CC BY
33
факторами возникновения болезней являются нарушения условий содержания и кормления животных.
ЛИТЕРАТУРА
1. Белкин, Б. Л. Болезни молодняка свиней с респираторным синдромом: диагностика, лечение и профилактика / Б.Л. Белкин, В.С. Прудников, Н.А. Малахова. - Орел: Изд-во ОрелГАУ, 2006. - 122 с.
2. Болезни сельскохозяйственных животных / П.А. Красочко [и др.]; науч. ред. П.А. Красочко. - Минск: Бизнесофсет, 2005. - 800 с.
3. Бочев, И. Комплекс респираторных болезней свиней: обзор. I. Этиология, эпизоотология, клинические формы и патологоанатомические черты / И. Бочев // Всероссийский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. - 2008. - № 1. - С. 16-20.
4. Орлянкин, Б.Г. Инфекционные респираторные болезни свиней / Б.Г. Орлян-кин, Т.И. Алипер, Е.А. Непоклонов // Ветеринария. - 2005. - N° 11. - С. 3-6.
5. Проблемы профилактики респираторных болезней свиней бактериальной этиологии / В.С. Русалеев [и др.] // Ветеринария. - 2006. - № 7. - С. 18-21.
6. Прудников, В.С. Методические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике инфекционных болезней свиней с респираторным синдромом / В.С. Прудников, П.П. Антанович, М.В. Казючиц. - Витебск: ВГАВМ, 2010. - 56 с.
7. Прудников, В.С. Роль патоморфологических исследований в диагностике инфекционных болезней животных при ассоциативном течении / В.С. Прудников // Учеб. записки УО «ВГАВМ». - Витебск, 2005. - Т. 41. - Вып. 2. - Ч. 1. - С. 46-47.
8. Taylor, D.J. Pig diseases. Third edition / D.J. Taylor // Cambridge. - Great Britain, 1983. - 247 p.
УДК 619:616.98:578.823.2:636.5
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА СПОСОБОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РЕОВИРУСА ТЕНОСИНОВИТА ПТИЦ
И.С. РАДЮШ, А.А. ГУЛЯКО, И.В. НАСОНОВ РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского» г. Минск, Республика Беларусь, 220003
(Поступила в редакцию 27.01.2012)
Введение. Реовирусный теносиновит птиц - вирусное контагиозное заболевание птиц, характеризующееся поражением синовиальной оболочки, сухожильного влагалища, высокой ранней смертностью, отставанием в росте, слаборазвитым оперением, снижением яйценоскости и выводимости [3, 4, 11].
Восприимчивость к инфекции зависит от штамма возбудителя, степени его вирулентности, способа заражения, возраста и производственной направленности птиц. Заболевание чаще регистрируют среди цыплят мясного направления. Наиболее чувствительными являются суточные цыплята, с возрастом их восприимчивость снижается [3, 11].
Источником инфекции является больная и переболевшая птица [3]. Факторами передачи возбудителя служат инфицированный помет, вода, корма, инвентарь, предметы ухода и скорлупа, оставшаяся после инкубации. Заболевание передается контактно при совместном содер-
214
жании больных цыплят со здоровыми, алиментарно - через зараженные вирусом корм и воду, трансовариально - через инкубационное яйцо в течение 19 суток после инфицирования кур-несушек [4, 12].
Заболевание протекает остро, подостро у цыплят и хронически у взрослых кур. Симптомы болезни тесно связаны с возрастом больной птицы. У 10 % цыплят в возрасте 3-4 недель наблюдают хромоту, отход составляет около 1 % [6]. В начальной стадии заболевания отмечают выраженный отек сухожильных влагалищ, сгибателей фаланг пальцев и сухожилий голеноплюсного сустава одной или обеих ног. Эти поражения легко устанавливают при пальпации непосредственно над голеноплюсневым суставом [9]. Отек самих суставов наблюдают реже. У мясных цыплят 5-недельного возраста и яичных кур 910-месячного возраста развиваются билатеральные опухоли сгибателей сухожилий голеностопных суставов [5]. При длительном заболевании, переходящем из острой формы в подострую, пораженные сухожилия отвердевают, становятся волокнистыми, в результате нарушается их функция. Птица начинает хромать, передвигается с большим трудом, что приводит к снижению потребления корма, воды, к потере массы тела и в конечном итоге к гибели. При хроническом течении наблюдают разрыв голеностопных сухожилий [3].
У взрослых кур снижается яйценоскость на 15-20 %, появляются яйца с деформированной скорлупой, развивается асептическое проли-феративное воспаление сухожилий конечностей [6]. Поражение суставов у петухов в племенных хозяйствах вызывает снижение их половой активности и процента оплодотворяемости яиц [3].
