CC BY
5Таблица 2
Влияние охлаждения и замораживания сперматозоидов на содержание НАДН и ФАД и их процентное соотношение при различных функциональных тестах (п = 10)
Вариант Интенсивность флюоресценции
Свежеполученная сперма Заморожено-оттаянная
НАД.Н, % ФАД, % НАД.Н, % ФАД, %
Свежеразбавленная: усл. ед. 12±1,7 3±0,4 9±0,5 6±0,9
% 100 100 100 100
+ пируват + сукцинат 105±5,5 107±3,5 102±3,9 106±6,6
+ ДНФ 37±5,9 46±7,6 49±3,9 79±4,9
+ антимицин 83±12 120±19,0 64±5,2 82±4,7
ния лишь на 15 и 3%, т.е. реакция сперма- тирующих веществ.
тозоидов на добавление 2,4-ДНФ и ингиби- Таким образом, после температурно-
тораов дыхания после замораживания-от- го шока полностью нарушается регуляция таивания снижается. Это свидетельствует электронно-транспортной системы спер-о разобщении и частичном нарушении на- мотозоидов, после замораживания-оттаи-чального НАД.Н зависимого участка ды- вания имеет место разобщение и частич-хательной цепи. ное нарушение начального НАД - зави-
Сравнительное исследование дыхания симого участка дыхательной цепи. Следо-сперматозоидов хряков и петухов показа- вательно, при совершенствовании метода ло идентичность в характере ответных ре- криоконсервации спермы необходимо вес-акций на действие сукцината, 2,4-динитро- ти изыскание способов защиты 1-го пункта фенола и антимицина А. Различия заклю- (участка) дыхательной цепи как наиболее чались лишь в силе ответа на действие тес- чувствительного. РЕЗЮМЕ
Исследовали редокс-реакции НАД.Н и ФАД при разбавлении, охлаждении и замораживании-оттаивании сперматозоидов хряков и петухов с использованием ингибитора дыхания антимицина А и разобщителя дыхания 2,4-динитрофенола (ДНФ). Установлено, что холодовой шок неразбавленной спермы приводит к резкому снижению количества НАД.Н и ФАД.
После замораживания-оттаивания сперматозоидов наблюдается увеличение окисленности НАД и ФАД и снижение реакции на добавление ДНФ и антимицина. Результаты оценки редокс-состояния НАД и ФАД , полученые флюоресцентным методом, согласуются с полярографическими данными по реакции дыхания сперматозоидов в ответ на действие ингибиторов дыхания и ДНФ после охлаждения и замораживания-оттаивания спермы. SUMMARY
Redox-reactions of NAD.H and FAD of boar and cock sperm during diluting, cooling and freezing - thawing were studied. 2,4-dinitrophenol (DNP) and antimycin were used as testing substances. It was established, that cold shock of undiluted sperm results in great reduction of NAD.H and FAD amount. The growth of oxidation of NAD and FAD sperm after freezing - thawing was observed. Reduction of reaction on injecting 2,4-DNP and antimycin was as well. The results of estimation of a redox-condition NAD and FAD provided by a fluorescent method well correlated with data of polarographic estimation of spermatozoa respiration after cooling and freezing - thawing.
УДК: 57.085.23:615.014.41 Л.Г. Абрафикова
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины (ИПКиК)
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СОХРАННОСТИ ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ПОД ЗАЩИТОЙ И БЕЗ КРИОПРОТЕКТОРА
Изучали жизнеспособность фибро- и без него. бластов человека после криоконсервиро- Суспензию клеток в ростовой среде
вания с криопротектором ДМСО (10%) 199 и в среде 199 с добавлением 10% ДМ-
СО замораживали с медленной скоростью до -196° С и хранили при этой температуре в течение 1 года (срок наблюдения). Было установлено, что основная гибель клеток происходила на этапах замораживания-отогрева. Более высокая жизнеспособность наблюдалась при замораживании
под защитой ДМСО (43-45%).Сохранность клеток в питательной среде 199 без ДМСО составляла 23-26%.
Сам процесс хранения при постоянной температуре жидкого азота (-196° С), дополнительной гибели клеток, замороженных с криопротектором и без него, не вызывал.
SUMMARY
During cryopreservation of human fibroblasts slow freezing in 199 medium with adding 10% DMSO as cryoproptectant provides higher survival rate. Storage process at -196° C does not cause an additional cell death.
Т.И. Акимочкина
Астраханский Государственный Университет
ПЕРСПЕКТИВЫ ИЗУЧЕНИЯ МОРФОЛОГИИ СПЕРМИЕВ РЫБ С ЦЕЛЬЮ ОЦЕНКИ ИХ КАЧЕСТВЕННОГО СОСТОЯНИЯ ПОСЛЕ ХРАНЕНИЯ В УСЛОВИЯХ СВЕРХНИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ
В проблеме сохранения генофонда редких и исчезающих видов рыб многие научные коллективы России используют традиционную криотехнологию, где основным хладоагентом для хранения репродуктивных клеток животных является жидкий азот. При замораживании основным фактором повреждения спермиев и других клеток является напряжение, возникающее в результате кристаллизации воды. Чтобы предотвратить деструктивное влияние на клетки сверхнизкой температуры, перед замораживанием к нативной сперме добавляют искусственную среду сложного состава, которая служит криопротектором. В современной литературе опубликовано много работ по вопросам изучения криоза-щитных свойств различных веществ. Эффективность протекторов обычно оценивают по времени и количеству (в %) подвижных клеток. Как правило подвижность спермиев после дефростации резко снижается, но по опубликованным в последние годы данным оплодотворяющая способность их сохраняется.
С целью изучения возможности оплодотворения нативной икры севрюги де-фростированной спермой в 2005 году нами были проведены экспериментальные исследования на Кизанском рыбоводном заводе Астраханской области. После размораживания подвижность сперми-ев была крайне низкой, а количество ак-
тивных клеток составило не более одного процента. Несмотря на столь низкую подвижность спермиев нами зарегистрирована не только оплодотворяемость, но и выклев личинок. Вероятно, оплодотворение произошло за счет диффузии спер-миев в яйцеклетку.
Важно отметить, что оплодотворяе-мость икры была выше, чем выклев личинок, который составил несколько процентов от общего количества икры. Полученные нами предварительные данные исследований в принципе согласуются с опубликованными в научной литературе фактическими материалами.
Таким образом, кроме подвижности спермиев их качество после хранения в условиях сверхнизкой температуры следует также оценивать по морфологическим признакам.
С этой целью мы использовали способы световой микроскопии мазков спермы. После получения спермы от производителей приготавливали мазок на предметном стекле, таким же приемом, как и для приготовления мазков крови. Мазок спермы подсушивают на воздухе, фиксируют в этаноле и окрашивают гематоксилин-эозином. Затем краску смывают, ополаскивая водой, и высушивают. Микроскопиру-ют клетки в иммерсионном масле при увеличении 7x90. В ходе микроскопии регистрируют следующие показатели:
