CC BY
166
Химия растительного сырья. 2005. №1. С. 31-35.
УДК 615.322
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТОЛОКНЯНКИ, БРУСНИКИ И БЛИЗКИХ К НИМ ВИДОВ, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ В РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ)
© Л.П. Охрименко, Г.И. Калинкина , С.Е. Дмитрук
Сибирский государственный медицинский университет, Московский тракт,
2/7, Томск, 634004 (Россия) E-mail: borkol@seversk.tomsknet.ru
Цель работы - на основании результатов сравнительного химического исследования определить возможность использования листьев черники, голубики и зимолюбки, произрастающих в Республике Саха (Якутия) наравне с толокнянкой и брусникой. В результате проведенных исследований установлено, что листья толокнянки, брусники, черники, голубики и зимолюбки содержат до 23% фенольных соединений. Максимальное содержание арбутина установлено в листьях зимолюбки (10-12%), в остальных видах - 4-8%, что дает возможность считать их перспективными для решения поставленной задачи.
Введение
На сегодяшний день научной медициной недостаточно широко используются многие лекарственные растения, так как являются мало изученными. При этом фармацевтическая практика постоянно требует увеличения ассортимента и количества лекарственного растительного сырья (ЛРС). Это особенно актуально для регионов, удаленных от Центральной России: Восточная Сибирь, Якутия и Дальний Восток [1]. Расширение ассортимента ЛРС возможно засчет внедрения в медицинскую практику растений народной медицины и прежде всего видов, систематически близких к официнальным. С этой точки зрения интерес представляет поиск новых арбутинсодержащих видов сырья, возможных дополнить уже ограниченную сырьевую базу толокнянки и брусники.
Листья толокнянки и брусники широко применяются в медицинской практике при заболеваниях мочевыводящих путей (мочекаменная болезнь, циститы, уретриты), оказывают при этом антимикробное, диуретическое, вяжущее и противовоспалительное действие, обусловленное наличием в растениях фенольного гликозида арбутина и его агликона гидрохинона, а также флавоноидов, дубильных и других БАВ [2]. Наряду с толокнянкой и брусникой в народной медицине с этой же целью рекомендуются и другие близкие к ним виды: черника, голубика и зимолюбка [3]. Данные виды рассматриваются в официнальной медицине как возможные примеси к лекарственному сырью толокнянки и брусники, поскольку они имеют общий ареал и местообитание, которое приурочено в основном к сосновым лесам [4]. Это создает, с одной стороны, сложности при заготовке официнальных видов сырья из-за их морфологической схожести, а с другой стороны, ставит задачу изучения возможности равноценного использования близких видов в медицинской практике. В народной медицине данные виды рекомендуются аналогично толокнянке и бруснике, особенно зимолюбка, а в литературе приводятся сведения о присутствии в них арбутина [3].
В связи с этим цель нашей работы - на основании результатов сравнительного химического исследования определить возможность использования надземной части черники, голубики и зимолюбки, произрастающих в Республике Саха (Якутия) наравне с толокнянкой и брусникой.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Объектами исследования явились листья толокнянки, брусники, черники, голубики и зимолюбки. Для проведения исследований использовали образцы, собранные в Республике Саха (Якутия), их харакеристи-ка представлена в таблице 1.
Побеги толокнянки, брусники и зимолюбки заготавливали в конце августа после отрастания и формирования побегов текущего года; побеги черники и голубики как листопадных растений заготавливали в июне в период цветения растений. Сырье сушили воздушно-теневой сушкой, затем упаковывали в тканевые мешки и хранили в сухом, прохладном месте.
В листьях толокнянки, брусники, черники, голубики и зимолюбки общепринятыми методиками определяли присутствие фенольных сединений, в том числе дубильных веществ, флавоноидов и арбутина, а также количественное содержание суммы фенольных соединений и арбутина.
Обнаружение биологически активных веществ в исследуемых видах проводили с помощью качественных реакций [5, 6]. Обнаружение фенольных соединений проводили с помощью железо-аммонийных квасцов - ЖАК.
Для обнаружения флавоноидов использовали пробу Синода: появление оранжевого или ярко-красного окрашивания с цинком в присутствии концентрированной хлористоводородной кислоты свидетельствуют о том, что исследуемые виды содержат флавоноиды. Окрашивание образуется вследствие того, что происходит восстановление флавонов и флавонолов до антоцианидинов, которые в кислой среде образуют окрашенные оксониевые соли. Результат реакции со спиртовым раствором щелочи свидетельствует о наличии халконов и ауронов в исследуемых объектах.
