CC BY
217
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
УДК 612.111.17: 612.014.462.4: 615.015.14: 615.015.44: 615.076
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДА НА ПРОНИЦАЕМОСТЬ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН
Ольга Валериановна Орлова *, Светлана Николаевна Егорова, Владимир Николаевич Ослопов Казанский государственный медицинский университет
Реферат
Цель. Изучение возможности использования мембраны эритроцита для оценки влияния вспомогательных веществ на проницаемость биомембран на примере известного пенетрирующего агента — диметилсульфоксида посредством определения скорости №+-И+- противотранспорта.
Методы. Исследовано влияние разных концентраций диметилсульфоксида (в %): 0,01; 0,1; 0,5; 1,0 на скорость №+-И+- противотранспорта.
Результаты. Малая концентрация (0,01%) увеличивает скорость №+-И+- противотранспорта в 1,3 раза (на 70%), большие концентрации (0,1 — 1,0 %) не оказывают существенного влияния на проницаемость клеточной мембраны по №.
Выводы. Изменения скорости №+-И+- противотранспорта под влиянием диметилсульфоксида, обнаруженные при внесении в среду В (среда с №С1, одночасовая инкубация), позволяют рекомендовать внесение этих веществ в среду с № при определении скорости №+-и+-противотранспорта в мембране эритроцита.
Ключевые слова: диметилсульфоксид, мембрана эритроцита, проницаемость, №+-И+- противотранспорт.
INVESTIGATION OF THE EFFECT OF DIMETHYLSULFOXIDE ON THE PERMEABILITY OF CELL MEMBRANES. O.V. Orlova, S.N. Egorova, V.N. Oslopov. Kazan State Medical University. Aim. To study the possibility of using the erythrocyte membrane for assessing the effect of excipients on the permeability of biological membranes on the example of a well-known penetrating agent — dimethylsulfoxide by determining the rate of Na+-Ii+-countertransport. Methods. The effect of different concentrations of dimethylsulfoxide was studied (in %): 0.01, 0.1, 0.5, 1.0 on the rate of Na+-Ii+-countertransport. Results. The low concentration (0.01%) increases the rate of Na+-Ii+-countertransport by 1.3 times (by 70%), high concentrations (0.1 — 1.0%) did not significantly affect the permeability of cell membranes for Na. Conclusions. Changes in the Na+-Li+-countertransport rate under the influence of dimethylsulfoxide found during introduction into the medium B (medium with NaCl, one-hour incubation), make it possible to recommend the introduction of these substances into the medium with Na while determining the rate of Na+-Ii+-countertransport in the erythrocyte membrane. Key words: dimethylsulfoxide, erythrocyte membranes, permeability, Na+-Li+-countertransport.
При изучении новых лекарственных средств местного действия необходимо проводить экспериментальные исследования фармацевтической доступности, в том числе на искусственных и биологических моделях мембран [1]. Используются тефлоновые мембраны
[7], мембраны из силиконов, полиуретана, 2-по-лигидроксиэтилен-метакрилата [10], которые рекомендуют пропитывать липофильной фазой (н-додеканолом или изопропилмиристатом). Наиболее часто применяют мембраны из производных целлюлозы, в частности ацетата целлюлозы и целофана. Однако результаты, полученные с использованием искусственных мембран, по ряду причин дают лишь относительное представление о проникновении лекарственных веществ из лекарственных форм (ЛФ) через кожу. В биофармацевтических исследованиях для приближения экспериментальных моделей к условиям in vivo широко используются в качестве диализных мембран биологические объекты: обезволошенная кожа мыши
[8], тонкие лоскуты кожи человека, взятой в процессе хирургического вмешательства, кожа человека после пластической операции, кожа трупа человека [11], сброшенная кожа змеи [12], подскорлуповая оболочка куриного яйца [2]. Поскольку стандартные модели для оценки
Адрес для переписки: [email protected]
фармацевтической доступности ЛФ местного действия отсутствуют, остаётся актуальной задача унификации биофармацевтических методов иследования.
