CC BY
188
Химия растительного сырья. 2011. №4. С. 187-192.
УДК 615.322
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ ДУБИЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ В НЕКОТОРЫХ ВИДАХ РОДА GERANIUM L. ФЛОРЫ СЕВЕРО-ЗАПАДА
© К.Н. Разарёнова, Е.В. Жохова
Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия, ул. Профессора Попова, 14, Санкт-Петербург, 197376 (Россия), e-mail: caltha@mail.ru
Для некоторых видов рода герань флоры Северо-Запада проведен количественный анализ дубильных веществ пер-манганатометрическим, желатиновым и спектрофотометрическим методами. Установлено, что герань лесная, луговая и болотная являются наиболее перспективными объектами для дальнейших фармакогностических исследований, так как по литературным данным и в результате проведенных исследований показано, что они содержат наибольшее количество дубильных веществ и имеют достаточную сырьевую базу на Северо-Западе России. Для стандартизации сырья этих видов предложены методы перманганатометрии и спектрофотометрии как достаточно точные и менее трудоемкие.
Ключевые слова: герань, дубильные вещества, количественный анализ, Северо-Запад, перманганатометрический метод, желатиновый метод, спектрофотометрический метод.
Введение
Род герань Geranium L. насчитывает около 400 видов, распространенных по всему миру [1]. На территории России и сопредельных государств СНГ произрастает 70 видов данного рода [2].
На Северо-Западе России отмечены 10 видов гераней [3,4]. Из них наиболее часто встречаемые виды: герань луговая - G. pratense L., г. болотная - G. palustre L., г. лесная - G. sylvaticum L. s.l.. Остальные виды встречаются редко: г. кроваво-красная - G. sanguineum L., г. сибирская (заносное) - G. sibiricum L. s.l., г. круглолистная (заносное) - G. rotundifolium L., г. богемская - G. bohemicum L., г. красно-бурая - G. phaeum L. (в культуре редко встречается г. синеватая, рассматриваемая как подвид г. красно-бурой - G. lividum L' Her = G. phaeum subsp. lividum (L' Her) Pers.), г. маленькая - G. pusillum L., г. Роберта - G. robertianum L.
По литературным данным [5] все перечисленные виды содержат фенольные и терпеновые соединения, а также углеводы и органические кислоты. В наибольшей степени изучены фенольные соединения, и в видах рода герань, произрастающих на Северо-Западе, обнаружены фенольные кислоты и их производные, флавоноиды и дубильные вещества.
Имеются сведения об использовании указанных видов в народной медицине в качестве вяжущих и гемостатических средств при различного рода кровотечениях, а таких видов, как G. pratense, G. sanguineum, G. sibiricum, G. robertianum - еще и как противоспалительных агентов. Данные виды фармакологической активности обычны для растений, содержащих дубильные вещества [6].
Цели настоящего исследования: 1) проведение сравнительной оценки количественного содержания дубильных веществ в некоторых видах рода Geranium L. флоры Северо-Запада для выявления наиболее перспективных объектов для дальнейших фармакогностических исследований; 2) выбор оптимальной методики количественного определения дубильных веществ для стандартизации перспективного сырья.
Разработанные на сегодняшний день методы количественного анализа дубильных веществ основываются на нескольких принципах. Это, во-первых, осаждение дубильных веществ различными агентами (желатином, формалином, солями тяжелых металлов, гольевым порошком); во-вторых, окисление перман-ганатом калия, йодом; в-третьих, колориметрия с использованием окрашивания растворов фенольных соединений различными реактивами (молибдатом аммония, железо-тартратным реактивом), а также спек-трофотометрия при определенной длине волны (205 и 275 нм).
* Автор, с которым следует вести переписку.
В таблице 1 для девяти видов рода Geranium L. Северо-Запада приведены литературные данные по количественному анализу дубильных веществ следующими методами: перманганатометрическим, ком-плексонометрическим и осадительным.