Наиболее характерной для флавоноидов является реакция с алюминия хлоридом, которая используется для количественного определения этой группы фенольных соединений в сырье методом спектрофотометрии [5].
Для обнаружения дубильных веществ в исследуемых объектах использовали наиболее достоверную реакцию с раствором желатина [6]. При этом образуется белая муть или при достаточно высоком содержании дубильных веществ белый осадок.
Определение арбутина проводили с помощью качественных реакций с сульфатом закисного железа по образованию темно-фиолетового осадка, а также с раствором натрия фосфорно-молибденовокислого по появлению синего окрашивания [5].
Таблица 1. Характеристика образцов объектов исследования
№ образца Вид Место сбора
1 Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. - Нюрбинский улус, окр. г. Нюрба, сосняк по реке Вилюй, то-
толокнянка обыкновенная локнянково-брусничный лиственничник
2 сем.Епсасеае Верхневилюйский улус, окр. п. Верхневилюйск, сосняк по реке Вилюй, толокнянково-брусничный лиственничник
3 Vaccinium vitis-idaea (L.) брусника, Нюрбинский улус, окр. г. Нюрба сосняк по реке Вилюй, толок-
сем.Епсасеае нянково-брусничный лиственничник
4 Верхневилюйский улус, окр. п. Верхневилюйск, сосняк по реке Вилюй, толокнянково-брусничный лиственничник
5 Vaccinium myrtillus (L.) черника, Нюрбинский улус, окр.п. Юдэй, сосняк по реке Марха, чер-
сем.Егісасеае ничник
6 Верхневилюйский улус, окр. п. Верхневилюйск, сосняк по реке Вилюй, черничник
7 Vaccinium uliginosum (L.) голубика, Нюрбинский улус, окр. п. Юдэй, сосняк по реке Марха, голу-
сем.Епсасеае бично-брусничный лисвенничник
8 Верхневилюйский улус, окр. п. Верхневилюйск, сосняк по реке Вилюй, голубично-брусничный лисвенничник
9 Chimaphila umbellata (L.) W. Barton - Нюрбинский улус, окр. г. Нюрба сосняк по реке Вилюй, разно-
зимолюбка зонтичная, сем.Ругоіасеае травно-брусничный лиственничник
10 Верхневилюйский улус, окр. п. Верхневилюйск, сосняк по реке Вилюй, разнотравно-брусничный лиственничник
Более достоверное доказательство наличия арбутина в исследуемом сырье проводили методом тонкослойной хроматографии. Для этого из сырья получали спиртовое извлечение при нагревании на водяной бане в течение 1 ч, которое наносили на пластинку «81ШЫ» и хроматографировали в системе растворителей хлороформ-этанол (6 : 4). Хроматограмму высушивали и обрабатывали раствором 10% спиртового раствора щелочи, а затем реактивом Паули (раствор диазотированной сульфаниловой кислоты). Арбутин отделяется от сопутствующих веществ и проявляется в виде красно-оранжевого пятна на уровне пятна достоверного образца. Результаты представлены в таблице 2.
Определение содержания суммы фенольных соединений в листьях толокнянки, брусники и близких к ним видов проводили методом перманганатометрического титрования по методике Государственной фармакопеи XI издания [5], предназаначенной для определения дубильных веществ в растительном сырье. Однако при титровании калия перманганатом окислению подвергаются все фенольные соединения и другие окисляемые вещества, поэтому для определения дубильных веществ необходимо проводить их предварительное осаждение из полученного извлечения. Однако это возможно только при достаточно высоком содержании дубильных веществ в сырье.
В литературе описано несколько методик количественного определения арбутина в растительном сырье: йодометрический (ГФХ1) [5], фотоколориметрический, в основе которого лежит реакция арбутина с диазореактивом [7], спектрофотометрический, основанный на конденсации арбутина с 4-аминоантипирином в щелочной среде и в присутствии окислителя [8], спектрофотометрический метод, основанный на осаждении сопутствующих арбутину веществ основным ацетатом свинца и спектрофотометрированием фильтрата при длине волны 281 нм [8], спектрофотометрический с использованием гидрохинона в качестве стандарта [9], хроматоспектрофотометрический, основанный на применении оксида алюминия для очистки арбутина от сопутствующих примесей [8].
Для получения достоверной информации и оценки методик количественного определения арбутина нами проведено сравнительное определение данного вещества в объектах исследования тремя методиками: фармакопейной, принятой для толокнянки и брусники, а также предложенными некоторыми авторами более совершенными методиками.
