CC BY
30
чения белой и розовой телятины рекомендации. - ВНИИЖ. 2011. 74 с.
8. Eastridge, M.L., Roseler, D.K. Grain intake and growth of pre-weaned dairy calves
// Spec. Circ. / Ohio State Univ. Ohio Agr. Res. and Dev. Cent. 1998. № 163. P. 54-57.
DOI:10.34617/pghg-s427 УДК 638.145.43
КРИОУСТОЙЧИВОСТЬ СПЕРМЫ ТРУТНЕЙ В ЭЛЕКТРОЛИТНОЙ И НЕЭЛЕКТРОЛИТНОЙ СРЕДЕ
Гулов Алексей Николаевич1 - науч. сотр., соискатель Сайфутдинова Зифа Низамовна2 - канд. биол. наук Митрофанов Дмитрий Викторович1 - науч. сотр., соискатель Языков Иван Андреевич1 - мл. науч. сотр., магистрант 1ФГБНУ «Федеральный научный центр пчеловодства»
2ФГБНУ «Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я. Р. Коваленко Российской академии наук»
Рассматриваются вопросы криоконсервации спермы трутней медоносной пчелы. В качестве разбавителей испытывали питательные среды для культур клеток насекомых. Тестировали криопротекторы - диметилсульфоксид (контроль), натуральный пчелиный мед, мед в сочетании: с глицерином, ДМСО, этанолом, метанолом. Выявлена низкая жизнеспособность (Lim 36,5±1,8 % - 39,9±0,3 %) и подвижность замороженоот-таянной спермы (Lim 2,0 - 4,0 балла), разбавленной в синтетических средах. Высокую жизнеспособность сперматозоидов и их подвижность 4,0 балла наблюдали в образце с 3 % глицерином 78,0±1,4 % и с 10% ДМСО 79,6±1,2 %. При этом, сперма до замораживания находилась в состоянии мезабиоза в течение 3 мес. при 3 °С.
Ключевые слова: криоконсервация спермы; жизнеспособность сперматозоидов.
THE DRONE SPERM OF CRYOSTABILITY IN AN ELECTROLYTE AND NON- ELECTROLYTE ENVIRONMENT
Gulov Alexey Nikolaevich1, researcher
Sayfutdinova Zifa Nizamovna2, leading researcher
Mitrofanov Dmitry Viktorovich1, researcher
Yazykov Ivan Andreyevich1, junior researcher, undergraduate
tFSBSI «Federal beekeeping research centre»
2FSBSI «Federal Scientific Centre VIEV»
The questions of cryopreservation of sperm of honeybee drones are considered. Nutrient media for insect cell cultures were tested as diluents. We tested cryoprotectors - dimethylsulfoxide (control), natural honey, honey in combination with glycerol, DMSO, ethanol, and methanol. Low sperm viability (Lim 36.5±1.8 % - 39.9±0.3 %) and mobility was detected of frozen-thawed sperm (Lim 2.0 - 4.0 points) diluted in synthetic media. High sperm viability and motility of 4.0 points were observed in a
sample with 3 % glycerol 78.0±1.4 % and 10 % DMSO 79.6±1.2 %. Before freezing, sperm was in a state of mesabiosis for 3 months at 3 °C.
Key words: sperm cryopreservation; sperm viability
Главная цель низкотемпературного хранения спермы - это сделать возможным использование ее для искусственного осеменения пчелиных маток с сохранением воспроизводительной способности на уровне осемененных свежеотобранной спермой или полученных в условиях естественного спаривания. В этом случае возможно широкое применение замороженной спермы с целью получения ранних плодных маток. При решении этой задачи необходимо вести систематический контроль состояния спермы в процессе крио-хранения, осуществлять поиск оптимальных разбавителей и криопротекторов.
