Сравнительное исследование влияния веществ с 14 и с 16, обладающих антибактериальным и фунгицидным действием, на клеточную проницаемость у лиц разных квартилей Na +-Li +-противотранспорта

Орлова Ольга Валериановна; Ослопов Владимир Николаевич; Сидуллина Светлана Анатольевна

РИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ВЕЩЕСТВ С14 И С16, ОБЛАДАЮЩИХ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ И ФУНГИЦИДНЫМ ДЕЙСТВИЕМ, НА КЛЕТОЧНУЮ ПРОНИЦАЕМОСТЬ У ЛИЦ РАЗНЫХ КВАРТИЛЕЙ NA-LI-ПРОТИВОТРАНСПОРТА

ОЛЬГА ВАЛЕРИАНОВНА ОРЛОВА, аспирант кафедры фармации ФПК и ППС ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России, тел. 8-960-043-43-34, e-mail: [email protected]

ВЛАДИМИР НИКОЛАЕВИЧ ОСЛОПОВ, докт. мед. наук, профессор, зав. кафедрой пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России, тел. 8-905-316-25-35, e-mail: [email protected]

СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА СИДУЛЛИНА, канд. фарм. наук, доцент кафедры фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химий ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России, тел. 8-927-441-94-66, e-mail: [email protected]

Реферат. Цель исследования - сравнительное изучение влияния новых биологически активных веществ С14 (трифенилтетрадецилфосфония бромида) и С16 (трибутилгексадецилфосфония бромида) на проницаемость мембран клеток по Na+ путем определения скорости Na+-Li+-противотранспорта в мембране эритроцита с позиции различного ее исходного состояния. На основе полученных данных будет проводиться выбор биологически активного вещества для создания лекарственной формы с антибактериальным, фунгицидным действием, наиболее эффективной для индивидуумов I, III и IV квартилей скорости Na+-Li+-противотранспорта. Методы. Исследована кровь 15 здоровых добровольцев с различным квартильным распределением по скорости Na+-Li+-противотранспорта в мембране эритроцита: I квартиль (5 человек) - низкая проницаемость, III квартиль (5 человек) - умеренно высокая, IV квартиль (5 человек) - высокая проницаемость. Результаты. На исследуемых, принадлежащих к I квартилю скорости Na+-Li+-противотранспорта, С14 не оказывает влияния на проницаемость мембран эритроцитов по Na+, а при введении С16 в концентрациях 0,001 и 0,005 мкМ отмечено повышение проницаемости по Na+; у лиц III квартиля скорости Na+-Li+-противотранспорта С14 и С16 в дозах 0,001 и 0,005 мкМ увеличивают проницаемость мембран эритроцитов по Na+. У исследуемых, принадлежащих к IV квартилю скорости Na+-Li+-противотранспорта, биологически активное вещество С14 в дозе 0,05 мкМ уменьшает проницаемость мембран эритроцитов, у биологически активного вещества С16 в концентрациях 0,001 и 0,005 мкМ отмечено повышение проницаемости по Na+. Это свидетельствует о том, что более эффективным в качестве лекарственного вещества будет вещество С16. Вывод. Изменение проницаемости клеточной мембраны по натрию под влиянием веществ С14 и С16 зависит от исходного генетически детерминированного состояния клеточной мембраны.

Ключевые слова: проницаемость мембран эритроцитов, трифенилтетрадецилфосфония бромид, трибутилгексадецилфосфония бромид, Na+-Li+-противотранспорт.

COMPARATIVE RESEARCH OF INFLUENCE OF SUBSTANCES OF C14 AND C16 POSSESSING ANTIBACTERIAL AND FUNGICIDE ACTION ON CELLULAR PERMEABILITY AT PERSONS OF DIFFERENT QUARTILES OF NA-LI- COUNTERTRANSPORT

OLGA V. ORLOVA, VLADIMIR N. OSLOPOV, SVETLANA A. SIDULLINA

Abstract. Research objective - comparative studying of influence new biologically active substances of C14 (triphenyltetradecylphosphonium bromide) and C16 (tributilgeksadecylphosphonium bromide) on permeability of membranes of cages on Na+ by determination of speed of Na+-Li+-countertransport in an erythrocyte membrane from a position of its various initial condition. On the basis of the obtained data biologically active agent choice for creation of a medicinal form with antibacterial, fungicide action, the most effective for individuals of I, III and IV quartiles of speed of Na+-Li+-countertransport will be carried out. Methods. Blood of 15 healthy volunteers with various quartile distribution of speed of Na+-Li+-countertransport in an erythrocyte membrane is investigated: The I quartile (5 people) - low permeability, the III quartile (5 people) - moderately high, the IV quartile (5 people) - high permeability. Results. On investigated, belonging to the I quartile of speed of Na+-Li+-countertransport, С14 has no impact on permeability of membranes of erythrocytes on Na+, and at C16 introduction in concentration of 0,001 and 0,005 |jM permeability increase on Na+ is noted; faces of the III quartile have Na+-Li+-countertransport of C14 and C16 in doses of 0,001 and 0,005 jM increase

permeability of membranes of erythrocytes on Na+. At investigated, belonging to the IV quartile of speed of Na+-Li+-countertransport, biologically active agent C14 in a dose of 0,05 |jM reduces permeability of membranes of erythrocytes, at biologically active agent C16 in concentration of 0,001 and 0,005 jM permeability increase on Na+ is noted. It testifies that the substance C16 will be more effective as medicinal substance. Conclusions. Change of permeability of a cellular membrane on sodium under the influence of substances of C14 and C16 depends on the initial genetically determined condition of a cellular membrane.

Key words: erythrocyte membrane permeability, triphenyltetradecylphosphonium bromide, tributilgeksadecylphosphonium bromide, Na+-Li+-countertransport.

Актуальность. Биологически активные вещества (БАВ) С14 и С16 синтезированы на кафедре высокомолекулярных и элементоорганических соединений Химического института им. А.М. Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета. Их фармакологические свойства изучались на кафедре высокомолекулярных и элементоорганических соединений. Доказан антибактериальный, фунгицидный фармакологический эффект этих БАВ [1].

Один из факторов, определяющих биодоступность лекарственных форм, - это интенсивность высвобождения из них лекарственных веществ, которая является также одним из критериев выбора оптимального состава [2]. Кинетику высвобождения лекарственного вещества из лекарственных форм изучают методом равновесного диализа через полупроницаемую мембрану.

В настоящее время для изучения проницаемости стали активно использовать мембраны клеток крови. В клинической практике можно оценивать проницаемость клеточной мембраны по Na+, изучая так называемую облегченную диффузию Na+, осуществляемую белком-переносчиком, те. Na+-Li+-противотранспорт (№+^Р-ПТ) по методике М. Canessa et а1. [3]. Важно отметитить, что Na+-Li+-ПТ на 80% генетически детерминирован.

В.Н. Ослоповым [4, 5] были определены границы квартилей (КВ) популяционного (суммарно у мужчин и женщин) распределения величин скорости Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита [в микромолях Li на 1 л клеток [эритроцитов] в час (в мкМ Li)]: I КВ - 38-203,

II КВ - 204-271, III КВ - 272-345, IV КВ - 346-730. Условно считается, что величины скорости Na+-Li+-ПТ I КВ соответствуют низкой проницаемости по Na+, II КВ -средней, III КВ - умеренно высокой, IV КВ - высокой проницаемости по Na+.

Цель исследования - сравнительное изучение влияния новых БАВ С14 (трифенилтетра-децилфосфония бромида) и С16 (трибутилгексаде-цилфосфония бромида) на проницаемость мембран клеток по Na+ путем определения скорости Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита с позиции ее различного исходного генетического состояния. На основе полученных данных будет проводиться выбор БАВ для создания лекарственной формы с антибактериальным, фунгицидным и ранозаживляющим действием, наиболее эффективной для индивидуумов I, III и IV КВ скорости Na+-Li+-ПТ.

Материал и методы. Исследована кровь 15 здоровых добровольцев с различным квартиль-ным распределением величин скорости Na+-Li+-противотранспорта в мембране эритроцита: I квартиль (5 чел.) - низкая проницаемость, III квартиль (5 чел.) - умеренно высокая, IV квартиль (5 чел.) -высокая проницаемость. Ранее нами были подобраны параметры определения скорости Na+-Li+-ПТ

в мембране эритроцита применительно к задачам исследования и концентрации вещества для исследования in vitro* [6, 7].

Изучали влияние различных концентраций исследуемых веществ на скорость Na+-Li+-nT в мембране эритроцита in vitro. Определение скорости Na+-Li+-nT в мембране эритроцита (в микромолях лития на 1 л клеток в час) проводили по методу М. Canessa et al. [3], при котором изучали (путем определения концентрации ионов) обмен внутриклеточного лития в загруженных этим ионом клетках на внеклеточный натрий и магний из среды инкубации. Концентрацию лития регистрировали методом атомной абсорбционной спектрофотометрии в эмиссионном режиме (СА-455). Кровь в количестве 3 мл забирали из вены самотеком в пластиковые пробирки, смоченные гепарином (20 ЕД на 1 мл крови), содержимое перемешивали, пробирки помещали в контейнер с тающим льдом. Исследование состояло из следующих этапов: отделение эритроцитов, промывание эритроцитов, пред-инкубация (3 ч), промывание эритроцитов, инкубация (1 ч), определение концентрации лития, вычисление конечного результата.

Исследуемое вещество в различных концентрациях вносили в среду В (среда с Na+ при одночасовой инкубации). Исследования проводили со следующими концентрациями веществ: 0,001; 0,005; 0,01; 0,025 и

0,05 мкМ. Оценку влияния изучаемого вещества на проницаемость клеточных мембран по Na+ проводили путем подбора концентрации, которая не вызывала гемолиза эритроцитов (гемолиз определяли визуально). Средняя величина скорости Na+-Li+-nT у людей с I КВ составила (188±8) мкМ Li; у людей с III КВ - (337±5) мкМ Li; у людей с IV КВ - (568±5) мкМ Li (межквартильно, р<0,05).

Результаты и их обсуждение. Исследование вещества С14. Изменение скорости Na+-Li+-nT в мембране эритроцита под влиянием БАВ С14 зависит от исходной генетически детерминированной проницаемости мембраны. У исследуемых, принадлежащих к

III квартилю скорости Na+-Li+-nT (исходная проницаемость умеренно высокая), при внесение в среду БАВ С14 в концентрациях 0,001 и 0,005 мкМ отмечено повышение проницаемости по Na+. У исследуемых, принадлежащих к IV квартилю скорости Na+-Li+-nT, при внесение в среду БАВ С14 в концентрациях 0,001 и 0,005 мкМ это вещество не оказало влияния на проницаемость по Na+, в то же время при концентрации 0,05 мкМ проницаемость по Na+ уменьшилась (табл. 1, рис. 1, 2).

Tаким образом, у исследуемых, принадлежащих к I КВ скорости Na+-Li+-nT, С14 не оказывает влияния на проницаемость мембран эритроцитов по Na+.

* Заявка 2012101527. Российская Федерация, МПК G01N 33/50 «Способ оценки влияния лекарственных веществ на проницаемость клеточных мембран по натрию» (РФ). № 2012101527/15; заявл.16.01.2012; опубл. 10.06.2012. Бюл. № 16 (решение о выдаче патента от 20.05.2013 г.).

Т а б л и ц а 1

Влияние фармакологического БАВ С14 на скорость Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита (в мкМ Li, М±m) у индивидуумов I, III, IV квартилей скорости Na+-Li+-ПТ

№ квартиля Исходная величина скорости Na+-Li+-ПТ Концентрация вещества С14 в мкМ

0,001 0,005 0,010 0,025 0,05

I 188±8 204±12 205±6 177±9 194±4 193±2

III 337±5 430±27* 381±5* 359±7 355±8 343±7

IV 568±5 588±6 550±9 588±4 575±10 465±6*

" Достоверные различия с исходным значением скорости Na+-Li+-ПТ (р<0,05).

з-

о

о.

а.

со

0

X

ГО

о.

ю

0

г

о

о.

§

о

О IV квартиль • III квартиль □ I квартиль

Контроль 0,001 0,005 0,010 0,025 0,05

Концентрация синтезированного вещества С14 (в мкМ)

Рис. 1. Влияние БАВ С14 на скорость Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита у индивидуумов I, III, IV квартилей скорости Na+-Li+-ПТ

Т а б л и ц а 2

Влияние фармакологического БАВ С16 на скорость Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита (в мкМ Li, М±m) у индивидуумов I, III, IV квартилей скорости Na+-Li+-ПТ

№ квартиля Исходная величина Концентрация вещества С16 в мкМ

скорости Na+-Li+-ПТ 0,001 0,005 0,010 0,025 0,05

I 188±8 358±14* 298±6* 267±19 Гемолиз Гемолиз

III 337±5 443±39* 441±42* 369±20 Гемолиз Гемолиз

IV 568±5 668±6* 642±5* 563±1 Гемолиз Гемолиз

* Достоверные различия с исходным значением скорости Na+-Li+-ПТ (р<0,05).

З'

о

о.

го

щ

X

со

а.

ю

£

си

г

о

о.

о

Контроль 0,001 0,005 0,010 0,025 0,05

Концентрация синтезированного вещества С16 (в мкМ)

Рис. 2. Влияние БАВ С16 на скорость Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита у индивидуумов I, III, IV квартилей скорости Na+-Li+-ПТ

При введении С16 в концентрациях 0,001 и 0,005 мкМ отмечено повышение проницаемости по Na+; у лиц III КВ скорости Na+-Li+-nT в дозах 0,001 и 0,005 мкМ С14 и С16 увеличивают проницаемость мембран эритроцитов по Na+. У исследуемых, принадлежащих к IV КВ скорости Na+-Li+-nT, БАВ С14 в дозе 0,05 мкМ уменьшает проницаемость мембран эритроцитов, у БАВ С16 в концентрациях 0,001 и 0,005 мкМ отмечено повышение проницаемости по Na+. Это свидетельствует о том, что более эффективным в качестве лекарственного вещества будет вещество С16.

Выводы:

1. Изменение проницаемости клеточной мембраны по натрию под влиянием веществ С14 и С16 зависит от исходного генетически детерминированного состояния клеточной мембраны.

2. Tрифенилтетрадецилфосфония бромид (С14) увеличивает проницаемость мембран эритроцитов по Na+ у исследуемых, принадлежащих к III квартилю скорости Na+-Li+-nT (в дозах 0,001 и 0,005 мкМ), уменьшает проницаемость мембран эритроцитов по Na+ у исследуемых, принадлежащих к IV квартилю скорости Na+-Li+-nT (в дозе 0,05 мкМ), и не оказывает влияния у лиц, относящихся к I квартилю скорости Na+-Li+-nT.

3. Tрибутилгексадецилфосфония бромид (С16) одинаково влияет на скорость Na+-Li+-nT в мембране эритроцита у исследуемых, принадлежащих к I, III и

IV квартилям скорости Na+-Li+-nT. У людей с исходно низкой проницаемостью по Na+ (I квартиль), у лиц с исходно умеренно высокой проницаемостью по Na+ (III квартиль) и у лиц с исходно высокой проницаемостью по Na+ (IV квартиль) вещество С16 (в дозах

0.001 и 0,005 мкМ) увеличивает скорость Na+-Li+-противотранспорта.

4. Для создания лекарственной формы с антибактериальным, фунгицидным и ранозаживляющим действием наиболее эффективным для индивидуумов

1, III и IV КВ скорости Na+-Li+-nT рекомендуется биологически активное вещество С16 - трибутилгексадецил-фосфония бромид.

ЛИТЕРАТУРА

1. Галкина, И.В. Взаимодействие солей фосфония с липидными компонентами мембран / И.В. Галкина, Н.Б. Мельникова, Е.В. Tудрий [и др.] // Фармация. - 2009. - № 4. -С. 35-38.

2. Овчинникова, Л.К. О взаимодействии лекарственных средств (часть I) / Л.К. Овчинникова, РИ. Ягудина // Российские аптеки. - 2006. - № 10/2. - С. 23-25; № 11/1. -

С. 26-27.

3. Canessa, M. Increased sodium-lithium countertransport in red cells of patients with essential hypertension / М. Canessa, N. Adragna, H. Solomon [et al.] // New Engl. J. Med. - 1980. -Vol. 302. - P. 772-776.

4. Ослопов, В.Н. Клиническое значение определения ион-транспортных функций клеточных мембран при гипертонической болезни и ее церебральных осложнениях / В.Н. Ослопов, АТ. Заббарова, Э.И. Богданов // Казан. мед. журнал. - 2000. - T. XXXI, № 3. - С. 211-215.

5. Ослопов, В.Н. Скорость натриево-литиевого противотран-спорта в мембране эритроцита у часто болеющих детей / В.Н. Ослопов, О.И. Пикуза, Х.М. Вахитов, А.А. Кораблёва // Педиатрия. - 2006. - № 3. - С. 21-24.

6. Орлова, О.В. Влияние новых синтезированных веществ С10, С12, С14, С16, С18 на проницаемость клеточных мембран для ионов натрия в модели in vitro / О.В. Орлова,

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

В.Н. Ослопов, С.А. Сидуллина // Казан. мед. журнал. -2012. - T. XCIII, № 3. - С. 505-507.

7. Орлова, О.В. Влияние трифенилтетрадецилфосфония бромида на скорость Na+-Li+-противотранспорта в мембране эритроцита у пациентов с генетически различной проницаемостью мембран по натрию / О.В. Орлова,

B.Н. Ослопов, С.А. Сидуллина // Казан. мед. журнал. -2012. - T. XCIV, № 5. - С. 789-791.

8. Овчинникова, Л.К. О взаимодействии лекарственных средств (часть II) / Л.К. Овчинникова, РИ. Ягудина // Российские аптеки. - 2006. - № 11/1. - С. 26-27.