Метод перманганатометрии рекомендован Государственной фармакопеей XI издания как основной метод определения дубильных веществ [14]. Однако метод имеет ряд недостатков: нечеткий переход окраски титруемого раствора, введение пересчетного коэффициента на китайский таннин, окисление перманганатом калия природных соединений, не относящихся к дубильным веществам [15]. Осадительные методы связаны со способностью дубильных веществ образовывать прочные связи с белками. Весовой метод с применением кожного (гольевого) порошка принят в качестве стандартного в кожевенной и дубильно-экстрактивной промышленности для оценки природных дубильных материалов. Хотя этот метод и характеризует основное свойство таннидов, он отличается громоздкостью и завышенными результатами (происходит дополнительная адсорбция на кожном порошке полисахаридов, некоторых фенольных соединений) [6]. Комплексонометри-ческий метод используется для количественного определения таннинов сумаха дубильного Rhus coriaria L. и скумпии кожевенной Cotinus coggygria Scop. [16]. Этот метод основан на способности дубильных веществ осаждаться солями тяжелых металлов. Выделившийся осадок отфильтровывают и обрабатывают определенным реагентом для переведения в раствор катионов металла, которые затем оттитровывают трилоном Б при определенном значении рН и в присутствии соответствующего индикатора [17].
Сравнение результатов количественного анализа дубильных веществ столь разными методами между собой нецелесообразно. Однако не удается обнаружить корреляцию между рядами числовых результатов перманганатометрического, комплексонометрического и осадительного методов, что, вероятно, связано с тем, что данные имеются не для всех рассматриваемых видов гераней и с тем, что результаты перманганатометрического и весового методов взяты у разных авторов (табл. 1). Таким образом, выбор наиболее перспективного вида для дальнейшего изучения на основании только литературных данных невозможен.
Таблица 1. Результаты количественного определения дубильных веществ (в процентах в пересчете
на абсолютно-сухое сырье) различными методами в видах рода герань флоры Северо-Запада (по литературным данным)
Вид и его анализируемая часть Методы количественного анализа дубильных веществ Литературный источник*
комплексонометри-ческий перманганатометри-ческий метод Левен-таля-Нейбауэра осадительный (осаждение гольевым, или кожным, порошком)
G. pratense, надземная часть 16,52 8,2 - 7, 8
G. pratense, подземная часть 31,56 17,1 27,8 - в корневищах; 7, 9, 10
31,7 - в корнях
G. palustre, надземная часть 19,75 - - 7
G. palustre, подземная часть 21,53 - 14,2 7, 10
G. sylvaticum, надземная часть 12,55 15,0 - 7, 8
G. sylvaticum, подземная часть 23,03 12,85 16,05 7, 10, 11
G. sanguineum, надземная часть 11,72 - - 7
G. sibiricum, надземная часть - 15,2 - 7, 8
G. robertianum, надземная часть 17,31 11,2 7 7, 12, 13
G. pusillum, надземная часть - 8,2 7,8 7, 12, 13
G. phaeum, надземная часть 19,94 - - 7
G. rotundifolium, надземная часть 16,11 - 6,85 7, 12
* См. список литературы
Экспериментальная часть
Объектами исследования служили образцы надземной части 8 видов рода герань, собранные в июне-августе 2009 г. в Ленинградской, Псковской и Новгородской областях: G. palustre, G. sylvaticum, G. pratense, G. sanguineum, G. robertianum, G. sibiricum, G. pusillum и G. lividum. Для G. palustre, G. sylvaticum и G. pratense исследовали также подземную часть (табл. 2). Заготовку сырья проводили по общим правилам заготовки сырья по морфологическим группам [18]: для надземной части видов - в фазу цветения и начала завязывания плодов растений, подземной - в фазу плодоношения. Образцы сырья, высушенные в тени на воздухе, измельчали и просеивали через сито с диаметром отверстий 2 мм.