В настоящее время для изучения проницаемости биомембран стали использоваться мембраны клеток крови. В качестве естественной модели проницаемости биологических мембран наиболее удобна мембрана эритроцита (МЭ): с одной стороны, эритроцит — это безъядерная клетка, фактически, изолированная («чистая») мембрана, а с другой — была доказана корреляция между изменениями свойств МЭ и мембран других клеток [3].
Существует два типа транспорта веществ через мембраны клеток: активный и пассивный. Пассивный транспорт подразделяется на движение ионов по градиенту концентрации и облегченную диффузию, когда для транспортировки ионов используются специфические белки-переносчики клеточной мембраны. №+-П+-противотранспорт (№+-П+-ПТ) является примером облегченной диффузии ионов. Методику определения скорости №+-ЬГ-ПТ в МЭ предложили М. Canessa е! а1. в 1980 г. [6]. №+-П+-ПТ служит лабораторным аналогом №+-№+ -обмена и, хотя физиологическое и биофизическое значение №+-ЬГ-ПТ остается неясным, установление скорости №+-П+-ПТ широко используется для оценки функционального состояния мембран клеток в организме. В работах
Таблица 1
Влияние диметилсульфоксида на скорость нротивотранснорта в мембране эритроцита
(в микромолях Li/л клеток/час)
Среда Исходное значение скорости Na+-Li+-nT Концентрация раствора ДМСО, %
0,01 0,1 0,5 1
Б (MgCl2, одночасовая инкубация) 328±5 322±8 309±10 316±14 283±30
В (NaCl, одночасовая инкубация) 328±5 426±18* 351±13 288±10 384±28
Г (трехчасовая прединкубация с LiCl) 328±5 297±12 311±9 332±21 353±29
* р<0,05 по сравнению с исходным значением.
Ю. В. Постнова и его школы было показано, что большие скорости Na+-Li+-nT (больше 390 микромолей Li на 1 литр эритроцитов в час) служат индикатором мембранных нарушений, которые составляют основу такого заболевания, как гипертоническая болезнь (ГБ). Большие скорости Na+-Li+-nT в МЭ как своеобразный интегральный показатель указывают на наличие целого спектра структурных и функциональных изменений клеточной мембраны, что объединяется термином «мембранный дефект» [3]. Имеет место различный ответ больных ГБ на разные группы гипотензивных препаратов в соответствии с квартильным распределением пациентов по скорости Na+-Li+-nT в МЭ [4].
В последние годы определение скорости Na+-Li+-nT в МЭ стало использоваться для оценки влияния на проницаемость клеточных мембран in vitro некоторых веществ. Так, было показано изменение скорости Na+-Li+-nT, V ,
r max
K и их соотношения под влиянием селена
m
in vitro [5]. Диоксид селена (SeO2) в различных концентрациях оказывал разнонаправленный эффект на скорость Na+-Li+-nT: при минимальной концентрации в 1 цМ он достоверно уменьшал в сравнении с контролем скорость Na+-Li+-nT; концентрации в 5, 10, 25 цМ не изменяли скорость Na+-Li+-nT, а в 50, 100 цМ селена достоверно увеличивали скорость Na+-Li+-nT. Авторы объясняют полученные результаты тем, что селен связывается с тиоловыми группами белка-переносчика. Известно, что селен является кофактором антиоксидантного фермента глутатион-пероксидазы, который инактивирует перекись водорода и органические гидроперекиси. Предполагается, что дефицит селена может вызвать развитие различных заболеваний, включая атеросклероз, определенные виды рака, артрит, патологию ЦНС, мужское бесплодие, нарушения иммунологической функции [9]. Поэтому авторы в этой статье посчитали необходимым изучить проницаемость клеточных мембран по Na для расширения представлений о механизме действия селена. Была показана модификация кинетики Na+-Li+-nT при воздействии на две тиоловые группы белка-переносчика Н-этилмалеимидом и йодоацетамидом [13].
Tаким образом, Na+-Li+-nT МЭ может быть использован как in vitro модель для определения влияния на проницаемость клеточных 902
мембран различных веществ и лекарственных препаратов.
Целью данного исследования являлось изучение возможности использования мембраны эритроцита для оценки влияния вспомогательных веществ на проницаемость биомембран на примере известного пенетрирующего агента — диметилсульфоксида посредством определения скорости Na+-Li+- противотранспорта.