Методика Государственной фармакопеи [5] основана на использовании йодометрического титрования гидрохинона, полученного после извлечения и гидролиза арбутина. Данная методика включает несколько стадий (осаждение полифенолов, гидролиз арбутина), что повышает ее трудоемкость. Следует также учитывать, что с йодом реагируют и другие фенольные соединения, а это приводит к получению завышенного результата анализа.
Таблица 2. Результаты обнаружения фенольных соединений
Качественные реакции
Фенольные соединения Флавоноиды Дубильные вещества Арбутин
Сырье проба Синода 5% спиртовый р-р А1С1 10% натрия
1 % ЖАК НС1 с 7и спиртовый р-р КОН р-р желатина спиртовый р-р Ее8О4 фосфорномолибденовокислый в НС1
Листья темно-синяя светло- просветле- желтый зеленый, белый зеленый, темно-синий
толокнянки муть коричне- вый ние р-ра переходящий в желтый осадок переходящий в светложелтый
Листья темно-синий красный оранжевый темно- темно- белая муть желтый с темно-синий, с
брусники осадок зеленый желтый красным оттенком белым осадком
Листья темно-синяя темно- красный темно- темно- белая муть светло- синий, с белым
черники муть красный коричне- вый желтый желтый осадком
Листья темно-синий темно- красный коричне- темно- белая муть темно-синий, с
голубики осадок красный во- оранже- вый желтый зеленый белым осадком
Листья темно-синяя красно- светло- темно- темно- белая муть желтый с темно-синий с
зимолюбки муть светло- коричне- вый красный красный желтый красным оттенком белым осадком
Спектрофотометрический метод определения арбутина в лекарственном растительном сырье предполагает экстрагирование арбутина из сырья дистиллированной водой при нагревании, осаждение сопутствующих веществ ацетатом свинца, определение оптической плотности очищенного экстракта при 288 нм (максимум поглощения гидохинона). Расчет содержания арбутина в пересчете на гидрохинон в % проводят по удельному показателю поглощения гидрохинона-стандартаЕ1% = 230 .
Хроматоспектроскопический метод определения арбутина в растительном сырье, в отличие от предыдущего, предполагает получение извлечения из сырья 40% этанолом, дополнительную хроматографическую очистку арбутина от сопутствующих веществ на оксиде алюминия. Оптическую плотность очищенного элюата измеряют на спектрофотометре при длине волны 287 нм в сравнении с гидрохиноном-стандартом.
Полученные результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3. Содержание суммы фенольных соединений и арбутина в исследуемых растениях (% от массы воздушно - сухого сырья)
Вид сырья № образца Фенольные соединения, % Арбутин, %
йодометрический метод спектрофотометрия
осаждение ацетатом свинца хроматографическая очистка
Листья толок- 1 21,40±1,20 16,00±0,50 9,59±0,28 9,30±0,30
нянки 2 23,07±1,05 17,25±0,55 12,31±0,40 9,88±0,29
Листья 3 17,00±0,53 12,30±0,41 6,90±0,21 4,30±0,15
брусники 4 15,80±0,48 12,50±0,42 6,40±0,19 3,77±0,10
Листья 5 16,63±0,50 14,53±0,45 13,00±0,43 12,65±0,42
черники 6 14,68±0,42 11,60±0,32 10,22±0,34 9,54±0,25
Листья 7 12,26±0,40 10,87±0,28 7,90±0,24 3,25±0,10
голубики 8 11,15±0,30 10,01±0,24 7,65±0,22 4,15±0,12
Листья 9 12,89±0,46 12,27±0,40 10,80±0,28 9,00±0,22
зимолюбки 10 12,93±0,47 12,60±0,41 10,50±0,25 9,40±0,24
Обсуждение результатов
Результаты качественных реакций, представленные в таблице 2, показывают, что в листьях исследуемых образцов толокнянки, брусники, черники, голубики и зимолюбки содержатся фенольные соединения, в числе которых флавоноиды, дубильные вещества и арбутин.
Положительные реакции на флавоноиды, полученные с различными реактивами, позволяют судить о присутствии в исследуемых объектах флавонолов, халконов и ауронов.
Присутствие дубильных веществ было достоверно подтверждено реакцией с раствором желатина. При этом наблюдали образование небольшого осадка с извлечением из листьев толокнянки и белой мути с извлечениями из других объектов.
Качественные реакции дали возможность обнаружить арбутин во всех исследуемых образцах. Причем интенсивность окраски позволила предположить, что наибольшее содержание арбутина следует ожидать в листьях зимолюбки, затем толокнянки, брусники, черники и небольшое количество в листьях голубики.