Таблица 2. Перечень исследованных образцов видов рода Geranium
Вид, Место заготовки Дата Фаза развития
используемая часть заготовки растения
G.sylvaticum, Ленинградская обл., Всеволожский р-н, окр. Лемболово, 22.06.2009 цветение
надземная часть на опушке леса
G.sylvaticum, Новгородская обл., Батецкий р-н, окр. д. Передольская, 04.07.2009 плодоношение
подземная часть на лугу в зарослях кустарников
G.pratense, Ленинградская обл., Лужский р-н, д. Александровка, 27.06.2009 цветение
надземная часть на открытой лужайке у домов
G.pratense, Псковская обл., Себежский р-н, д.Осыно, на открытой 24.07.2009 плодоношение
подземная часть лужайке у домов
G.palustre, Ленинградская обл., Тихвинский р-н, д. Пашозеро, вдоль 15.07.2009 цветение
надземная часть канавы у домов
G.palustre, Псковская обл., Себежский р-н, д.Осыно, на сырой лу- 22.07.2009 цветение-
подземная часть жайке у домов плодоношение
G.sanguineum Псковская обл., Себежский р-н, окр. д.Осыно, на сухой 22.07.2009 цветение-начало
опушке соснового бора плодоношения
G.Robertianum Новгородская обл., окр. Пестово, сырой тенистый сме- 01.08.2009 цветение-начало
шанный лес плодоношения
G.sibiricum Новгородская обл., п. Пестово, у домов (заносное с восто- 02.08.2009 цветение-начало
ка России по железной дороге) плодоношения
G.pusiUum Псковская обл., Себежский р-н, д. Селявы, сорное в ого- 23.07.2009 цветение-начало
роде плодоношения
G.lividum Парк БИНРАН 15.06.2009 цветение
Для сравнительной оценки содержания дубильных веществ в указанных видах гераней мы использовали перманганатометрический метод Левенталя, перманганатометрический метод в сочетании с осаждением дубильных веществ желатином и спектрофотометрический метод.
Метод перманганатометрии в сочетании с осаждением дубильных веществ желатином подразумевает перманганатометрическое определение окисляемых компонентов в вытяжке до и после осаждения дубильных веществ желатином, а разница этих двух определений составляет количественное содержание дубильных веществ. В основе спектрофотометрического метода определения общего содержания полифенолов лежит измерение оптической плотности спирто-водной вытяжки из растительного сырья при длине волны 275 нм. Однако метод Левенталя и спектрофотометрический методы как методы суммарного определения фенольных соединений следует признать приблизительными, полуколичественными ввиду разнообразия строения этой группы соединений. Но все же такие методы находят широкое применение для предварительного знакомства с растительным материалом, а также для сравнительных целей [19].
За основу используемых методик взяты методики перманганатометрического и спектрофотометри-ческого определения дубильных веществ в надземной части сабельника болотного [20].
При изучении спектров поглощения в диапазоне длин волн 200-500 нм водных извлечений из надземных и подземных частей разных видов герани было установлено, что спектры поглощения водных извлечений, разбавленных 70% этиловым спиртом в соотношении 1 : 100, имели максимум при длине волны 276±2 нм. На рисунке в качестве примера приведен спектр водно-спиртовой вытяжки из сырья G. pratense (рис.). Аналогичный максимум поглощения отмечен для раствора танина на 70% этиловом спиртом (рис.). Это дало возможность использовать длину волны 276±2 нм в качестве аналитической при определении количественного содержания дубильных веществ в сырье спектрофотометрическим методом.
Получение извлечения. Около 0,8 г (точная навеска) измельченного до размера частиц 2 мм сырья заливали 100 мл воды и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин с последующим 30-минутным отстаиванием при комнатной температуре. Полученное извлечение фильтровали через складчатый бумажный фильтр в мерную колбу емкостью 100 мл, доводили водой до метки.
