CC BY
58
Примечание: жирным шрифтом выделены корреляции наибольшей тесноты. БТу, Лгу, БУу, Уу - вероятности появления дислокации сегмента БТ, аритмического синдрома в целом, наджелудочковой и желудочковой экстрасистолии, соответственно.
В 2-й группе в отличие от 1-й выборки общая сумма г по модулю оказалась несколько большей и составила 6,99. Корреляции с отрицательным знаком также встречались существенно чаще - 8 из 12 (75%).
Высокая степень связи в группе больных АК имела место в 5 сопоставлениях, причем максимально эта особенность была выражена именно в отношении дислокации сегмента 8Т, поскольку кривые всех 3 анализируемых показателей структуры аттрактора энтропии кардиоритма были связаны с динамикой вероятности этого феномена с величинами г более 0,8. Тогда как средний г по всем 12 сопоставлениям был, как и в группе больных ИБС только 0,58+ 0,32. Близкую по смыслу картину зависимости клинических проявлений от особенностей состояния системной организации регулирования получили при исследовании корреляций динамики временного распределения не только вероятностных, но и количественных характеристик степени выраженности конкретной симптоматики заболеваний (в частности, аритмического синдрома) с параметрами ат-тракторной энтропийной модели гомеокинеза, усредненных в исследуемых группах. Результаты представлены в табл. 5 и 6. Из табл. 5 следует, что средний г рассматриваемых явлений оказался равным 0,67+ 0,21.
При этом 5 из 9 связей были наибольшей тесноты (55,5%). Отрицательные корреляции выявлены только в 3 из 9 сопоставлений (33,3%). Как следует из второй части табл. 5, анализ данных, проведенный в рамках тех же процедур, в перерасчете на 1 больного из группы ИБС, имеющего клинические проявления аритмического синдрома, подтвердил закономерности характеризующие группу в целом. В группе АК особенности взаимосвязей между функциональным состоянием регуляторной сферы и клинической симптоматики выглядели иначе (табл. 6). Средний коэффициент корреляции исследуемых процессов был достоверно выше, чем в 1 -й выборке и составил
0,85+ 0,09 против 0,67+ 0,21 (Р<0,05).
В целом количество тесных связей было почти максимальным 8 из 9 (88,9%), при этом отри-
цательные связи выявлялись в 2 раза чаще - в 66,6% случаев. Как и в 1-й группе, анализ данных в расчете на 1 больного также подтвердил все эти отличительные особенности.
Таким образом, феномен связанности кривых временного (за 24-часовой период наблюдения) распределения клинической симптоматики поражения сердца при ИБС и АК с динамикой показателей состояния организации системного гомеостатического регулирования, охарактеризованного с помощью его энтропийной аттракторной модели, очевиден. Вместе с тем установлен также и тот факт, что у больных АК данная закономерность выражена достоверно в большей степени, чем у лиц с ИБС. По такому параметру, как вероятность дислокации сегмента БТ относительно изолинии, во 2-й группе имело место практически полное совпадение динамики анализируемых процессов. Это свидетельствует в пользу того, что существенная доля клинических проявлений АК определяется преходящими влияниями функциональных механизмов, триггером для которых является вариабельный фактор экзотоксикоза воздействующего не только на клеточном метаболической уровне в мокарде, но как мощный модулятор динамичных вегетативных регуляторных влияний. В случае ИБС изменения ЭКГ во многом определяются непосредственными конкретно-соматическими механизмами (постоянным наличием атеросклеротического поражения сосудов), которые запускают в миокарде феномен ишемии, резко изменяющий метаболизм кардио-миоцитов и активность трансмембранных потоков ионов. Кроме того, как следует из вышеприведенных данных наиболее значимым для достижения поставленной в исследовании цели оказалось подтверждение возможности дифференцировать больных АК и ИБС со сходной дебютной клинической картиной при общем дефиците информации о заболевании по принципу выявления кардинальных особенностей в профилях временной “настройки” системного регулирования, формирующихся за счет кардинально отличающихся патогенетических механизмов коронаро-генной и некоронарогенной патологии сердца.