Объектом исследования были эритроциты крови, обработанные диметилсульфоксидом (ДМСО). Изучалось влияние ДМСО на скорость Na+-Li+-nT в МЭ in vitro. Скорость Na+-Li+-ПТ в МЭ определяли по методу M. Canessa et al. (1980): измеряли обмен внутриклеточного лития в загруженных этим ионом клетках на внеклеточный натрий из среды инкубации. Концентрацию лития регистрировали методом атомной абсорбционной спектрофотометрии в эмиссионном режиме.
В методике M. Canessa используются 4 среды (А, Б, В, Г) следующего состава (в мМ):
1) А (среда промывки): 75 — MgCl2; 85 — сахарозы; 10 — глюкозы; 10 — Hepes-tris;
2) Б: 75 — MgCl2; 85 — сахарозы; 10 — глюкозы; 10 — Hepes-tris; 0,1 — уабаина;
3) В: 150 — NaCl; 10 — глюкозы; 10 — Hepes-tris; 0,1 — уабаина;
4) Г: 150 — LiCl; 10 — глюкозы; 10 — Hepes-tris (во всех средах pH 7,4).
ДМСО добавлялся изолированно в каждую из 3 сред инкубации: в среду Б с MgCl2 в составе (одночасовая инкубация), в среду В с NaCl (одночасовая инкубация) и в Г с LiCl (трехчасовая прединкубация). Кровь в количестве 3 мл брали из вены самотёком в пластиковые пробирки, смоченные гепарином (20 ЕД на 1 мл крови), содержимое перемешивали и пробирки помещали в контейнер с тающим льдом.
Исследование состояло из следующих этапов: 1) отделение эритроцитов; 2) промывание эритроцитов; 3) прединкубация; 4) промывание эритроцитов; 5) инкубация; 6) определение концентрации лития; 7) вычисление конечного результата.
Влияние ДМСО на проницаемость клеточных мембран по Na оценивали путем подбора, в первую очередь такой концентрации, которая не вызывала гемолиза эритроцитов. Это проводилось посредством опыта — путем разведения исходного раствора в 5, 10, 20 раз. Отсутствие
Казанский медицинский журнал, 2011 г., том 92, № 6
Рис. 1. Влияние диметилсульфоксида на скорость Na+-Li+-nporaBOTpaHcnopTa в мембране эритроцита в разных средах: Б, В, Г.
* Контроль (здесь и на рис. 2) — исходная скорость Na+-Li+ противотранспорта.
гемолиза устанавливалось визуально. Дальнейшие исследования проводились с разными концентрациями изучаемого вещества (в %): 0,01;
0,1; 0,5; 1,0.
Согласно методике определения скорости Na+-Li+-nT в МЭ по M. Canessa et al. (1980), инкубация эритроцитов происходила в трёх средах: Б, В, Г. Наше исследование проводилось таким образом, что ДМСО вносили изолированно в каждую из сред, и скорость Na+-Li+-nT находили при инкубации эритроцитов с ДМСО. Результаты приведены в табл. 1 и на рис. 1 и 2. Как видно, внесение ДМСО в среды Б и Г не изменяло скорость Na+-Li+-nT, последнее происходило при внесении ДМСО в среду В (среда с Na). Было обнаружено, что ДМСО увеличил скорость Na+-Li+-nT в МЭ, но это наблюдалось лишь под влиянием минимальной концентрации ДМСО, равной 0,01%. Под влиянием других концентраций: 0,1 — 0,5 — 1,0% скорость Na+-Li+-nT не изменялась (рис. 2). Под воздействием ДМСО (при инкубации эритроцитов в среде В с 0,01% раствором ДМСО) скорость Na+-Li+-nT в МЭ возрастала в 1,3 раза, или на 70% (с 328±5 до 426± ±18 мкМ Li, р<0,05).
Tаким образом, нами обнаружено повышение проницаемости клеточных мембран по Na под влиянием 0,01% раствора ДМСО; дальнейший рост концентрации ДМСО уже не влияет на скорость Na+-Li+-nT. Tакое увеличение проницаемости МЭ по Na количественно определяется по усилению скорости Na+-Li+-nT.