Во время длительного хранения в жидком азоте сперматозоиды подвергаются воздействию целого ряда факторов, вызывающих структурные и функциональные изменения клеток. Данные процессы могут быть сгенерированы тем или иным видом криофилактика или реакцией среды экстендера. Криоконсервация на основе метанола с добавлением яичного желтка способствовала значительному улучшению подвижности сперматозоидов после замораживания-оттаивания [1]. Использование этилового спирта в составе среды для замораживания спермы хряка увеличило абсолютный показатель живучести сперматозоидов. Добавление пчелиного меда в состав разбавителей значительно улучшает подвижность сперматозоидов после оттаивания, целостность их мембран и акросом, а также снижает количество аномалий в морфологии сперматозоидов у лошадей [2], быков [3], буйволов [4], коз [5], баранов [6], крыс и мышей, рыб, человека.
Цель работы - изучить влияние различных разбавителей и криопротекторов на криоустойчивость спермы трутней.
Методика исследований. Качество спермы оценивали по показателям - подвижности, целостности цитоплазматиче-
ских мембран сперматозоидов методом флуоресцентной микроскопии с использованием набора LIVE/DEADTM Sperm Viability Kit L 7011 (Life Technologies Limited, Scotland) и морфологии спермиев методом суправитального окрашивания набором Diff Quick. В первой серии исследований проводили испытание питательных сред для культур клеток насекомых: среда С46 рН 7,2; Lonza Insect-XPRESSTM рН 6,1 осмолярность 371 мосмоль/кг; Schneider's Drosophila Medium c L-глутамином рН 4,6, осмолярность 278 мосмоль/кг; Grace's Insect Medium (2x) рН 6,3, осмолярность 715 мосмоль/кг; JPL-41 Insect Medium c хлоридом кальция, бикарбонатом натрия и без L-глутамина, рН 5,96,5, осмолярность 330-370 мосмоль/кг. Во второй серии опытов исследовали крио-устойчивость спермы, разбавленной в среде С46 в сочетании с яичным желтком без добавления и с добавлением ДМСО. Задача третьей серии опытов заключалась в изучении криоустойчивости спермы в неэлектролитной среде. Испытывали следующие варианты разбавителя:
мед+лактоза+сахароза+яичный желток;
мед+лактоза+сахароза+яичный жел-
ток+метанол 10%;
мед+лактоза+сахароза+яичный жел-
ток+этанол 10%;
мед+лактоза+сахароза+яичный жел-
ток+10% ДМСО;
мед+лактоза+сахароза+яичный жел-
ток+3% глицерин. Концентрацию ионов водорода в разбавителе доводили 6М №ОН до значения рН 8,2. Исходный рН меда - 4,0.
Результаты исследований и их обсуждение. В ходе предварительной оценки испытываемых синтетических сред выявилось их, весьма положительное действие, на физиологическое состояние сперматозоидов (табл. 1).
Таблица 1 - Показатели качества спермы до и после криохранения в течение 7 сут
Разбавитель Показатели качества
Жизнеспособность, % Подвижность, балл Сперматозоиды с дефектами головок, %
после до после до после до
Lonza 39,9±0,3ab 78,8±0,65 2,0 5,0 36,0±1,7 25,4±6,3
Graces 38,2±0,7cb 78,7±6,4 3,5 5,0 38,4±2,7 41,3±4,6аь
С46(контроль) 55,1±2,5b 88,7±2,2 4,0 5,0 23,8±1,5b 19,3±3,8b
Schneider's 36,5±1,8db 95,2±2,8 2,0 5,0 44,3±2,4db 47,0±4,2
JPL-41 38,4±0,8eb 91,2±0,4 4,0 5,0 36,2±3,1 23,0±5,1
aвcde- достоверные различия при р<0,01
Цитоплазматическая мембрана сперматозоидов, разбавленных в подкисленной синтетической среде, подверглась наибольшему воздействию условий криохранения. Контрольные образцы, разбавленные в среде с рН 7,2 (С46) достоверно надежно были защищены от агрессивных
условий хранения в жидком азоте.
Применение яичного желтка, в ходе собственных исследований, благотворно сказалось на сохранности плазматических мембран сперматозоидов трутней (табл. 2).