Таблица 5
Коэффициенты корреляций г кривых возникновения клинических синдромов у больных ИБС и динамики показателей аттракторной модели гомеокинеза за 24-часовой период мониторинга кардиоритма
1 группа (ИБС) N М1 Ms
Аг 0,44 0,96 -0,94
8у 0,04 0,91 -0,79
V 0,94 0,44 -0,62
Аг1* 0,78 0,84 -0,93
8у1* 0,35 0,97 -0,92
VI* 0,88 0,65 -0,79
Примечание: жирным шрифтом выделены корреляции наибольшей тесноты. Ar, SV, V - количество эпизодов аритмического синдрома в целом, наджелудочковой и желудочковой экстрасистолии, соответственно; показатели с * - перерасчет на 1 больного с данным синдромом.
Таблица 6
Коэффициенты корреляций r кривых возникновения клинических синдромов у больных 3 группы и динамики показателей аттракторной модели гомеокинеза за 24-часовой период мониторинга кардиоритма
N М1 Ms
Ar -0,92 0,71 -0,9
Sv -0,94 0,8 -0,92
V -0,91 0,69 -0,89
Ar1* -0,94 0,76 -0,91
Sv1* -0,82 0,96 -0,74
V1* -0,92 0,7 -0,89
Примечание: жирным шрифтом выделены корреляции наибольшей тесноты. Ar, SV, V - количество эпизодов аритмического синдрома в целом, наджелудочковой и желудочковой экстрасистолии, соответственно; показатели с * - перерасчет на 1 больного с данным синдромом.
Проведенное исследование позволяет сделать следующие выводы: 1. Аттракторная энтропийная модель организации синусового кардиоритма в количественном выражении характеризует динамические особенности системного гомеостатического регулирования.
2. Суточные тренды параметров аттракторной модели гомеокинеза в группах больных с ИБС и АК представляют собой сегменты колебательных функций с экстремумами, координаты которых на временной оси достоверно отличаются, свидетельствуя о специфике в настройке системных регуляторных механизмов, связанной с различиями в патогенетических механизмах коронаро-генных и некоронарогенных заболеваний миокарда.
3. Синдромно-сходные клинические проявления ИБС и АК, развиваясь на фоне достоверно отличающихся суточных профилей системного гомеокинеза, также имеют дифференцируемую временную специфику вероятности выраженности.
4. Наличие количественных особенностей временной организации системного гомеокинеза, выявленных с помощью суточного мониториро-вания синусового кардиоритма путем анализа ат-тракторной энтропийной модели его структуры,
может служить дополнительным критерием дифференциальной диагностки ИБС и АК в дебюте госпитализации при сходной клинической картине и дефиците информации о больных.
ЛИТЕРАТУРА
1. Захаров И.С., Ильин С.И., Довгаль В.М., Сараев И.А. Хаотическая система: автоматная модель // Телекоммункации. - 2007. - № 12. - С. 2-9.
2. Моисеев В.С., Моисеев С.В., Кобалава Ж.Д. Алко-
гольная болезнь сердца. В кн: Болезни сердца. -М.: ООО “Медицинское информационное
агентство”, 2008. - С. 422-434.
3. Моисеев В.С., Шелепин А.А. Алкогольные кардиальные синдромы // Практикующий врач. -2006. -№ 1. - С. 22-26.
4. Паркер Т.С., Чжуа Л.О. Введение в теорию хаотических систем для инженеров // ТИИЭР. - 1987. -Т. 75, № 8. - С. 6-40.
5. Руксин В.В. Неотложная кардиология - СПб.: Невский Диалект; М.: БИНОМ. Издательская группа “ГОЭТАР - Медиа”, 2007. - 512 с.
6. Hare J. The cardiomyopathies Alcocholic cardiomyopathy // In Braunwld Heart Disease. Saunders, 2008. -P. 1744.
7. Thun M. et al. Alcohol consumption and mortality among US adults // N.Engl. J. Med. - 1997. -Vol. 337. - P. 1705.
Клиническая медицина УДК 616-006.66
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕРВИЧНЫХ КАРЦИНОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ РАЗЛИЧНЫХ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ТИПОВ И ИХ МЕТАСТАЗОВ В РЕГИОНАРНЫХ ЛИМФОУЗЛАХ
© Должиков А.А., Чурносов М.И., Луговая О.В., Мухина Т.С., Луговской С.Л., Пасенов Н.З., Быков П.М.
