Сравнительная оценка реактогенности туляремийной вакцины на различных биомоделях Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

сравнительная оценка реактогенности туляремийной вакцины на различных биомоделях

Т.И. Комбарова (kombarova.tatyana@yandex.ru), В.М. Павлов, Т.Б. Кравченко, Г.М. Титарева, И.В. Бахтеева, А.И. Борзилов, О.В. Коробова, Г.М. Вахрамеева, Р.И. Миронова, А.Н. Мокриевич

ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», пос. Оболенск, Московская обл.

Резюме

Проведено сравнение экспериментальных моделей туляремии для изучения вакцинных препаратов с использованием морских свинок и мышей инбредных линий BALB/c(H2d) и C57BL/6(H2b) и аутбредных мышей Swiss Webster. Показано, что мыши линии C57BL/6 являются наиболее чувствительными к введению вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, а мыши BALB/c занимают среднее положение по сравнению с мышами C57BL/6 и аутбредными мышами Swiss Webster. Выявленная корреляция по изменению веса и гематологических показателей между морскими свинками и мышами показывает, что мыши всех изученных линий могут быть использованы в качестве альтернативной модели для изучения реактогенности штаммов туляремийного микроба. Полученные результаты позволяют считать, что наиболее оптимальной адекватной моделью для проведения исследований по оценке реактогенности перспективных туляремийных вакцин являются мыши линии BALB/c.

Ключевые слова: туляремия, вакцинный штамм 15 НИИЭГ, вирулентность, реактогенность, лабораторные животные

Comparative Evaluation of Reactogenicity Tularemia Vaccine Using of Different Biomodels

T.I. Kombarova (kombarova.tatyana@yandex.ru), V.M. Pavlov, T.B. Kravchenko, G.M. Titareva, I.V. Bakhteeva, A.I. Borzilov, O.V. Korobova, G.M. Vakhrameeva, R.I. Mironova, A.N. Mokrievich

Federal State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Moscow region Abstract

A comparison of experimental models for the study of tularemia vaccines using Guinea pigs and mice, inbred BALB/c(H2d) and C57BL/6(H2b) and outbred Swiss Webster has been made. It was shown that mice C57BL/6 are the most sensitive to the introduction of the vaccine strain F. tularensis NIIEG 15 and BALB/c mice was located in a middle position compared to mice C57BL/6 and outbred mice Swiss Webster. The correlation of weight and hematological parameters changes between Guinea pigs and mice indicates that all mouse lines can be used as an alternative model for the study of reactogenicity tularemia strains. The obtained results allow to assume that the most optimal adequate model for evaluated studies of the reactogenicity promising tularemia vaccines are a mouse line BALB/c.

Key words: tularemia, vaccine strain 15 NIIEG, virulence, reactogenicity, laboratory animals

Введение

Туляремия - зоонозная природно-очаговая инфекция, представляющая серьезную опасность для населения из-за почти 100%-ной восприимчивости к ней людей [5]. Существующая живая туляремий-ная вакцина, созданная в СССР в 40 - 50-х годах XX столетия на основе штамма F. tularensis 15 НИИЭГ (Научно-исследовательский институт эпидемиологии и гигиены) формирует длительный напряженный иммунитет, в ряде случаев вызывает нежелательные поствакцинальные реакции и имеет некоторые ограничения в применении [2, 5, 12, 13, 14]. Поэтому до настоящего времени актуально создание безопасной и эффективной туляремий-ной вакцины.

В соответствии с методическими указаниями «Основные требования к вакцинным штаммам туля-ремийного микроба» (МУ 3.3.1.2161-07) свойства потенциальных вакцинных штаммов сравниваются

со свойствами вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ [4]. Обычно для оценки таких показателей изучаемого штамма, как безопасность, реактогенность и иммуногенность, в качестве биологической модели экспериментальной туляремии используются морские свинки. Критерием протективности потенциальных вакцин является способность защищать иммунизированных морских свинок от последующего заражения природным штаммом F. tularensis 503 [2]. В соответствии с методическими указаниями аутбредные мыши используются только для определения остаточной вирулентности исследуемого вакцинного туляремийного штамма [4].

