CC BY
40© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
М.И.Черникова, О.С.Каширина, Ю.М.Васильев
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННОСТИ АДЪЮВАНТОВ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ И МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ НА МОДЕЛИ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГРИППА
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва
Цель. Прямое сравнение иммуногенности адъювантов различной природы и механизма действия для инактивированных вакцин против гриппа. Материалы и методы. Мышей иммунизировали внутримышечно двукратно инактивированной цельновирионной вакциной на основе вируса гриппа A/California/07/2009 X-179A (H1N1). В качестве адъювантов (в сумме — 10) к вакцине добавляли гидроксид алюминия, олигонуклеотид CpG, полный адъювант Фрейнда, микрочастицы поли(лактид-ко-гликолида), монофосфорил липид А и полиоксидо-ний, а также 2 адъюванта на основе охарактеризованных субстанций хитозана с различными физико-химическими свойствами и 2 экспериментальных комплексных препарата (многокомпонентный адъювант и эмульсию по типу масло в воде на основе сквалена и токоферола). Иммуногенность определяли по титрам сывороточных антител в РЗГА и РН (MDCK). Результаты. Различные адъюванты неодинаково повышали иммуногенность вакцины против гомологичного штамма. Наибольшей иммуногенностью обладали экспериментальные комплексные препараты (прирост титров антител в сравнении с вакциной без адъюванта в 48 — 96 раз). Высокая иммуногенность отмечалась для адъювантов на основе хитозана. Не все адъюванты существенно повышали иммуногенность, а в некоторых случаях при добавлении адъювантов отмечалось даже некоторое снижение титров антител. Заключение. Наиболее перспективны исследования и разработка препаратов на основе хитозана с учетом проблем характеристики и стандартизации, а также комплексных адъювантов как многокомпонентных, так и эмульсионных, которые могут стать основой вакцин следующего поколения против гриппа и других актуальных инфекционных агентов человека и животных.
Журн. микробиол., 2015, № 6, С. 63—71
Ключевые слова: грипп, инактивированные вакцины, иммуногенность, адъюванты, иммуно-адъюванты, хитозан
M.I.Chernikova, O.S.Kashirina, Yu.M.Vasiliev
COMPARATIVE IMMUNOGENICITY STUDIES OF ADJUVANTS FROM VARIOUS SOURCES AND WITH DIFFERENT MECHANISMS OF ACTION FOR INACTIVATED INFLUENZA VACCINES
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia
Aim. Direct immunogenicity comparison of adjuvants from various sources and with different mechanisms of action for inactivated influenza vaccines. Materials and methods. Groups of mice were immunized intramuscularly twice with an inactivated whole-virion influenza vaccine based on A/ California/07/2009 X-179A (H1N1) strain. The following adjuvants were added to the vaccine (10 in total): aluminium hydroxide, oligonucleotide CpG, complete Freund's adjuvant, poly(lactide-co-glycolide) microparticles, monophosphoryl lipid A and polyoxidonium, as well as 2 adjuvants based on characterized chitosan substances with different physical/chemical properties and 2 experimental complex formulations (a multi-component adjuvant and an oil-in-water emulsion based on squalene and tocopherol). Immunogenicity was determined by HAI and MN (MDCK) sera antibodies. Results. Different adjuvants increased immunogenicity of the vaccine against the homologous strain in varying patterns. Experimental complex formulations were the most immunogenic (antibody titer increase reached 48 — 96 times compared with unadjuvanted vaccines). Chitosan based adjuvants showed high immunogenicity. Not all the adjuvants significantly increased immunogenicity, and in some cases even an immunogenicity decrease was noted with the addition of certain adjuvants. Conclusion. Research and development of chitosan based adjuvants with characterization and standardization issues addressed, as well as complex adjuvants, both multi-component and emulsion based, are the most promising approaches that could lead to next generation vaccines against influenza and other human and animal infectious diseases.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 6, P. 63—71
Key words: influenza, inactivated vaccines, immunogenicity, adjuvants, immunoadjuvants, chitosan ВВЕДЕНИЕ
Грипп является весьма распространенной респираторной инфекцией и одной из наиболее актуальных проблем современного здравоохранения. Сезонные эпидемии гриппа характеризуются большим количеством осложнений, в том числе с летальным исходом, особенно в группах повышенного риска. Кроме того, эпидемии гриппа наносят огромный экономический ущерб, а вирус сохраняет высокий пандемический потенциал [12, 13].