При реовирусном теносиновите патологоанатомические изменения локализуются главным образом в области скакательного и голеноплюс-невых суставов конечностей. На раннем этапе заболевания макроскопические изменения включают выраженный отек сухожильных влагалищ предплюсневого и плюсневого суставов. При остром течении в суставных полостях обнаруживают экссудат соломенного или красного цвета. На дистальной части большеберцовой кости наблюдают эрозии хрящей и кровоизлияние в синовиальной оболочке [2].
При хроническом течении синовиальная оболочка резко утолщена и обызвествлена. Разрыв сухожилий мышц вызывает кровоподтеки в подкожной клетчатке и некроз сухожилий в местах их разрыва [4].
Вируснейтрализующие антитела выявляют на 7-10-е сутки после контакта организма с возбудителем, а вируспреципитирующие - на 720-е сутки [7].
В связи с широким распространением реовирусов в природе и присутствием их даже у клинически здоровых птиц, случаи заболевания, вызванные данным возбудителем, регистрируют по всему миру [3, 4].
Экономические потери в промышленном птицеводстве, причиняемые реовирусной инфекцией, значительны и связаны с гибелью птиц, низкими привесами и оплатой корма, снижением категорийности тушек, повышенной выбраковкой, расходами на проведение ветеринар-
215
но-санитарных мероприятий при борьбе с этой болезнью. В племенных хозяйствах снижается половая активность петухов, что приводит к снижению оплодотворяемости и выводимости инкубационных яиц [3].
Для специфической профилактики теносиновита кур используют живые и инактивированные вакцины [1, 13]. Для создания напряженного иммунитета в родительском стаде применяют инактивированную вакцину. Для вакцинации цыплят применяют живую вакцину. Вакцину готовят из вируссодержащей жидкости, которую получают путем культивирования вируса в куриных эмбрионах или различных культурах клеток (культурах фибробластов, легких, почек и печени эмбрионов кур, культуре перевиваемой линии клеток почки зеленой мартышки (Vero), BHK-21) [1, 2, 13, 15].
При заражении штаммом реовируса «S-1133» 9-11-суточных куриных эмбрионов в аллантоисную полость и 7-8-суточных в желточный мешок титр вируса на 5-е сутки составляет 6,25-7,0 lg ЭИД50/см3 при температуре культивирования 37 °С. При этом образуются единичные, выпуклые, неправильной формы, различные по величине бляшки на аллантоисной оболочке со стороны воздушной камеры эмбриона [14].
Штамм реовируса «S-1133» репродуцируется в культуре клеток эмбрионов, вызывая острую форму инфекции с выраженным цитопати-ческим эффектом через 2-4 суток и накапливается в титрах 6,25-7,0 lg ТЦД50/см и в перевиваемых линиях ВНК-21, BGM, Vero. Инфекционный титр вируса в культуральной жидкости достигает 5-7 lg ТЦД50/см3 на 4-5-е сутки культивирования при температуре 37 °С [14, 16].
Для практического птицеводства при изготовлении вакцин против теносиновита птиц в промышленном масштабе необходимо выбрать оптимальный метод культивирования реовируса для получения максимального количества вируссодержащей жидкости, обладающей высокой защитной активностью и в то же время имеющей низкую себестоимость.
Цель работы - провести сравнительную оценку способов культивирования вируса теносиновита птиц и выбрать оптимальный для дальнейшего изготовления живой вакцины.
Материал и методика исследований. В опытах использовался штамм реовируса теносиновита птиц «КМИЭВ^118». Вирус культивировали на СПФ-эмбрионах кур, первичной культуре ФЭК и культуре клеток Vero.
Заражение вирусом СПФ-эмбрионов проводили в аллантоисную полость в количестве 0,2 см3 по общепринятой методике [8, 10]. Инфицированные и контрольные эмбрионы инкубировали при температуре 37-38 °С и относительной влажности 60-70 % в течение 5 суток, проводя ежедневную овоскопию. Гибель в первые 24 ч считали неспецифической. По истечении инкубационного периода зараженные эмбрионы выдерживали в течение 10-12 ч при температуре 4 °С для остановки кровообращения.
От павших эмбрионов и оставшихся живыми, но имеющими патологические изменения (отечность хориоаллантоисной оболочки (ХАО); отставание эмбрионов в росте и развитии; кровоизлияния в области затылка, спины, конечностей; патологоанатомические изменения внутренних органов), собирали вируссодержащий материал: ХАО и экстраэмбриональную жидкость. Полученный материал измельчали с помощью гомогенизатора. Осветляли центрифугированием при 3000 g. Проводили контроль вируссодержащего материала на стерильность и отсутствие гемагглютинации.