1. Перманганатометрическое определение дубильных веществ. Отбирали пипеткой 10 мл полученного извлечения в колбу вместимостью 1000 мл, прибавляли 500 мл воды, 25 мл индигосульфокислоты и титровали при перемешивании 0,02 М раствором калия перманганата до золотисто-желтого окрашивания. Параллельно проводили контрольный опыт. Общее содержание веществ, окисляющихся при титровании раствором калия перманганата (X1), в процентах в пересчете на воздушно-сухое сырье вычисляли по формуле 1:
Xi =
V - VK)х 0,004157 х 100 х100
m х 10
(1)
где V: - объем раствора перманганата калия (0,02 моль/л), израсходованного на титрование извлечения, мл; Ук - объем раствора перманганата калия (0,02 моль/л), израсходованного на титрование в контрольном опыте, мл; 0,004157 - количество дубильных веществ, соответствующее 1 мл раствора перманганата калия (0,02 моль/л) (в пересчете на танин), г; т - масса сырья, г; 100 - общий объем извлечения, мл; 10 - объем извлечения, взятого для титрования, мл.
2. Перманганатометрический метод в сочетании с осаждением дубильных веществ желатином. Проводили осаждение дубильных веществ в 20 мл полученного извлечения 1% раствором желатина в 10% растворе натрия хлорида. Образующийся осадок отфильтровывали. 10 мл фильтрата помещали в колбу вместимостью 1000 мл, прибавляли 500 мл воды, 25 мл индигосульфокислоты и титровали при перемешивании 0,02 М раствором калия перманганата до золотисто-желтого окрашивания. Содержание других окисляющихся веществ (Х2) рассчитывали по вышеприведенной формуле, в которой брали вместо У1 значение У2 - объема раствора перманганата калия (0,02 моль/л), израсходованного на титрование извлечения после осаждения дубильных веществ, мл.
Содержание дубильных веществ, определенных методом перманганатометрии в сочетании с осаждением дубильных веществ желатином (Х3):
X3 — X1 — X2
(2)
где X] - общее содержание веществ, окисляющихся при титровании раствором калия перманганата; X2 -содержание других окисляющихся веществ.
3. Спектрофотометрическое определение дубильных веществ. 5 мл полученного извлечения помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили до метки спиртом этиловым 70%, 2,5 мл полученного разведения помещали в мерную колбу на 25 мл и доводили до метки спиртом этиловым 70%. Измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре «Shimadzu» UV 1240 mini (Япония) в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны от 274,5 до 277,5 нм (в зависимости от исходного растительного сырья) относительно спирта этилового 70%. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора стандартного образца танина.
Примечание. Приготовление раствора стандартного образца танина. Около 0,0025 г (точная навеска) стандартного образца танина, высушенного до постоянной массы при температуре 100-105 °C, помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили до метки спиртом этиловым 70%, 2,5 мл полученного разведения помещали в мерную колбу на 25 мл и доводили до метки спиртом этиловым 70%.
Суммарное содержание дубильных веществ в пересчете на воздушно-сухое сырье (X4, %) определяли по формуле 3:
_DX х Mcm х 100 х 50 х 25 х 2,5 х100
X 4 --
4 Dcm х Mx х 5 х 2,5 х 50 х 25
Dx х Mст х 2000
Dcrn Х Mx
(3)
где Мст - масса танина, г; Мх - масса сырья, г; Бст - оптическая плотность раствора СО танина; Ох - оптическая плотность исследуемого раствора.
Спектры поглощения растворов в 70% этиловом спирте: 1 - водного извлечения из подземной части G. pratense, 2 - водного извлечения из надземной части G. pratense; 3 - стандартного образца танина; 4 - водного извлечения из G. lividum
Обсуждениерезультатов
Результаты количественного определения дубильных веществ разными методами представлены в таблице 3.
Для G. sibiricum, G. robertianum, G. pusillum и G. lividum желатиновый метод оказался непригодным, так как при добавлении раствора желатина к водной вытяжке из надземной части указанных гераней выраженный осадок не образовывался.
Спектрофотометрический метод неприемлем в отношении G. lividum, так как спектр поглощения спирто-водного извлечения из данной герани не имеет выраженного максимума в диапазоне длин волн 200-500 нм (рис.). Эта особенность спектра G. lividum описана ранее в литературе [7]. По результатам пер-манганатометрического метода G. lividum содержит наименьшее количество дубильных веществ среди всех восьми анализируемых видов рода Geranium.
Содержание дубильных веществ, определенное различными методами, в подземной части G. palustre, G. sylvaticum, G. pratense выше, чем в надземной части соответствующих видов гераней. Исключение составляют результаты спектрофотометрического определения дубильных веществ для образцов G. palustre: обнаружено, что суммарное содержание фенольных соединений, поглощающих при X—276-278 нм, в подземных органах G. palustre ниже, чем в надземной части, что может быть обусловлено особенностями состава фенольного комплекса данной герани.
Также обнаружено, что результаты перманганатометрического определения дубильных веществ во всех анализируемых объектах, за исключением G. sibiricum, коррелируют с результатами спектрофотометрического определения: для надземных частей гераней наблюдается увеличение количественного содержания дубильных веществ в ряду G. robertianum - G. pusillum - G. sylvaticum - G. sanguineum ~ G. palustre -G. pratense, для подземных частей гераней наблюдается увеличение количественного содержания дубильных веществ в ряду G. palustre - G. sylvaticum ~ G. pratense. Для G. sibiricum метод Левенталя показал наименьшее содержание дубильных веществ в обозначенном здесь ряду анализируемых видов, однако согласно результатам спектрофотометрического метода она занимает позицию в вышеописанном ряду между G. pusillum и G. sylvaticum. Желатиновым методом показано для надземных частей гераней увеличение процента содержания дубильных в ряду G. pratense - G. sylvaticum - G. palustre - G. sanguineum, а для подземных органов G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre результаты очень близки, учитывая относительную ошибку среднего результата определения.
Таблица 3. Результаты определения содержания дубильных веществ в исследуемых видах рода Geranium (в процентах в пересчете на воздушно-сухое сырье)
Вид и его анализируемая часть Методы количественного анализа дубильных веществ
перманганатометрия желатиновый метод спектрофотометрический
G. pratense, надземная часть 15,04±0,48 3,60±0,18 9,70±0,48
s—3,2 8—5,0 8—5,0
G. pratense, подземная часть 23,40±0,28 14,32±0,43 13,92±0,36
8—1,2 8—3,0 8—2,6
G. palustre, надземная часть 13,93±0,33 5,62±0,28 7,29±0,33
s—2,4 8—4,9 8—4,5
G. palustre, подземная часть 21,09±0,76 15,51±0,47 4,74±0,15
8—3,6 8—3,0 8—3,2
G. sylvaticum, надземная часть 10,53±0,42 4,34±0,22 6,55±0,29
8—1,4 8—5,0 8—4,4
G. sylvaticum, подземная часть 23,55±0,31 14,96±0,21 8,41±0,43
8—1,3 8—1,4 8—5,1
G. sanguineum, надземная часть 13,71±0,35 8,08±0,42 7,57±0,28
8—2,6 8—5,2 8—3,7
G. sibiricum, надземная часть 6,97±0,09 - 4,48±0,22
8—1,2 8—5,0
G. robertianum, надземная часть 7,32±0,36 - 4,13±0,17
8—4,9 8—4,2
G. pusillum, надземная часть 7,64±0,38 - 4,22±0,18
8—5,0 8—4,3
G. lividum, надземная часть 4,56±0,24 - -
8—5,2
Примечание: s - относительная ошибка среднего результата определения.
Таким образом, согласно полученным данным среди анализируемых видов рода герань наибольшее содержание дубильных веществ отмечено для G. sylvaticum, G. pratense, G. palustre и G. sanguineum. Однако G. sanguineum входит в список видов, рекомендуемых для охраны на территории Северо-Западной России [3]. Следовательно, наиболее перспективными объектами для дальнейших фармакогностических исследований являются G. sylvaticum, G. pratense, G. palustre, имеющие достаточную ресурсоведческую базу на Северо-Западе.
Погрешность перманганатометрического метода составила для сырья герани от 1,2 до 5,0% при доверительной вероятности 95%. Ошибка метода перманаганатометрии в сочетании с осаждением дубильных веществ составила от 1,4 до 5,2%. Погрешность спектрофотометрического метода - от 2,6 до 5,1%.