Наиболее эффективной мерой в борьбе с гриппом является своевременная вакци-нопрофилактика [14, 15, 17]. Проблемы профилактики и терапии гриппа с помощью специфических противовирусных препаратов, в особенности появление резистентных к ним штаммов, а также безопасность при массовом применении, прежде всего среди детей [3], лишь подчеркивают актуальность именно вакцинопрофилактики как адекватного подхода для контроля этой инфекции [4].
Основа профилактики гриппа в настоящее время — инактивированные вакцины, вводимые внутримышечно (подкожно) [4, 15, 17]. Живые аттенуированные вакцины против гриппа на основе холодоадаптированных штаммов также разрешены к применению у людей в некоторых регионах, однако ряд вопросов в отношении эффективности и безопасности этих вакцин, в частности, механизмов действия, роли пути введения (интраназаль-ный), остается до конца не выясненным [6].
Наиболее широко применяемые инактивированные вакцины против гриппа (субъединичные и расщепленные) также не лишены ряда ограничений [2, 4, 15, 17]. Прежде всего, это недостаточная эффективность и иммуногенность при вакцинации некоторых попу-ляционных групп, в особенности групп риска, а также против антигенно отличных от вакцинных штаммов (дрейфовые и гетерологичные). Сложная многоэтапная технология (в частности, стадии инактивации и глубокой очистки) обусловливает высокую стоимость производства, затруднения с масштабированием, особенно в случае возникновении пандемии. Кроме того, в настоящее время мощности всех производителей вакцин против гриппа недостаточно даже для реализации массовой профилактики сезонных эпидемий гриппа в полном объеме.
Одно из наиболее перспективных направлений совершенствования вакцин против гриппа — добавление адъювантов (иммуноадъювантов) [2, 4]. За счет введения в состав вакцины против гриппа адъюванта повышается эффективность и иммуногенность, в том числе против широкого набора антигенно отличных штаммов. Кроме того, появляется возможность использовать простые (однократные) схемы иммунизации и сниженные дозы антигена при сохранении достаточной эффективности (иммуногенности), и при той же мощности производства иммунизировать большее количество людей.
Следует однако отметить, что высоко эффективные и иммуногенные адъюванты, как правило, также весьма реактогенны. В особенности, часто отмечаются местные реакции, имеются данные и о системных побочных эффектах, в том числе тяжелых. Безопасные же адъюванты очень часто оказываются недостаточно эффективными [3, 4]. Другими словами, в настоящее время неизвестны адъюванты для вакцин против гриппа и других актуальных инфекционных агентов человека и животных, оптимально сочетающие эффективность (иммуногенность), безопасность (низкую реактогенность), а также доступность с экономической точки зрения.
Весьма перспективными для объективного выбора оптимального из имеющихся, а также научно обоснованного поиска принципиально новых эффективных и безопасных адъювантов для вакцин против гриппа являются данные прямых сравнительных исследований. Однако количество таких исследований, особенно с учетом научно методического уровня (определение иммуногенности в соответствии с материалами ВОЗ; сравнение адъювантов всех основных групп по природе и механизму действия — в идеале более 3: минеральные соли и основания, эмульсии и иммуномодуляторы), весьма ограничено.
В одном из таких исследований при внутримышечной иммунизации мышей на модели трехвалентной субъединичной вакцины против гриппа сравнивали 5 адъювантов: MF59 (эмульсия по типу масло в воде, м/в), гидроксид алюминия, олигонуклеотид CpG, небольшую молекулу R848 (resiquimod) и липопептид Pam3CSK4. Последние 3 адъюванта
— иммуномодуляторы (TLR9, TLR7/8 и TLR2 агонисты, соответственно) [8]. Следует отметить исследование, в котором на модели субъединичной культуральной (MDCK) трехвалентной вакцины против гриппа при внутримышечной иммунизации мышей также сравнивали 5 адъювантов: гидроксид алюминия, фосфат кальция, MF59, PLG и CpG [11].
Таким образом, представляет интерес проведение прямых сравнительных исследований большой группы адъювантов, различных по природе и механизму действия, включающей несколько представителей (классические и инновационные) каждой из групп на модели инактивированных цельновирионных моновалентных вакцин против гриппа при внутримышечной иммунизации мышей. В качестве адъювантов также целесообразно включить препараты на основе хитозана, однако с учетом проблем характеристики и стандартизации как исходной субстанции, так и собственно адъюванта, которые в этой области стоят крайне остро и даже не позволяют сделать объективное заключение об адъювантных свойствах хитозана [10]. Основной подход сравнения — иммуногенность по титрам сывороточных антител в реакции задержки (торможения) гемагглютинации (РЗГА), что полностью соответствует материалам ВОЗ [15], а также нейтрализации (РН).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Все использованные методики основаны на материалах ВОЗ и действующей нормативно-технической документации [1, 7, 16].
В работе использовали группы по 10 нелинейных мышей: беспородные самки весом 14
— 16 г (на момент первой иммунизации); (филиал «Андреевка», Московская область); 9-дневные куриные эмбрионы (ППЗ «Птичное», Московская область). Получение суспензии эритроцитов кур проводили после инкубации 9-дневных куриных эмбрионов при 34°С в течение 3 — 4 дней (до возраста 12 — 13 дней).
В работе использовали очищенные и концентрированные вирусы гриппа A/ California/07/2009 X-179A (H1N1). Маточный материал (неочищенный) получен из отдела вирусологии НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова.
Для получения вакцин и определения иммуногенности вирусы пассировали на куриных эмбрионах 48 часов при 36°C. Затем очищали и концентрировали поэтапным центрифугированием: 10 минут при 2000 g, 30 минут при 5000 g и 30 минут при 35 000 g (последний этап повторяли не менее 3 раз). Ресуспендирование проводили в стерильном фосфатно-солевом растворе (ФСР). После накопления вирусы контролировали на стерильность с помощью тиогликолевой среды (ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск, Московская область), а также на биологическую активность. Дальнейшую работу проводили только с теми партиями вирусных препаратов, которые были стерильны и удовлетворяли требованиям по биологической активности. Вирусы контролировали по гемагглютинирующей (реакция гемагглютинации с эритроцитами кур; ГАЕ/0,05 мл) и инфекционной (титрование в куриных эмбрионах, инкубация 48 часов при 36°C; ЭИД50/0,1 мл) активности.
Из партии очищенного и концентрированного стерильного вирусного препарата готовили инактивированную эмбриональную цельновирионную вакцину. Инактивацию проводили 0,05% формальдегидом (2 часа при 36°C). Оптимальный режим инактивации (полная инактивация с учетом сохранения гемагглютинирующей активности) выбирали на основе данных о динамике инактивации для полученной партии очищенного и концентрированного вирусного препарата. Удаление инактивирующего агента проводили центрифугированием (30 минут при 35 000 g), формальдегид удаляли вместе с супер-натантом, а осадок антигена ресуспендировали в ФСР. Инактивированную цельнови-рионную вакцину проверяли на полноту инактивации (в куриных эмбрионах), биологическую активность (гемагглютинация), а также стерильность.
К вакцинам добавляли ряд адъювантов (10 препаратов в сумме) различной природы и механизма действия (табл. 1).
Адъюванты (при необходимости маточные растворы) готовили таким образом, чтобы при добавлении к вакцине 1:1 по объему получить необходимую концентрацию (соотношения вакцины и адъювантов основаны на [5, 8, 10, 11]).
PLG готовили по [11].
В панель адъювантов также входили препараты на основе охарактеризованных субстанций хитозана с различными физико-химическими свойствами. С использованием хитозана высокой степени очистки (Sigma-Aldrich, США) — показатели, представленные
5. ЖМЭИ 6 № 16-2015
65
Таблица 1. Список адьювантов, использованных в работе
Адъювант Доза (на иммунизацию, на мышь) Производитель
Гидроксид алюминия 100 мкг Bгenntag ВюБейог, Дания
CpG ODN 1826 10 мкг Синтол, Москва
Полный адъювант Фрейнда (CFA) 1:1 Sigma-Aldгich, США
Поли(лактид-ко-гликолид) (PLG) 0,5% Sigma-Aldгich, США
Монофосфорил липид А (MPL) 1 мкг Sigma-Aldгich, США
Полиоксидоний 50 мкг Петровакс Фарм, Москва
Глутамат хитозана (Mv 110-150 кДа, СД >60%), GMP 0,5% Sigma-Aldгich, США
Лактат олигохитозана (Mn 4-6 кДа, СД >90%) 0,5% Sigma-Aldгich, США
М/в эмульсия 1:1 НИИВС, Москва
Многокомпонентный препарат 1:1 НИИВС, Москва
Примечание. 1:1 — по объему (адъювант к вакцине); 0,5% — концентрация в вакцине после добавления адъюванта; CFA — в/м эмульсия на основе парафинового масла, маннида моноолеата и инак-тивированных микобактерий; Mv, Mn — молекулярная масса, средневязкостная и среднечисловая, соответственно; СД — степень деацетилирования; эмульсия м/в на основе сквалена и токоферола и многокомпонентный препарат — экспериментальные комплексные адъюванты НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова.
поставщиком, обобщены в табл. 2, и глутами-новой кислоты (Sigma-Aldrich, США) готовили 1,0% (по хитозану и кислоте) раствор при рН 5,01 (конечная концентрация в вакцине 0,5%). Кроме того, использовали лактат оли-гохитозана (Sigma-Aldrich, США), на основе которого готовили 1,0% (по лактату хитозана, который содержит 60% хитозана) раствор при рН 5,01 (конечная концентрация в вакцине 0,5%). рН доводили с использованием 1 Н гидроксида натрия (Sigma-Aldrich, США). Адъюванты на основе хитозана стерилизовали автоклавированием при указанных выше условиях. В качестве контроля использовали ФСР (вакцина без адъюванта), а также группы неиммунизированных мышей той же партии.
Группы мышей иммунизировали двукратно с интервалом 14 дней внутримышечно в заднюю конечность в объеме 0,2 мл; по 0,1 мл адъюванта (контроля) и вакцины. Отбор крови осуществляли под полным эфирным наркозом через 14 дней после второй иммунизации. После первой и второй иммунизации учитывали падеж животных, а также реакции в месте иммунизации. Обработку и анализ сывороток проводили одновременно. Сыворотки после получения и очистки центрифугированием (1000 g, 10 мин) разводили в ФСР 1:10 и прогревали на водяной бане при 56° С в течение 30 минут. Азид натрия к сывороткам не добавляли.
Иммуногенность определяли по РЗГА с использованием суспензии эритроцитов кур, а также РН (микрометод) с использованием перевиваемой линии культуры клеток MDCK. Сертифицированная культура клеток получена из банка НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова. Реакцию ставили против очищенных и концентрированных вакцинных вирусов, используя препараты той же партии, что и для изготовления вакцины. РЗГА и РН ставили не менее чем в 4 повторах при рабочей дозе вируса 8 ГАЕ/0,05 мл и 100 ЦПД50/0,1 мл, соответственно. Минимальный определяемый титр (предел чувствительности) составил 1:5 для обоих методов.
Статистическую обработку проводили с использованием SPSS (IBM, США).
Таблица 2. Характеристики хитозана высокой степени очистки
Категория
Источник получения
GMP
Белый гриб Agaricus bisporus 110—150 кДа 5—200 МПа*с
Молекулярная масса (Му) Динамическая вязкость
Степень деацетилирования >60%
Хитозан >93%
Эндотоксины <10 ЕД/г
Белок <1%
в-глюкан <5%
Примечание. Му — средневязкостная молекулярная масса, с использованием которой готовили глутамат хитозана.
Показатель
Значение
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
На протяжении всех серий экспериментов падежа животных, а также местных реакций после иммунизации ни в одной группе не наблюдалось.
В первой серии экспериментов определяли иммуногенность (титры сывороточных антител по РЗГА) инактивированной вакцины при добавлении различных адъювантов после двукратной внутримышечной иммунизации мышей.
Различные адъюванты неодинаково повышают иммуногенность против вакцинного штамма по РЗГА (рис. 1). Наиболее имму-ногенным оказался многокомпонентный препарат, повышение титров антител в сравнении с вакциной без адъюванта в 96 раз. Высокая иммуногенность отмечалась для лактата олигохитозана и м/в эмульсии, повышение титров антител в сравнении с вакциной без адъюванта в 80 и 64 раза, соответственно. Существенное повышение им-муногенности в сравнении с вакциной без адъюванта отмечалось и для глутамата хито-зана (повышение титров антител в 28 раз).
Хотя для некоторых адъювантов (CFA, PLG) также наблюдалось существенное повышение иммуногенности в сравнении с вакциной без адъюванта (прирост титров антител в 7 — 12 раз), средние титры были сравнимы или даже меньше, чем пороговое значение 1:40.
Иммуногенность вакцины без адъюванта (ФСР) была минимальна, титры антител не отличалась существенно от таковых в контрольной группе неиммунизированных мышей той же партии. Добавление гидроксида алюминия, полиоксидония, MPL и CpG не оказывало существенного влияния на иммуногенность.
Во второй серии экспериментов определяли иммуногенность: титры сывороточных антител по РН (MDCK) инактивированной вакцины при добавлении различных адъю-вантов после двукратной внутримышечной иммунизации мышей.
По РН различные адъюванты также неодинаково повышают иммуногенность против вакцинного штамма (рис. 2). Наиболее иммуногенной оказалась м/в эмульсия, повышение титров антител в сравнении с вакциной без адъюванта в 48 раз. Высокая иммуноген-ность отмечалась для многокомпонентного препарата и лактата олигохитозана, повышение титров антител в сравнении с вакциной без адъюванта в 40 и 32 раза, соответственно. Существенное повышение им-муногенности в сравнении с вакциной без адъюванта отмечалось для глутамата хитоза-на и PLG (прирост титров антител в 8 раз), а также гидроксида алюминия и CpG (прирост титров антител в 4 раза). При этом для гидроксида алюминия и CpG средние титры сывороточных антител достигают 1:40.
Хотя для некоторых адъювантов (CFA, MPL) также наблюдалось повышение имму-ногенности в сравнении с вакциной без адъюванта (прирост титров антител в 2 раза), средние титры были меньше чем 1:40.
Рис. 1. Иммуногенность инактивированной вакцины по РЗГА с сыворотками (сыворотки прогреты) при добавлении различных адъювантов против вакцинного вируса, 95% О; горизонтальная линия — титр в группе неиммунизированных мышей той же партии.
Здесь и на рис. 2: по оси абсцисс — адью-ванты: 1 — ФСР, 2 — гидроксид алюминия, 3 — CpG, 4 — CFA, 5 — PLG, 6 — МР^ 7
— полиоксидоний, 8 — глутамат хитозана, 9
— лактат олигохитозана, 10 — м/в эмульсия, 11 — многокомпонентный препарат.
Рис. 2. Иммуногенность инактивированной вакцины по РН (MDCK) с сыворотками (сыворотки прогреты) при добавлении различных адъювантов против вакцинного вируса, 95% О; горизонтальная линия — титр в группе неиммунизированных мышей той же партии.
Иммуногенность вакцины без адъюванта (ФСР) была минимальна, средние титры антител не превышали 1:10. При добавлении полиоксидония иммуногенность не просто не повышалась, а даже снижалась в сравнении с вакциной без адъюванта.
ОБСУЖДЕНИ Е
Одно из наиболее перспективных направлений совершенствования вакцинопрофилак-тики гриппа с использованием как инактивированных, так и живых аттенуированных вакцин — введение в их состав адъювантов [2, 4, 6]. Добавление адъювантов к вакцинам против гриппа позволяет повысить иммуногенность против как гомологичного, так и гетерологичных штаммов, а также упростить стратегию и тактику вакцинопрофилактики. Достаточная иммуногенность при меньшей дозе гемагглютинина и после однократной иммунизации, а также возможность индукции перекрестного иммунитета против широкого набора антигенно отличных штаммов крайне важны при подготовке к возможной пандемии.
В то же время, имеющиеся адъюванты для вакцин против гриппа и других актуальных инфекционных агентов человека и животных, в целом, обладают неоптимальным сочетанием эффективности и безопасности: большинство адъювантов либо недостаточно иммуногенны, либо при достаточной иммуногенности весьма реактогенны [2, 4].
К настоящему времени опубликовано некоторое количество прямых сравнительных исследований 2 и более адъювантов [8, 11], в том числе клинических [5, 18]. Однако далеко не во всех из них представлены данные по основному способу оценки эффективности вакцин против гриппа — через иммуногенность (титры сывороточных антител по РЗГА). В соответствии с материалами ВОЗ иммуногенность коррелирует с защитной эффективностью, причем титр антител по РЗГА 1:40 определяет 50% защиту от инфекции [15]. Представление об иммуногенности (по титрам сывороточных антител в РЗГА) как суррогатном показателе эффективности строится на данных классических исследований, в том числе с контролируемой инфекцией добровольцев [9].
Кроме того, для решения проблем вакцинопрофилактики необходимы данные прямых сравнительных исследований адъювантов различных групп по природе и механизму действия. Можно выделить 3 основные группы адъювантов: минеральные соли и основания (типовой представитель — гидроксид алюминия), эмульсии (типовой представитель — CFA — эмульсия по типу вода в масле, в/м); современные эмульсии (м/в) — MF59, AS03 и иммуномодуляторы прямого действия (например, агонисты TLR). MF59 и AS03 — м/в эмульсии на основе сквалена и сквалена с токоферолом, соответственно [8, 11]. В связи с этим, для научно обоснованной разработки новых адъювантов необходимы данные по прямому сравнению адъювантов всех основных групп (минимальное количество — 3 в сумме), при этом целесообразно включать по несколько представителей от каждой группы (6 и более адъювантов в сумме).
Таким образом, с учетом научно-методического уровня (определение иммуногенности по РЗГА, включение адъювантов всех основных групп) прямых сравнительных исследований остается всего несколько. Нам удалось выявить лишь 2 таких исследования [8, 11].
Что касается прямых сравнительных исследований адъювантов внутри группы по природе и механизму действия (например, различных минеральных солей и оснований), то даже наиболее перспективный кандидат определенной группы может уступать представителям других групп (в частности, м/в эмульсиям). С другой стороны, такие данные незаменимы при разработке комплексных адъювантов нового поколения, прежде всего, для выбора наиболее перспективных индивидуальных компонентов, относящихся к принципиально различным группам, а также для оптимизации выбранных кандидатов. Следует также отметить, что в работе [11] добавление CpG к MF59 привело к еще большему увеличению иммуногенности.
Таким образом, в наших исследованиях впервые было проведено прямое сравнение 10 адъювантов, различающихся по природе и механизму действия. Панель адъювантов для сравнения также включала 2 экспериментальных адъюванта НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, находящихся на различных этапах доклинических исследований — инновационные комплексные препараты (многокомпонентный адъювант и м/в эмульсию на основе сквалена и токоферола). Необходимо подчеркнуть, что экспериментальный многокомпонентный препарат — принципиально новый адъювант следующего поколения
и не имеет аналогов, а экспериментальная м/в эмульсия — существенно доработанный аналог применяемых в настоящее время м/в эмульсий (MF59, АБ03) со значительно сниженной реактогенностью.
Как отмечалось выше, перспективное направление исследований и разработок адъю-вантов — препараты на основе хитозана. Однако прогресс в этом направлении затруднен проблемами с характеристикой и воспроизводимостью. Так, в подавляющем большинстве исследований характеристики хитозана, источник получения, методика приготовления либо указаны неполностью, либо вообще отсутствуют, то есть проведенные работы невос-производимы [10]. Объективная оценка адъювантных свойств препаратов на основе хитозана в сложившейся ситуации невозможна.
В наших исследованиях впервые проведены сравнительные исследования адъювантов на основе охарактеризованных субстанций хитозана с различными физико-химическими свойствами, полученных из открытых источников, с полным указанием методики приготовления и стерилизации. Дизайн экспериментов позволяет не только объективно оценить перспективы препаратов на основе хитозана в сравнении с адъювантами других групп по природе и механизму действия, но также решить вопрос об адъювантом действии препаратов на основе хитозана и роли физико-химических параметров в реализации этого эффекта.
Совокупность полученных данных показывает, что различные адъюванты в составе инактивированной цельновирионной вакцины против гриппа неодинаково повышают иммуногенность против гомологичного штамма после двукратной внутримышечной иммунизации мышей. Наибольшей иммуногенностью обладают экспериментальные комплексные препараты (многокомпонентный адъювант и м/в эмульсия), а также лактат олигохитозана. Прирост титров антител (по средним значениям) в сравнении с вакциной без адъюванта (ФСР) был в ряде случаев в 48 — 96 раз. Можно отметить также достаточно высокую иммуногенность глутамата хитозана.
Кроме того, далеко не все адъюванты существенно повышали иммуногенность (в сравнении с вакциной без адъюванта), а в некоторых случаях отмечалось даже некоторое снижение титров антител при добавлении адъювантов.
Что касается выбора инактивированной цельновирионной моновалентной вакцины как модели экспериментов, то он обусловлен антигенными особенностями (новизной) штамма [12, 13], наибольшей иммуногенностью цельновирионных в сравнении с расщепленными и субъединичными вакцинами [4], а также возможностью использования всего комплекса антигенов вируса гриппа. Необходимо подчеркнуть, что хотя в наших экспериментах иммуногенность вакцины без адъюванта (ФСР) у мышей была весьма низкой, добавление различных адъювантов неодинаково повышало титры антител, причем эти различия четко прослеживаются в большинстве случаев. Тем не менее, перспективные адъюванты также целесообразно изучать и в составе других типов вакцин против гриппа, причем как инактивированных, так и живых аттенуированных, а также против других актуальных инфекционных агентов человека и животных.
В нашем исследовании оценка иммуногенности проводилась не только по титрам сывороточных антител в РЗГА, что показывает лишь уровень факторов, задерживающих гемагглютинацию, но также по РН. В этой реакции уровень антител оценивается по модельной, но продуктивной инфекции перевиваемой линии культуры клеток MDCK. В целом, результаты по РЗГА и РН оказались аналогичны, в частности, наиболее иммуно-генные адъюванты остаются таковыми вне зависимости от метода оценки. В большинстве случаев, в том числе для вакцины без адъюванта, титры по РН были несколько выше, чем по РЗГА. Пороговое значение титров антител по РН на уровне ВОЗ не установлено, по аналогии с 1:40 для РЗГА [15].
Таким образом, среди адъювантов-монопрепаратов наиболее перспективны адъюван-ты на основе хитозана. Кроме того, очевидны перспективы и потенциал комплексных препаратов, причем как многокомпонентных, так и м/в эмульсий. Необходимо также подчеркнуть, что в соответствии с полученными нами данными ни один из перспективных адъювантов как комплексных, так и на основе хитозана не был реактогенен.
Полученные нами данные по сравнительной оценке адъювантов различной природы и механизма действия согласовываются с опубликованными результатами. Так, перспективы м/в эмульсий (MF59) отмечались в других прямых сравнительных исследованиях адекватного научно-методического уровня [8, 11]. С учетом эффекта снижения дозы по
результатам клинического исследования, проведенного в Российской Федерации, предпочтение отдали гидроксиду алюминия в сравнении с полиоксидонием [5]. В мета-анализе и систематическом обзоре клинических исследований вакцин против гриппа свиного происхождения H1N1 2009 г. (16 статей, почти 18 000 добровольцев) делается заключение о превосходстве вакцин без адъюванта и вакцин с эмульсиями по типу м/в (MF59, AS03) над вакцинам с адъювантами на основе алюминия [18]. Следует однако отметить, что хотя основной критерий оценки — уровень сывороточных антител по РЗГА (серозащита), прямое сравнение адъювантов в этой работе не являлось обязательным для включения.
Особого внимания заслуживает обсуждение полученных результатов по иммуногенности адъювантов на основе хитозана. Как отмечалось выше, дизайн наших экспериментов учитывает системные проблемы научных исследований адъювантов на основе хитозана [10]. Нами впервые получены объективные данные, которые позволяют научно обоснованно говорить о потенциале и реальных перспективах адъювантов на основе хитозана. Препараты на основе охарактеризованных субстанций хитозана (лактат олигохи-тозана и глутамат хитозана) обладают весьма мощным адъювантным действием. Их им-муногенность не просто очень высока, но в ряде случаев (особенно для лактата олигохитозана, в использованном препарате которого содержание хитозана меньше, чем в глутамате хитозана) превышает таковую для всех исследованных адъювантов-монопрепаратов. Кроме того, полученные данные показывают, что параметры адъювантов на основе хитозана, прежде всего физико-химические свойства субстанции (молекулярная масса), а также противоион (глутамат, лактат), оказывают существенное влияние на адъювантные свойства. Как следствие, наши исследования являются объективным фундаментом для дальнейших исследований и разработки адъювантов на основе хитозана для эффективных и безопасных вакцин против актуальных инфекционных агентов человека и животных. На следующих этапах научных исследований в этом направлении целесообразно изучить в сравнении широкий набор адъювантов на основе хитозана с различными диапазонами физико-химических свойств, прежде всего молекулярной массы и степени деацетилирования. Также представляет несомненный интерес гармонизация методов оценки базовых параметров хитозана, а также независимая экспертиза соответствия заявленных основными поставщиками характеристик.
Необходимо подчеркнуть, что в исследования включен адъювант на основе полностью охарактеризованной субстанции хитозана уровня чистоты GMP. Стандартизацию проводили также по специфическим и неспецифическим примесям, в том числе уровню эндотоксинов, белка, ß-глюканов. На основе этой субстанции готовили глутамат хитозана. Впервые полученные нами данные доказывают, что адъювантное действие связано именно с иммунобиологической активностью хитозана, а не посторонних примесей, которые могут обладать таким эффектом (прежде всего, эндотоксины).
В завершении отметим, что даже в среднесрочной перспективе вряд ли удастся разработать идеальный со всех точек зрения адъювант, однако представить первые прототипы в ближайшее десятилетие вполне возможно, а полученные нами результаты незаменимы для такой работы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. СП 1.3.2322-08. 2008.
2. Васильев Ю.М. Адъюванты гриппозных вакцин — современное состояние. Журн. микро-биол. 2010, 1: 100-110.
3. Васильев Ю.М. Ингибиторы нейраминидазы для специфической профилактики и терапии гриппозной инфекции. Врач. 2014, 2: 17-19.
4. Васильев Ю.М. Направления совершенствования вакцин против гриппа. Врач. 2014, 8: 1214.
5. Зверев В.В. Катлинский А.В., Костинов М.П. и др. Результаты сравнительного клинического исследования вакцин против вируса гриппа птиц. Журн. микробиол. 2007, 3: 10-16.