При инкубации эритроцитов в среде В (среда с Na) при одночасовой инкубации ДМСО повлиял на скорость Na+-Li+-nT в МЭ на проницаемость Na (в концентрации 0,01%). Статистически значимых различий между исходной скоростью Na+-Li+- nT (контроль) и скоростью Na+-Li+-nT при инкубации эритроцитов с иными концентрациями ДМСО, как и в других средах, — в Б (среда с Mg) и в Г (среда с Li) не выявлено.
Рис. 2. Влияние диметилсульфоксида на скорость Na+-Li+-npormoTpaHcnopTa в мембране эритроцита — среда В.
ВЫВОДЫ
1. При сравнении влияния диметилсульфоксида на проницаемость по Na на модели мембраны эритроцита с внесением его в среды с Na, Mg и Li было обнаружено, что продуктивным является внесение исследуемого вещества при инкубации в среду с Na.
2. При изучении пенетрирующей активности вспомогательных веществ (по проницаемости по Na) на модели мембраны эритроцита было обнаружено, что концентрация диметилсульфоксида в 0,01% увеличивает проницаемость мембраны эритроцита по Na; иные концентрации (0,1—0,5 — 1,0 %) существенного влияния на проницаемость по Na не оказывают.
ЛИТЕРАТУРА
1. Егорова С. Н. Методы моделирования in vitro чрескожного всасывания лекарственных средств из лекарственных форм местного действия // Казанский мед. ж. — 2000. — №2. — С. 146 — 147.
2. Егорова С. Н., Зиганшина Л. Е., Кадырова Е. А. Обоснование состава основы и концентрации диме-фосфона в парафармацевтическом дерматокосметиче-ском креме // Фармация. — 1998. — №5. — С. 18 — 20.
3. Постнов Ю.В., Орлов С.Н. Первичная гипертензия как патология клеточных мембран. — М., 1987. — 192 с.
4. Хасанов Н. Р., Ослопов В. Н. Эффективность монотерапии эналаприлом, нифедипином и метопро-лолом у больных эссенциальной гипертензией с различной скоростью облегченной ионной диффузии // Казанский мед. ж. — 2010. — №6. — С. 755 — 758.
5. Akbarzadeh S., Ani M. et al. Changes in Erythrocyte Sodium-Lithium Countertransport and Plasma Parameters Following Selenium Treatment // J. Biol. Sci. — 2008. -Vol. М8 (1). — P. 166 — 170.
6. Canessa M., Adragna N, Solomon H. et al. Increased sodium-lithium countertransport in red cells of patients with essential hypertension// New Engl. J. Med. — 1980. — Vol. 302. — P.772 — 776.
7. Juhasz J., Mahashabde S., Sequeira J. Comparison of in vitro release rates of nitroglycerin by diffusion through a Teflon membrane to the USP method // Drug Dev. And
Ind. Pharm. — 1996. — Vol. 22. — P. 1139 — 1144.
8. Lien E. J, Gan H. QSAR analysis of skin permeability of various drugs in man as compared to in vivo and in vitro studies in rodents // Pharm. Res. — Vol. 12. — P. 583 — 587.
9. Patrick. Selenium biochemistry and cancer: A revive of the literature// Alter. Med. Rev. — 2004. — Vol. 9 (3). -Р. 239 — 258.
10. Pulat M, Abbasoglu U. Water and antimicrobial agent permetation of PU and PHEMA membranes in relation to their surface and bulk properties // J. Biomater. Appl. — 1995. — Vol. 9. — P. 363 — 371.
11. Sarpotdar P. P., Gaskill J. L, Giannini R. P Effect of polyethylene glycol 400 on the penetration of drugs through human skin in vitro// J. Pharm. Sci. — 1986. — Vol. 75. — P. 26 — 28.
12. Sieh Hearam, Jun H.W. Effectiveness and mode of action of isopropyl myristate as a permeation enhancer for naproxen throught shed snake skin // J. Pharm. Sci. — 1996. — Vol. 48. — P. 812 — 816.
13. Thomas T, West I. et al. Modification of erythrocyte Na+ / Li+ countertransport kinetics by two types of thiol group// Biochim. Biophys. Acta. — 1995. — Vol. 1235. — P. 317 — 322.