Таблица 2 - Показатели качества заморожено-оттаянной спермы после 7 сут криохранения
Разбавитель Показатели качества
Жизнеспособность, % Подвижность, балл
С46 (1,0 мл) + ДМСО 10% (контроль) 51,5±3,5ca 1,5
С46 (0,5 мл) + ДМСО 10% + 0,5 мл желток 47,2±11,3ba 1,5
С46 (0,5 мл) (без ДМСО) + 0,5 мл желток 2,7±0,7а 0,5
Ь^ достоверные различия при р<0,05
Однако подвижность сперматозоидов, как опытного, так и контрольного образцов, была предельно низкой на одном уровне. Полусинтетическая среда С46 с добавлением яичного желтка и без ДМСО не обладает криофилактическими свойствами для защиты жизненного ресурса спермы трутней.
Результаты исследований продемонстрировали нам натуральный пчелиный мед в качестве криопротектора, а в сочетании с 3% глицерином или 10% диме-тилсульфоксидом мед обеспечил самую высокую защиту жизненного ресурса спермы трутней медоносной пчелы в сравнении с синтетическими средами и яичным желтком (табл. 3).
Таблица 3 - Показатели качества спермы после криоконсервации в электролитной и неэлектролитной среде
Показатели Разбавитель
С46+ДМСО 10% (контроль) Мед+глицерин 3% Мед+ДМСО 10% Мед
Жизнеспособность, % 55,1±2,5a 78,0±1,4ba 79,6±1,2ca 37,2±0,5d
Подвижность, балл 4,0 4,0 4,0 3,0
abc- достоверные различия при р<0,01
Выводы. Предварительные результаты исследований впервые демонстрируют перспективы натурального пчелиного меда по сохранению жизненного ресурса спермы трутней медоносной пчелы во время криоконсервации. Длительное охлаждение неразбавленной спермы (состояние мезабиоза) в течение 3 мес при 3 °С создает условия для более эффективного проявления свойств криопротекто-ров глицерина и ДМСО по защите орга-нелл клеток и их энергетического потенциала при низкотемпературном хранении.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Правительства Рязанской области (проект 18-44-620001).
Список литературы
1. El-Sheshtawy R.I. Natural honey as a cryoprotectant to improve Arab stallion post-thawing sperm parameters / R.I. El-Sheshtawy, D.A. El-Badry / / Asian Pacific Journal of Reproduction. - 2016. - V. 5(4). - P. 331-334.
2. Herranz-Jusdado J.G. European eel sperm storage: Optimization of short-term protocols and cryopreservation of large vol-
umes / J.G. Herranz-Jusdado, V. Gallego, C. Rozenfeld / / Aquaculture. - 2019. - V. 506. -P. 42-50.
3. Kandiel M.M.M. Quantitative Ultrastructure Evaluation of Egyptian Buffalo Bull Frozen-Thawed Spermatozoa under the Effect of Honey / M.M.M. Kandiel, A.R.M. El-Khawagah / / Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. - 2019. - V. 6 (3). - P. 92-98. DOI: 10.21276/sjavs.2019.6.3.4
4. Malik A. Subtitusi Madu Asli Pengganti Gliserol dalam Pembekuan pada Kualitas Pasca-thawing Spermatozoa Sapi Bali / A. Malik, R. Fauzi, M.I. Zakir / / Acta veterinaria indonesiana. - 2017. - V. 5(2). - P. 98-104.
5. Shikh Maidina M. Supplementation of Nigella sativa Oil and Honey Prolong the Survival Rate of Fresh and Post-Thawed Goat Sperms / M. Shikh Maidina, M.H. Padlana / / Tropical Animal Science Journal. - 2018. - V. 41(2). - P. 94-99. DOI: https://doi.org/10.5398/tasj.2018.41.2.94
6. Zaghloul A. A. Relevance of Honey Bee in Semen Extender on the Quality of Chilled-Stored Ram Semen / A.A. Zaghloul / / J.Animal and Poultry Prod. - 2017. - V. 8(1). -P. 1- 5.