Научно-образовательный центр прикладной иммуноморфологии и цитогенетики, Белгород;
кафедра медико-биологических дисциплин Белгородского государственного национального исследовательского университета, Белгород
E-mail: ihcdaa@mail.ru
Проведен сравнительный анализ иммунофенотипов и молекулярно-биологических вариантов первичных карцином молочной железы и их метастазов в регионарных лимфатических узлах. Исследование выполнено на материале 127 случаев метастатического рака молочной железы. В значительном числе случаев выявлены различия в экспрессии молекулярных маркеров в первичных и метастатических опухолях. Определение рецепторного статуса опухолевых элементов в лимфатических узлах может быть более точной характеристикой биологического потенциала опухоли, необходимой с клинической целью при назначении адъювантной терапии.
Ключевые слова: рак молочной железы, метастазы, молекулярно-биологические варианты.
COMPARATIVE IMMUNOMORPHOLOGICAL STUDY OF PRIMARY CARCINOMAS OF THE BREAST OF DIFFERENT MOLECULAR-GENETIC TYPES AND THEIR METASTASES IN THE REGIONAL LYMPH NODES Dolzhikov A.A., Churnosov M.I., Lugovaya O. V., Mukhina T.S., Lugovskoy S.L., Pasenov N.Z., Bykov P.M.
Scientific-Educational Centre of Applied Immunomorphology & Cytogenetic, Belgorod;
The Department of Biomedical Sciences of the Belgorod State National Research University, Belgorod The comparative analysis of immunophenotypes and molecular-biologic variants of primary breast carcinomas and metas-tases in the regional lymph nodes was performed. The investigation was made on 127 cases of metastatic breast cancer. A significant number of patients show discordant expression of molecular markers between primary and metastatic tumors. Lymph node receptor status could be a more accurate measurement for administering adjuvant therapy in a clinical trial.
Keywords: breast cancer, metastases, molecular-biologic types.
Одним из наиболее значимых факторов прогноза рака молочной железы является наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах, а также молекулярно-биологические свойства опухолевых клеток. Основными среди последних являются рецепторный статус - экспрессия рецепторов эстрогенов (ER) и прогестерона (PgR), и рецепторов эпидермального фактора роста II типа - белка Heг-2/neu [1, 2]. Современные рекомендации по лечению рака молочной железы основаны на ясном понимании его биологической гетерогенности, что определяет необходимость выделения молекулярно-биологических типов с целью адекватной индивидуализированной терапии. Поскольку мультигенное тестирование не является рутинной процедурой, в том числе вследствие высокой стоимости, основное значение имеет использование зарекомендовавших себя иммуногистохимических маркеров, упомянутых выше, а также определение уровня пролиферации по экспрессии ядерного белка Ю67 [2]. Однако при иммуногистохимическом исследовании рецепторного статуса и экспрессии Heг-2/neu используется материал первичной опухоли. Определенных рекомендаций в отношении необходимости иммуноморфологического исследования
лимфоузлов при наличии в них метастазов не существует. Теоретически клеточные элементы метастазов представляют собой наиболее агрессивный клон опухолевых клеток и логичнее обращать внимание именно на них, как на потенциально циркулирующие в организме и являющиеся мишенью для адъювантной терапии, поскольку первичная опухоль уже удалена. В зарубежной литературе имеются исследования, посвященные данной проблеме, которые не во всех случаях дают однозначные выводы, в том числе по причине различий в исследованных выборках. Наиболее крупное исследование выполнено Aitken 8Л. и соавт. [3]. Авторы выявили различия иммунофенотипа первичных опухолей и их метастазов минимум по одному из маркеров в 46,9% случаев. Исчезновение экспрессии рецепторов эстрогенов в метастазах выявлено в 18,0%, рецепторов прогестерона в 14,6%, ER-позитивные метастазы при негативной первичной опухоли обнаружены в 10,3%, PgR-позитивные метастазы в 8,8%. Только в 1,5% случаев обнаружены Heг2/neu отрицательные метастазы при гиперэкспрессирующей первичной опухоли. Данные ранее выполненных работ [4 - 14] не по всем показателям сходны друг с другом.