Хроматографический анализ подтвердил не только достоверное присутствие арбутина во всех исследуемых видах, но также по интенсивности окраски пятен позволил судить о содержании арбутина и расположить растения в той же последовательности.
Результаты количественного определения показали, что наибольшая сумма фенольных (окисляемых) соединений отмечена в листьях толокнянки (23,07%). Остальные виды сырья по содержанию фенольных соединений практически равноценны - 12,26-17,00% (табл. 3).
Определение арбутина различными методиками показало, что его содержание зависит от степени очистки извлечения, полученного из сырья, поэтому данные различных авторов по толокнянке и бруснике весьма противоречивы.
Результаты, представленные в таблице 3, показывают, что методика йодметрического титрования гидрохинона, полученного после извлечения и гидролиза арбутина, дает завышенные результаты. Однако нетрудно заметить, что по содержанию арбутина (16-20%) зимолюбка и толокнянка превосходят другие виды, о чем свидетельствовали результаты качественных реакций и хроматографии.
Сравнительное исследование содержания арбутина спектрофотометрическим методом показало, что содержание данного соединения в толокнянке и зимолюбке составляет не более 11%, а у других видов - 3-8%.
Определение содержание арбутина в исследуемых растениях хроматоспектроскопическим методом показало, что дополнительная очистка арбутина приводит к получению еще более низких результатов по сравнению с предыдущими методами. При этом наибольшее содержание арбутина отмечено в листьях толокнянки и зимолюбки (около 10%). В листьях брусники, черники и голубики содержание арбутина находится в пределах от 2,9-4%.
Обобщая результаты определения арбутина в растительном сырье описанными выше методиками, можно отметить, что хроматоспектроскопический метод является более объективным для определения содержания арбутина, так как при хроматографировании извлечения на колонке с оксидом алюминия достигается более полная очистка арбутина от сопутствующих фенольных соединений. Однако не исключено, что при очистке извлечения на оксиде алюминия возможны потери арбутина.
Таким образом, результаты определения содержания фенольных соединений и, в частности арбутина, в листьях толокнянки, брусники, черники, голубики и зимолюбки свидетельствуют о перспективности изучения исследуемых видов в качестве арбутинсодержащих и их возможного использования наравне с офи-цинальными видами. Однако более объективное заключение можно будет сделать только на основании сравнительных фармакологических исследований.
Выводы
На основании качественных реакций в листьях толокнянки, брусники, черники, голубики и зимолюбки, произрастающих на территории Республики Саха (Якутия), подтверждено наличие фенольных соединений, в том числе флавоноидов, дубильных веществ и арбутина. Присутствие арбутина доказано хроматографически в сравнении с достоверным образцом.
Наибольшее содержание арбутина отмечено в листьях толокнянки и зимолюбки. Листья черники и голубики содержат арбутина меньше, но вполне могут рассматриваться как потенциальные источники арбутинсодержащих препаратов и рекомендованы для фармакологических исследований.
Определение арбутина различными методиками показало, что его содержание зависит от степени очистки извлечения, полученного из сырья, поэтому при разработке методов стандартизации лекарственного сырья арбутинсодержащих видов следует выбирать методики, позволяющие получать наиболее объктив-ные результаты.
Список литературы
1. Растения для нас: справочное издание / под ред. Г.П. Яковлева и К.Ф. Блиновой. М., 1996. 653 с.
2. Машковский М. Д. Лекарственные средства: в 2 т. М., 2000. Т. 1. 540 с.
3. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Paeo-niaceae - Thymelaeaceae. Л., 1985. 336 с.
4. Муравьева Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г.П. Фармакогнозия. М., 2002. 654 с.
5. Государственная фармакопея СССР. 11-е изд.- М., 1989. Вып. 2. 400 с.
6. Гринкевич Н.И., Сафронич Л.Н. Химический анализ лекарственных растений. М., 1983.174 с.
7. Браиловская В.А., Лукьянчикова Г.И. Фотоколориметрическое определение арбутина в листьях толокнянки // Фармация.1972. №3. C. 31-32.
8. Лубсандоржиева П.Б., Жигжитов Б.С., Даргаева Т.Д., Базарова Ж.Г., Нагаслаева Л.А. Хроматоспектрофотометрическое определение арбутина в листьях Bergenia crassifolia (L.) Fritsch // Химико-фармацевтический журнал. 2000. Т. 34. №5. С. 38-41.
9. А.с. SU 1582090 A1. Способ количественного определения арбутина в лекарственном растительном сырье / Мазулин А.В., Калошина Н.А. и Денисенко О.Н. / Б.И. 1990. №28.
Поступило в редакцию 19 марта 2005 г.