Титр вируса рассчитывали по методу Кербера в модификации Аш-марина [10].
Для получения ФЭК использовались куриные СПФ-эмбрионы 11-12-суточного возраста, которые предварительно просматривали на овоскопе, отбирая яйца с подвижными эмбрионами и с хорошо выраженными сосудами.
Яйца вскрывали, извлекали эмбрионы и переносили их в чашку Петри, удаляли голову и внутренние органы. Полученную ткань промывали раствором Хенкса с антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/см3 и 100 мкг/см3 соответственно). Затем ткань измельчали ножницами на кусочки величиной 1-3 мм.
Измельченную ткань отмывали в растворе Хенкса и трипсинизиро-вали в двойном объеме 0,25%-ного раствора трипсина (37 °С) до полного истощения ткани. Клеточную суспензию в трипсине фильтровали с последующим центрифугированием при скорости 1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливали, а осадок клеток ре-суспензировали в питательной среде с добавлением 10 % сыворотки крупного рогатого скота. Посевная концентрация клеток составляла 800 тыс. в 1 мл среды.
В качестве ростовой среды использовали среды Игла и ГЛА в соотношении 1:1 с добавлением 10 % сыворотки крупного рогатого скота, а также пенициллина (100 ЕД/см3) и стрептомицина (100 мкг/см3). Концентрацию водородных ионов до 7,0-7,2 доводили раствором двууглекислого натрия с массовой долей 7,5.
Клеточный монослой образовывался на 2-е сутки. Отбирали матрасы со 100%-ным монослоем и инфицировали вирусом с множественностью заражения 0,1-0,5 ТЦД/кл, выдерживали при температуре (37,5±0,5) °С в течение часа для контакта вируса с клеткой, после чего вносили поддерживающую среду. В качестве поддерживающей использовали аналогичные среды с 2 % сыворотки крови. Зараженную культуру культивировали при температуре (37,5±0,5) °С.
Культуру клеток Vero после 48 ч культивирования со 100%-ным монослоем инфицировали вирусом с множественностью заражения 0,1-0,5 ТЦД/кл, выдерживали при температуре (37,5±0,5) °С в течение часа для контакта вируса с клеткой. В качестве поддерживающей использовали среды DMEM и DMEM-HEPES в соотношении 1:1 с добавлением 2 % эмбриональной телячьей сыворотки. Зараженную культу-
217
ру культивировали при температуре (37,5±0,5) °С. Через 40-48 ч наблюдалось характерное для реовируса ЦПД с последующим разрушением монослоя клеток.
Результаты исследований и их обсуждение. На 4-6-е сутки после заражения СПФ-эмбрионов кур наблюдалась гибель инфицированных эмбрионов.
При вскрытии эмбрионов отмечались следующие изменения: отечность и некроз со стороны ХАО, эмбрионы мелкие, недоразвитые, в области затылка, спины и конечностей наблюдались кровоизлияния. Патологоанатомические изменения внутренних органов: печень глинистого цвета с очагами некроза, точечными кровоизлияниями, дегенерация миокарда в виде «вареного мяса», увеличение почек. Контроль: эмбрионы в 1,5-2 раза крупнее эмбрионов, зараженных вирус-содержащим материалом. ХАО прозрачная, бледно-розовая с четко выраженными кровеносными сосудами. Экстраэмбриональная жидкость прозрачная со слегка желтоватым оттенком.
Экспериментальный образец вакцины готовили из измельченной ХАО и экстраэмбриональной жидкости, разливали во флаконы, закрывали стерильными резиновыми пробками и хранили при -20 °С. Биологическая активность данного экспериментального образца вакцины составляла 6,5 lg ЭИД 50/см3.
После инфицирования ФЭК-вирусом через 24-48 ч наблюдалось характерное для реовируса ЦПД: появление в цитоплазме пораженных клеток оксифильной зернистости, образование гигантских многоядерных клеток - синцитиев, появление в монослое «стерильных пятен» (участки без клеток); а затем полное «сползание» клеток со стекла, в среде плавали гигантские клетки.
Для получения экспериментального образца вакцины после культивирования реовируса на ФЭК проводили последовательное замораживание и оттаивание культуры клеток. Вируссодержащую жидкость сливали, разливали во флаконы. Биологическая активность данного экспериментального образца вакцины составляла 6,25 lg ТЦД50/см3.
После инфицирования культуры клеток Vero реовирусом через 2448 ч наблюдались характерное для реовируса ЦПД, аналогичное ЦПД на культуре ФЭК. Экспериментальный образец вакцины получали из вируссодержащей жидкости путем последовательного замораживания и оттаивания культуры клеток. Биологическая активность данного экспериментального образца вакцины составляла 6,25 lg ТЦД 50/см3.