Целью выполненного исследования явился сравнительный анализ рецепторного и Нег-2/пеи статуса первичных карцином молочной железы и их метастазов в подмышечных лимфоузлах с учетом молекулярно-генетических типов, выделяемых на основе иммунофенотипических особенностей опухолевых клеток.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
За период с 2008 по 2001 годы изучен материал 127 случаев рака молочной железы, в которых имелось метастатическое поражение подмышечных лимфоузлов, из диагностического архива отделения онкоморфологии ОГУЗ особого типа «Белгородское патологоанатомическое бюро». Возраст пациенток варьировал от 42 до 67 лет. Выполнено стандартное патогистологическое исследование и иммуногистохимическое исследование для определения уровня экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона и Нег-2/пеи. Иммуногистохимическое исследование проведено по стандартному протоколу с высокотемпературной демаскировкой антигенов (40 минут при 98о) в цитратном буфере при рН=6,0 (при исследовании экспрессии Нег-2/пеи) или трис-ЭДТА буфере при рН=9,0 (при исследовании рецепторов эстрогенов и прогестерона). Использованы моноклональные антитела против рецепторов эстрогенов (клон БР-1; СеПМащие) и прогестерона (клон БР-2; СеПМащие), поликлональные антитела против Нег-2/пеи (Бако). Демаскировку выполняли в комбинированных буферах с функцией депара-финизации в автоматическом модуле для обработки срезов. Окраску выполняли с помощью роботизированной системы - автостейнера «АШо-staineг 480Б» (Великобритания). Полученные
микропрепараты сканировали с помощью системы для сканирования и анализа изображений «MiraxDesk» (CarlZeiss; Германия). На основании результатов исследования выделяли молекулярно-генетические типы (подтипы) рака молочной железы: люминальный А (ER+ и/или PgR+, Her2/neu-), люминальный В (ER+ и/или PgR+, Her2/neu+), тройной негативный (ТНРМЖ) и Her2/neu - гиперэкспрессирующий (ER-, PgR-, Her2/neu+). Последующий анализ производили как путем традиционной микроскопии, так и на сканированных электронных изображениях. Оценку уровня экспрессии производили по общепринятой шкале Allred с градацией от 0 до 8 баллов. Полученные балльные оценки мы условно разделили на 4 группы: отрицательно (0 - 2 балла), низкий уровень экспрессии (3 - 4 балла), средний (5 - 6 баллов), высокий (7 - 8 баллов). Оценку экспрессии Her-2/neu осуществляли по принятому диагностическому алгоритму с уровнем гиперэкспрессии белка (3+) при интенсивном непрерывном окрашивании мембран более чем в 30% клеток. Количественные данные обрабатывали методами непараметрической статистики с использованием критерия %2.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В исследованной нами выборке в целом опухоли с позитивным ER статусом без учета уровня экспрессии рецепторов наблюдались в 72,4%, PgR-позитивные в 60,7% случаев. В метастазах вне связи с иммунофенотипом первичной опухоли уровни экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона оказались недостоверно ниже, составив 69,3% и 58,2% клеток соответственно. Her-2/neu статус практически не изменился (табл. 1).
Таблица 1
Уровни экспрессии иммунофенотипических маркеров в первичной опухоли и в метастазах в регионарных лимфоузлах
Маркер Уровень экспрессии Первичная опухоль, абс. (%) Метастазы в лимфоузлах, абс. (%)*
ER Отрицательно 35 (27,6) 39 (30,7)
(n=127) Низкий 26 (20,5) 32 (25,2)
Средний 34 (26,7) 37 (29,1)
Высокий 32 (25,2) 19 (15,0)
PgR Отрицательно 50 (39,3) 53 (41,8)
(n=127) Низкий 26 (20,5) 34 (26,7)
Средний 35 (27,6) 26 (20,5)
Высокий 16 (12,6) 14 (11,0)
Her2/neu 0 41 (32,3) 47 (37,0)
(n=127) 1+ 61 (48,0) 52 (40,9)
2+ 13 (10,2) 16 (12,6)
3+ 12 (9,5) 12 (9,5)
Примечание: *Вне связи с иммунофенотипом первичной опухоли.
Однако при анализе по отдельным группам с учетом иммунофенотипа и выделяемых на его основе молекулярно-генетических вариантов РМЖ, в сопоставлении первичных опухолей и их метастазов в лимфоузлах выявлены особенности в различных группах.
В группе с ER-отрицательным статусом (0-2 балла по Allred) идентичный иммунофенотип метастазов выявлен в 68,6% случаев, в 25,7% он изменился на низкий уровень экспрессии, только в 5,7% обнаружен средний уровень содержания рецепторов эстрогенов в метастазах. При всех вариантах положительного рецепторного статуса экспрессия ER в метастазах была ниже, однако выявлена прямая связь с иммунофенотипом первичной опухоли. При низком уровне экспрессии ER рецептор-позитивные метастазы наблюдались в 76,9%, при среднем - в 76,5%, при высоком - в 96,9%. Однако в последней группе только в 50% сохранился исходный иммунофенотип опухоли. ER-отрицательные метастазы при положительном рецепторном статусе первичных опухолей составили в целом 16,3%.