В дальнейшем для стандартизации сырья гераней следует рекомендовать методы перманганатомет-рии и спектрофотометрии как менее трудоемкие и достаточно точные.
Выводы
Проведена сравнительная оценка содержания дубильных веществ в восьми видах рода Geranium L. флоры Северо-Запада тремя различными методами. Для дальнейших исследований в области фармакогнозии наиболее перспективными объектами являются G. sylvaticum, G. pratense, G. palustre ввиду максимального содержания дубильных веществ и достаточной сырьевой базы на Северо-Западе России.
Из трех апробированных методов для стандартизации сырья гераней следует рекомендовать методы перманганатометрии и спектрофотометрии как менее трудоемкие и достаточно точные.
Список литературы
1. Мордак Е.В. Семейство гераниевые (Geraniaceae) // Жизнь растений. Т. 5. Ч. 2. Цветковые растения. М., 1980. С. 277-280.
2. Черепанов С.А. Сосудистые растения России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР). СПб., 1995. 992 с.
3. Цвелев H.H. Определитель сосудистых растений Северо-Западной России (Ленинградская, Псковская и Новгородская области). СПб., 2000. 781 с.
4. Иллюстрированный определитель растений Ленинградской области / под ред. А.Л. Буданцева, Г.П. Яковлева. М., 2006. 799 с.
5. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Ruta-ceae - Elaeagnaceae. Л., 1988. T. 4. 357 с .
6. Блажей В., Шутый Я. Фенольные соединения растительного происхождения. М., 1977. 239 с.
7. Leifertova I., Buckova H., Natherova L. K chemotaxonomii znaku trislovin u rodu Geranium // Preslia. 1965. V. 37, N4. Pp. 413-418.
8. Блинова К.Ф. К поискам физиологически активных веществ во флоре Забайкалья // Вопросы фармакогнозии. Л., 1967. Вып. 4. С. 109-119.
9. Блинова К.Ф. Исследование дубильных растений // Материалы исследований лекарственных средств и сырья. Л., 1959. С. 60-72.
10. Brandt W., Schlund F. Über deutsche Geranium-Arten // Pharmazeutische zeitung. 1924. Bd 69, N50. S. 597-598.
11. Пинчук В.А. О содержании дубильных веществ в некоторых растениях Северного Кавказа // Ученые записки Пятигорского фармацевтического института. Пятигорск, 1957. Т. 2. С. 122-127.
12. Чеврениди С.Х., Хаидмухамедов Л.П.. Некоторые вопросы биологии однолетних гераней Узбекистана // Перспективные растения Узбекистана и их культура. Ташкент, 1979. С. 49-53
13. Кобахидзе К.Б. Фенольные соединения некоторых видов рода Geranium L., произрастающих в Грузии: авто-реф. дис. ... канд. фарм. наук. Тбилиси, 2004. 26 с.
14. Государственная Фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа. 11-е изд. М., 1987. 336 с.
15. Курсанов А.И. Определение различных форм дубильных веществ в растениях // Биохимия. 1941. Т. 6, №3. С. 312-325.
16. Лекарственное растительное сырье. Государственные стандарты СССР. М., 1980. 296 с.
17. Хворост О.П., Беликов В.В., Сербии А.Г., Комиссаренко Н.Ф. Сравнительная количественная оценка содержания дубильных веществ у Alnus glutinosa (L.) Gaertn. // Растительные ресурсы. 1986. T. 22, вып 2. С. 258-262.
18. Ивашин Д.С., Катина З.Ф., Рыбачук И.З. и др. Справочник по заготовкам лекарственных растений. Киев, 1983. 296 с.
19. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. М., 1974. 212 с.
20. Скляревская Н.В. Фармакогностическое изучение надземной части сабельника болотного (Comarum palustre L.), произрастающего на Северо-Западе России : автореф. дис.. канд. фарм. наук. СПб., 2009. 24 с.
Поступило в редакцию 6 декабря 2010 г.
