
Литература
3.
Горбунов М.А., Павлова Л.И., Носкова А.В. и др. Сравнительная оценка иммуногенности и реактогенности рекомбинантных вакцин против вирусного гепатита В // Вопросы вирусологии. 1993. № 5. С. 216 - 218.
Горбунов М.А. Эффективность рекомбинантных вакцин против гепатита В и результаты их применения // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997. № 6. С. 55 - 58.
Горбунов М.А., Павлова Л.И., Ершов В.И. и др. Результаты полевых испытаний вакцины против гепатита В Шанвак В // Биопрепараты. 2003. № 2 (10). С. 10 - 12.
4. Коровкин А.С., Шалунова Н.В. Изучение возможности применения отечественных коммерческих иммуноферментных тест-систем для определения специфической активности вакцин против гепатита В // Биофармацевтический журнал. 2011. Т. 3. № 4. С. 34 - 40.
5. Масяго А.В. Особенности количественных тест-систем // Новости «Вектор-Бест». 2004. № 1.
6. Павлова Л.И., Скворцов С.В., Горбунов М.А. и др. Отечественная рекомбинантная вакцина против гепатита В (результаты контролируемых испытаний) // Вопросы вирусологии. 1996. № 4. С. 170 - 172.
7. Петухов В.Г. Метод параллельных линий для количественной оценки качества стандартных образцов и других медицинских иммунобиологических препаратов в иммуноферментном анализе // Биопрепараты. 2004. № 1. С. 5 - 10.
8. Assay of hepatitis B vaccine (rDNA) / European Pharmacopeia, 7th edition. 2011. Р. 175 - 176.
9. Burnette W.N. Properties and relative immunogenicity of various preparations of recombinant DNA-derived hepatitis B surface antigen // Dev. Biol. Stand. 1985. V. 59. P. 113 - 120.
10. Samal B., Browne J. et al. Hepatitis B Vaccine (rDNA) / European Pharmacopoeia, 6th edition. 2009. P. 2188, 2189.
11. Hollinger F.B.D., Troisi C., Heiberg D. et al. Response to a hepatitis B polypeptide vaccine in micelle form in a young adult population // J. Med. Virol. 1986. V. 19 (3). Р. 229 - 240.
12. Howard C.R., Young PR., Lee S. et al. Hepatitis B surface antigen polypeptide micelles from antigen expressed in Saccharomyces cerevisiae // J. Virol. Methods. 1986. V. 14 (1). P. 25 - 35.
Recommendations to Assure the Quality, Safety and Efficacy of Recombinant Hepatitis B Vaccines. WH0/BS/10.2130. http://www.who.int/biologicals/ BS2130_HEPB_Recomm_CLEAN.pdf
Requirements for hepatitis B vaccines made by recombinant DNA techniques (Requirements for biological substances No. 45, amendment 1997). In: WHO Expert Committee on Biological Standardization. Forty-eighth Report. - Geneva: World Health Organization, 1999, Annex 4 (WHO Technical Report Series, N 889, 1999). P 94 - 96.
13
14
информация роспотребнадзора
Об итогах надзора за клещевым энцефалитом в эпидсезон 2012 года
Письмо от 30.11.2012 года № 01/13680-12-32 (Выдержки. Окончание на стр. 72)
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека информирует, что эпидемиологическая ситуация по клещевому энцефалиту (КЭ) в Российской Федерации остается напряженной.
В эпидемический сезон 2012 года в 69 субъектах Российской Федерации в лечебно-профилактические организации ( ЛПО) обратились более 510 тыс. пострадавших от укусов клещами, из них 110 тыс. детей.
Количество пострадавших по сравнению с аналогичным периодом предыдущего года снизилось на 11,2%. Снижение числа обращений в 2012 году по сравнению с 2011 годом зарегистрировано в Уральском, Сибирском, Приволжском федеральных округах: в Пермском крае - в 1,7 раза, Курганской и Свердловской областях - в 1,9 раза, в Тюменской области - в 1,6 раза, в Челябинской и Томской областях - в 1,5 раза.
Рост количества обращений зарегистрирован в Московской области - в 2,8 раза, в Ульяновской области - в 1,7 раза, в Тульской области - в 1,6 раза, в Новгородской и Псковской областях - в 1,5 раза, в Санкт-Петербурге - в 1,4 раза.
В Дальневосточном федеральном округе количество пострадавших от укусов клещей осталось на прежнем уровне.
За 10 месяцев 2012 года в Российской Федерации зарегистрировано 2264 случая КЭ, в том числе 338 - среди детей (2011 г. - 3471 случай, 444 - среди детей). Заболевания КЭ регистрировались в 46 субъектах Российской Федерации (в 2011 г. - в 45).
Диагноз лабораторно подтвержден в 88,3% случаев (2011 г. - в 89%). По сравнению с прошлым годом снижение заболеваемости отмечено в Курганской области - в 2,4 раза, Тюменской области - в 3,1 раза, Челябинской области - в 2,7 раза, Республике Карелия - в 2,1 раза. Рост заболеваемости более чем в 2 раза зарегистрирован в Ярославской и Псковской областях.
В 2012 году зарегистрировано 39 летальных исходов КЭ, из них 2 - среди детей (2011 г. - 32, из них 1 - у подростка 17 лет). Максимальное количество летальных исходов (20 случаев) зарегистрировано в Сибирском федеральном округе, из них 5 - в Красноярском крае и 4 - в Иркутской области.