Экспрессия рецепторов прогестерона в метастазах изменялась сходным образом. В группе PgR-отрицательных первичных опухолей рецеп-тор-негативные метастазы составили 78%. При положительном рецепторном статусе прямая зависимость иммунофенотипа метастазов проявилась более отчетливо: при низком уровне PgR в первичной опухоли рецептор-позитивные метастазы были в 65,4%, при среднем - в 88,6%, при высоком - в 93,8%. Даная динамика закономерна, так как экспрессия рецепторов прогестерона отражает присутствие и функциональную полноценность рецепторов эстрогенов. Также только в 50% наблюдений сохранился высокий уровень PgR в метастазах. PgR-отрицательные метастазы при положительном рецепторном статусе первичной опухоли составили 18,2%.
Исходя из современных представлений, что даже 1% рецептор-позитивных клеток может считаться положительным результатом с точки зрения назначения гормональной терапии и вероятности ответа на нее опухоли, можно считать, что при отрицательном ER статусе целесообразным является исследование и лимфатических узлов, пораженных метастазами. С дискордантностью иммунофенотипа первичной опухоли и метастазов можно, вероятно, связать и другой известный факт - нечувствительность определенного числа рецептор-позитивных опухолей к гормональной терапии и, напротив, гормональную чувствительность рецептор-отрицательных опухолей. В данных случаях следует, видимо, вести речь не о чувствительности первичной опухоли, а о циркулирующих и метастатических клонах клеток, им-
мунофенотип которых отличается от опухолевого очага.
Нег2/пеи-статус является наименее изменчивым в метастазах РМЖ. При отсутствии гипер-экспресии данного белка (0, 1+) только в 1 наблюдении из 41 иммунофенотип изменился на 2+. Однако данный результат не означает наличия амплификации гена Нег2/пеи и может не иметь биологического значения, что требует цитогенетического анализа. С другой стороны, в группе с результатами 2+ в первичной опухоли в метастазах в 7 случаях из 13 результат сохранился, в 3 был отрицательным, в 3 выявлена гиперэкспрессия Нег2/пеи. В группе с гиперэкспрессией данного онкопротеина ни в одном случае не было отрицательного результата в метастазах, в 66,7% результат был идентичен первичной опухоли, в 33,7% реакция была на уровне 2+, который также требует цитогенетического анализа наличия или отсутствия амплификации гена Нег2/пеи. Таким образом, в метастазах не происходит трансформации РМЖ агрессивного Нег2/пеи гиперэкспрессирующего иммунофенотипа в более благоприятные Нег2/пеи отрицательные.
Некоторые особенности выявлены нами при анализе на основе молекулярно-генетических вариантов, выделяемых по иммуногистохимиче-ским маркерам. При этом люминальные типы А и В мы объединили в одну группу (табл. 2). Анализ показывает, что при люминальных типах в метастазах в 9,1% случаев произошла прогрессия в более злокачественный ТНРМЖ, при единичном Нег2/пеи гиперэкспрессирующем метастазе в первичной опухоли был средний уровень экспрессии ER, низкий уровень PgR и пограничный уровень (2+) Нег2/пеи. Трансформация тройного негативного РМЖ (ТНРМЖ) в более благоприятные люминальные типы выявлена в 8 наблюдениях из 21 (38,1%), что соответствует описанной нами выше дискордантности по экспрессии рецепторов. Изменение типа опухоли в метастазах достоверно чаще выявлено при этом типе карциномы. ТНРМЖ является генетически и иммунофенотипически гетерогенным, в частности включает в себя базальный/базалоидный рак, требующий отдельной верификации внутри группы ТНРМЖ. Однако необходимая дополнительная панель маркеров в настоящее время не принята экспертами для рутинной практики [2]. Тем не менее полученные нами результаты свидетельствуют о целесообразности исследования метастазов в лимфоузлах при рецептор-отрицательных карциномах молочной железы.
Метастазы с профилем люминальных типов при ТНРМЖ типе первичной опухоли в 7 случаях из 8 были представлены люминальным типом А с низкими уровнями экспрессии рецепторов эстро-