9. Орлова, О.В. Исследование влияния диметилсульфокси-да на проницаемость клеточных мембран / О.В. Орлова,

C.Н. Егорова, В.Н. Ослопов // Казан. мед. журнал. - 2011. -T. XCII, № 6. - С. 901-904.

10. Постнов, Ю.В. Первичная гипертензия как патология клеточных мембран / Ю.В. Постнов, С.Н. Орлов. - М.: Медицина, 1987. - 192 с.

11. Fetal mouse skin heals scarlessly in a chick chorioallantoic membrane model system. - Carre AL - Ann Plast Surg - 01-JUL-2012; 69(1): 85-90 (MEDLINE® is the source for the citation and abstract of this record).

12. The oxidative damage of butenolide to isolated erythrocyte membranes. - Wang YM - Toxicol In Vitro - 01-AUG-2007; 21(5): 863-9 (MEDLINE® is the source for the citation and abstract of this record).

REFERENCES

1. Galkina, I.V. Vzaimodeistvie solei fosfoniya s lipidnymi komponentami membran / I.V. Galkina, N.B. Mel'nikova, E.V. Tudrii [i dr.] // Farmaciya. - 2009. - № 4. - S. 35-38.

2. Ovchinnikova, L.K. O vzaimodeistvii lekarstvennyh sredstv (chast' I) / L.K. Ovchinnikova, R.I. YAgudina // Rossiiskie apteki. - 2006. - № 10/2. - S. 23-25; № 11/1. - S. 26-27.

3. Canessa, M. Increased sodium-lithium countertransport in red cells of patients with essential hypertension / М. Canessa, N. Adragna, H. Solomon [et al.] // New Engl. J. Med. - 1980. -Vol. 302. - P. 772-776.

4. Oslopov, V.N. Klinicheskoe znachenie opredeleniya iontransportnyh funkcii kletochnyh membran pri gipertonicheskoi bolezni i ee cerebral'nyh oslozhneniyah / V.N. Oslopov, A.T. Zabbarova, E.I. Bogdanov // Kazan. med. zhurnal. - 2000. - T. XXXI, № 3. - S. 211-215.

5. Oslopov, V.N. Skorost' natrievo-litievogo protivotransporta v membrane eritrocita u chasto boleyuschih detei / V.N. Oslopov, O.I. Pikuza, H.M. Vahitov, A.A. Korablyova // Pediatriya. -2006. - № 3. - S. 21-24.

6. Orlova, O.V. Vliyanie novyh sintezirovannyh veschestv S10, S12, S14, S16, S18 na pronicaemost' kletochnyh membran dlya ionov natriya v modeli in vitro / O.V. Orlova, V.N. Oslopov, S.A. Sidullina // Kazan. med. zhurnal. - 2012. - T. XCIII, № 3. - S. 505-507.

7. Orlova, O.V. Vliyanie trifeniltetradecilfosfoniya bromida na skorost' Na+-Li+-protivotransporta v membrane eritrocita u pacientov s geneticheski razlichnoi pronicaemost'yu membran po natriyu / O.V. Orlova, V.N. Oslopov, S.A. Sidullina // Kazan. med. zhurnal. - 2012. - T. XCIV, № 5. - S. 789-791.

8. Ovchinnikova, L.K. O vzaimodeistvii lekarstvennyh sredstv (chast' II) / L.K. Ovchinnikova, R.I. Yagudina // Rossiiskie apteki. - 2006. - № 11/1. - S. 26-27.

9. Orlova, O.V. Issledovanie vliyaniya dimetilsul'foksida na pronicaemost' kletochnyh membran / O.V. Orlova,

S.N. Egorova, V.N. Oslopov // Kazan. med. zhurnal. - 2011. -T. XCII, № 6. - S. 901-904.

10. Postnov, Yu.V. Pervichnaya gipertenziya kak patologiya kletochnyh membran / Yu.V. Postnov, S.N. Orlov. - М.: Medicina, 1987. - 192 s.

11. Fetal mouse skin heals scarlessly in a chick chorioallantoic membrane model system. - Carre AL - Ann Plast Surg - 01-JUL-2012; 69(1): 85-90 (MEDLINE® is the source for the citation and abstract of this record).

12. The oxidative damage of butenolide to isolated erythrocyte membranes. - Wang YM - Toxicol In Vitro - 01-AUG-2007; 21(5): 863-9 (MEDLINE® is the source for the citation and abstract of this record).

Comparative research of influence of substances of C 14 and C 16 possessing antibacterial and fungicide action on cellular permeability at persons of different quartiles of Na +-Li +countertransport