УДК616.36—001 - 003.93 - -003.92-092.9: 615.27
ВЛИЯНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ГЕПАТОЦИТОВ ПЛОДОВ И НОВОРОЖДЕННЫХ КРЫСЯТ ПОСЛЕ МЕХАНИЧЕСКОЙ ТРАВМЫ ПЕЧЕНИ
Любовь Петровна Романова, Игорь Иванович Малышев*
Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова, г. Чебоксары
Реферат
Цель. Изучение пролиферативной активности гепатоцитов плодов и новорожденных крысят после механической травмы печени.
Методы. Применялись гистологический, морфометрический и статистический методы. С помощью оригинальной методики стальной иглой плодам крыс наносилась внутриутробная механическая травма печени.
Результаты. Морфологическое изучение заживления показало, что у подопытных животных, получавших биологически активные вещества «Трепел» и «Сувар», воспалительная реакция вокруг очага травмы была выражена в значительно меньшей степени, а образование соединительной ткани на месте погибшей ткани было более замедленным, чем у контрольных крысят. Подсчёт числа митозов и двуядерных гепатоцитов установил их значительное увеличение у животных подопытной группы; при этом активация пролиферации гепатоцитов протекала на фоне полиплоидизации гепатоцитов и увеличения числа двуядрышковых гепатоцитов, что свидетельствовало об усилении белок-синтетической функции печёночных клеток.
Выводы. Биологически активные вещества «Трепел» и «Сувар» снижают реактивно-воспалительные изменения вокруг очага травмы, тормозят коллагенообразование и одновременно активизируют пролиферацию гепатоцитов. Это приводит к тому, что у подопытных животных активно делящиеся гепатоциты механически сдавливают участок и уменьшают его размеры, при этом развивающаяся соединительная ткань заполняет лишь незначительную часть зоны повреждения. У контрольных животных воспалительная реакция преобладает над пролиферацией гепатоцитов, в результате этого участок травмы на большем протяжении замещается соединительной тканью. Активизация биологически активными веществами «Трепел» и «Сувар» пролиферативной активности гепатоци-тов способствует более полноценному восстановлению печёночной ткани.
Ключевые слова: плоды и новорожденные крысята, механическая травма печени, биологически активные вещества, гепатоциты, пролиферация.
THE INFLUENCE OF BIOLOGICAL ACTIVE SUBSTANCES ON THE PROLIFERATIVE ACTIVITY OF HEPATOCYTES OF THE FETUSES AND NEONATAL RATS AFTER MECHANICAL LIVER INJURY. L.P. Romanova, I.I. Malyshev. Chuvash State University named after I.N. Ulyanov, Cheboksary city. Aim. To study the proliferative activity of hepatocytes of fetuses and newborn rats after mechanical liver injury. Methods. Used were histological, morphometric and statistical methods. An original technique of applying intrauterine mechanical liver injury to the rat fetus with a steel needle was used. Results. Morphological study of wound healing showed that in the experimental animals treated with biologically active substances «Trepel» and «Suvar» the inflammatory reaction around the focus of injury was expressed to a much lesser degree, and the formation of connective tissue in place of the necrotized tissue was more sustained than such of the control rats. Calculation of the number of mitoses and binucleated hepatocytes showed their significant increase in the animals of the experimental group; at the same time the activation of proliferation of hepatocytes was accompanied by polyploidization of hepatocytes and increase in the number of binucleated hepatocytes, which indicated the increase in the protein-synthetic function of the liver cells. Conclusions. Biologically active substances «Trepel» and «Suvar» reduce the reactive inflammatory changes around the injury focus, inhibit collagen formation and simultaneously stimulate the proliferation of hepatocytes. This leads to the fact that in experimental animals the actively dividing hepatocytes mechanically compress the area and reduce its size, and at the same time the connective tissue fills only a small fraction of the lesion. In control animals, the inflammatory response dominates over the proliferation of hepatocytes, as a result of this the injury site is almost entirely replaced by connective tissue. Activation by the biologically active substances «Trepel» and «Suvar» of the proliferative activity of hepatocytes contributes to a full recovery of liver tissue. Key words: fetuses and neonatal rats, mechanical liver injury, the biologically active substances, hepatocytes, proliferation.
Адрес для переписки: malichev- [email protected] 904