6. Каширина О.С., Васильев Ю.М. Живые аттенуированные и инактивированные гриппозные вакцины: данные прямых сравнительных исследований. Журн. микробиол. 2014, 1: 103119.
7. Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа. МУ 3.3.2.175803, 2003.
8. Caproni E., Tritto E., Cortese M. et al. MF59 and Pam3CSK4 boost adaptive responses to influenza subunit vaccine through an IFN type I-independent mechanism of action. J. Immunol. 2012, 188 (7): 3088-3098.
9. Potter C., Oxford J. Determinants of immunity to influenza infection in man. Br. Med. Bull. 1979, 35 (1): 69-75.
10. Vasiliev Y Chitosan-based vaccine adjuvants: incomplete characterization complicates preclinical and clinical evaluation. Expert Rev. Vaccines. 2015, 14 (1): 37-53.
11. Wack A., Baudner B., Hilbert A. et al. Combination adjuvants for the induction of potent, long-lasting antibody and T-cell responses to influenza vaccine in mice. Vaccine. 2008, 26 (4): 552561.
12. WHO. Antigenic and genetic characteristics of zoonotic influenza viruses and development of candidate vaccine viruses for pandemic preparedness. WER. 2013, 88 (42): 449-463.
13. WHO. Human cases of influenza at the human-animal interface, 2013. WER. 2014, 89 (28): 309320.
14. WHO. Influenza vaccines: WHO position paper. WER. 2005, 80 (33): 279-287.
15. WHO. Vaccines against influenza: WHO position paper — November 2012. WER. 2012, 87 (47): 461-467.
16. WHO. WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. 2002.
17. Wright P., Neumann G., Kawaoka Y. Orthomyxoviruses. In: Knipe D., Howley P. (eds.). Fields Virology. Lippincott Williams & Wilkins, 2013.
18. Yin J., Khandaker G., Rashid H. et al. Immunogenicity and safety ofpandemic influenza A (H1N1) 2009 vaccine: systematic review and meta-analysis. Influenza Other Respir. Viruses. 2011, 5 (5): 299-305.
Поступила 17.02.15
Контактная информация: Васильев Юрий Михайлович, к.б.н.,
105064, Москва, М. Казенный пер., 5а, р.т. (495)917-49-00
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
К.Р.Дудина1, М.М.Кутателадзе1, Н.О.Бокова1, О.О.Знойко1, Д.Д.Абрамов3, Е.И.Келли2, Н.Д.Ющук1
АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ БЕЛКОВ СУРФАКТАНТА У БОЛЬНЫХ ГРИППОМ
Московский государственный медико-стоматологический университет, 2Инфекционная клиническая больница № 1, 3ГНЦ Институт иммунологии, Москва
Цель. Оценка роли полиморфизмов генов белков сурфактанта в восприимчивости и тяжести течения гриппозной инфекции у представителей московской популяции. Материалы и методы. В исследование включены 320 больных гриппом, инфицированных различными штаммами вируса гриппа, и 115 здоровых лиц (контрольная группа). Генотипирование образцов ДНК человека для определения полиморфизмов ге1965708 и ге1059046 гена 8БТРА2, ге1130866 гена 8БТРБ проведено с помощью модифицированного метода «примыкающих проб». Результаты. Большинство лиц контрольной группы и больных гриппом являются носителями аллелей и генотипов ге1965708 и ге1059046 гена 8БТРА2, ге1130866 гена 8КГРБ, которые по данным научной литературы показали ассоциацию с тяжелым течением гриппа А(H1N1)pdm09 и другими воспалительными заболеваниями респираторного тракта. В целом, у больных гриппом по сравнению с лицами группы контроля не выявлено достоверных различий в частоте выявления неблагоприятных генотипов СС ге1965708, АА ге1059046 гена 8БТРА2 и СС ге1130866 гена 8БТРБ, что свидетельствует о высокой (от 19 до 51%) распространенности этих генотипов в исследуемой популяции. Аллель С и генотип СС ге1965708 гена 8КГРА2, аллель А и генотип АА ге1059046 гена 8БТРА2, аллель С и генотип СС ге1130866 гена 8БТРБ не показали ассоциацию с тяжелым течением гриппа А(H1N1)pdm09. У большинства (88%) больных тяжелой формой гриппа А(H1N1)pdm09 регистрировалась сопутствующая патология: заболевания сердечно-сосудистой (44%), эндокринной (36%) и дыхательной (12%) систем. Заключение. Поскольку у большинства умерших пациентов от тяжелого течения гриппа А(H1N1)pdm09 были выявлены заболевания сердечно-сосудистой, дыхательной и эндокринной систем, а