Заключение. Результаты исследований позволяют утверждать, что вирус теносиновита птиц для получения живой вакцины можно культивировать на СПФ-эмбрионах кур, культуре ФЭК и культуре клеток Vero, так как биологическая активность экспериментальных образцов вакцин практически одинакова. Однако использование СПФ-эмбрионов кур весьма ограничено тем, что их поставляют лишь несколько стран мира, а получение из них культуры ФЭК требует больших материальных затрат. К тому же качество культуры ФЭК и воз-
218
можность получения вируссодержащего материала на СПФ-эмбрионах очень сильно зависят от качества самих эмбрионов - они не должны быть мелкими, пересушенными, на скорлупе не должно быть микротрещин и т. д. Поэтому мы считаем наиболее оптимальным культивировать вирус на культуре клеток Vero.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бурдейная, Л.В. Разработка технологии изготовления живой вакцины против реовирусного теносиновита кур: дис. ... канд. вет. наук: 03.00.06 / Л.В. Бурдейная. -Владимир, 2001. - 113 с.
2. Болезни домашних и сельскохозяйственных птиц / Б.У. Кэлнек [и др.]; под общ. ред. Б.У. Кэлнека. - М.: Аквариум Бук, 2003. - 1232 с.
3. Болезни птиц: учеб. пособие / Б.Ф. Бессарабов [и др.]; под ред. Б.Ф. Бессарабова. -Москва, Краснодар: Лань, 2007. - 448 с.
4. Болезни сельскохозяйственных птиц: справочник: учебник для вузов / А.А. Лима-ренко [и др.]; под ред. А.А. Лимаренко. - СПб.: Изд-во «Лань», 2005. - С. 221-225.
5. Ветеринарная вирусология / В.Н. Сюрин [и др.]; под общ. ред. В.Н. Сюрина. - М.: Агропромиздат, 1992. - 524 с.
6. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин [и др.]; под общ. ред. В.Н. Сюрина. -М.: ВНТИБП, 1998. - 928 с.
7. Диагностика вирусных болезней животных / В.Н. Сюрин [и др.]; под общ. ред. В.Н. Сюрина. - М.: Агропромиздат, 1991. - 281 с.
8. Жавненко, В.М. Практикум по вирусологии / В.М. Жавненко, В.Н. Алешке-вич, В.И. Науменков; под ред. В.М. Жавненко. - Минск: ДизайнПРО, 1998. - 144 с.
9. Инфекционная патология животных: в 2 т. / редкол.: А.Я Самуйленко (гл. ред.) [и др.]. - М.: Академкнига, 2006. - Т. 2. - 1911 с.
10. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных: справочник / В.Н. Сюрин [и др.]; под общ. ред. В.Н. Сюрина. - М.: Агропромиздат, 1986. - 351 с.
11. Пругло, В.В. Течение реовирусного теносиновита кур в ассоциации с кокковыми инфекциями: дис. ... канд. вет. наук: 16.00.03 / В.В. Пругло. - СПб., 2005. - 139 с.
12. Реовирусная инфекция у птиц и меры борьбы с ней / Б.Б. Трефилов [и др.] // Новое в диагностике и профилактике болезней птиц: матер. науч.-практ. конф., Санкт-Петербург, Ломоносов, 3-4 июня 2008 г. / Российская академия сельскохозяйственных наук, Межрегиональный научно-технический центр «Племптица», Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства; редкол.: Э.Д. Джавадов [и др.]. - Санкт-Петербург, Ломоносов, 2008. - С. 98-111.
13. Шкиря, В.И. Технология изготовления инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц: дис. . канд. вет. наук: 16.00.03 / В.И. Шкиря. - Владимир, 2000. - 125 с.
14. Штамм «ВНИВИП-ДЕП» для получения вакцины против реовирусного теносино-вита кур: пат. 2158304 Российской Федерации, C 12 N 7/00, A 61 K 39/15, A 61 K 39/12, G 01 N 33/569 / Б.Б. Трефилов; заявитель Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства. - № 98108898/13; заявл. 24.04.98; опубл. 27.10.00 // Официальный бюл. N° 2 / Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам.
15. A comparison of avian and mammalian cell cultures for the propagation of avian reovi-rus WVU 2937 / V. Barta [et al.] // Avian Dis. - 1984. - Vol. 28. - P. 216-223.
16. Vaccination of Broder Breeders with a Tenosinosinovits Virus Vaccina / G.S. Edison [et al.] // Poultry Science. - 1979. - Vol. 58. - P. 1490-1497.