В последнее время при проведении иммунологических исследований широко применяется мышиная модель экспериментальной туляремии [16, 17, 18]. Известно, что мыши чувствительны к возбудителю туляремии [19]. Величина DCL (dosis certae letalis) для природных штаммов меньше 10 КОЕ, а LD для

вакцинного штамма F. tularensis при подкожном введении не превышает 500 КОЕ. Вирулентность вакцинного штамма для различных линий мышей неодинакова [12, 20]. Сравнительное исследование экспериментальной туляремии на различных линиях мышей позволяет выявлять особенности механизмов формирования специфического иммунитета [15].

Современный уровень генетических исследований туляремийного микроба дает возможность целенаправленно модифицировать геном, позволяя тем самым конструировать штаммы для создания перспективных вакцинных препаратов. Изучение свойств таких штаммов требует проведения значительного числа скрининговых исследований с использованием большого количества морских свинок. Замена такой дорогостоящей модели на более экономичную и в то же время отражающую все основные этапы инфекционного и иммунологического процесса является актуальной проблемой [3, 15].

Цель данного исследования - оценка перспективности использования мышиной модели экспериментальной туляремии и выбор линии мышей, наиболее адекватно реагирующих на введение вакцинного штамма по сравнению с традиционно используемыми морскими свинками.

Материалы и методы

Штаммы

Вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ и тест-заражающий штамм F. tularensis 503 были получены из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ФБУН ГНЦПМБ, пос. Оболенск, Московская область). Культуры F. tularensis выращивали при температуре 37 0С на плотной питательной среде «FT-агар с черным альбумином» производства ФБУН ГНЦПМБ. Стандартные суспензии клеток туляремийного микроба готовили в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) с использованием стандарта мутности (ОСО 42-28-85-2012 ФГБУ «НЦ ЭСМП» (Научный центр экспертизы средств медицинского применения Минздрава России).

Животные

Для проведения исследований были использованы мыши инбредных линий BALB/c(H2d), C57BL/6(H2b), аутбредные мыши Swiss Webster (питомник «Пущино» ФИБХ РАН, г. Пущино, Московская обл.) и морские свинки «Андреевка» (ФГБУ «НЦ БМТ» РАМН, пос. Андреевка, Солнечногорский район, Московская обл.). Морские свинки были в возрасте 5 - 7 недель, весом 350 - 450 г. Вес линейных мышей составлял 18 - 20 г, аутбредных мышей - 20 - 24 г. Возраст мышей всех линий -6 - 8 недель. Работы с животными проводили в соответствии с законодательством Российской Федерации [9] и Директивой европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях [10].

Содержание и манипуляции с животными

Мыши содержались по пять особей в клетках типа «микроизолятор» общей площадью 484 см2, морские свинки - по три особи в клетках общей площадью 864 см2, на подстиле из древесных опилок нехвойных пород. Мыши получали автоклави-рованный стандартный корм ПК-120 экструдиро-ванный, морские свинки - КК-122 (ООО «Лабора-торкорм», Россия). Все животные имели свободный доступ к стерильной воде. Наблюдение за животными проводили в течение 14 дней до эксперимента, оценивая физиологическую, психологическую и метаболическую адаптацию. После адаптации животных размещали и маркировали в соответствии с условиями эксперимента и с учетом требований «Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных» [11]. Животных содержали в контролируемых условиях окружающей среды: температура воздуха - 18 - 26 0С, относительная влажность воздуха - 30 - 70%, кратность воздухообмена в помещениях - 12 кратных объемов в час.

Уход и манипуляции с животными осуществляли сотрудники, имеющие профессиональную подготовку, соответствующую квалификацию и опыт. Эксперименты и эвтаназию животных осуществляли в соответствии с СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.232208 по безопасности работы с микроорганизмами I - IV групп патогенности [6, 7].

Манипуляции с животными осуществлялись в специально изолированной комнате для заражений. Животных иммунизировали подкожно в паховую область, используя для мышей иглы 23G, объем вводимого раствора - 0,2 мл, морским свинкам - иглы 25G и объем 0,5 мл. Наблюдение и взвешивание проводили ежедневно в течение

14 дней.

Оценка приживаемости бактерии F. tularensis в организме животных

Экспериментальных животных вакцинировали подкожно клетками штамма F. tularensis 15 НИИЭГ в дозах 102 КОЕ для мышей и 108 КОЕ для морских свинок. На 4-е, 7-е и 11-е сутки проводили эвтаназию животных, селезенки гомогенизировали и суспендировали в объеме 5 мл ЗФР. Из полученной взвеси готовили ряд десятикратных разведений, высевали на плотную питательную среду и инкубировали при температуре 37 0С. Подсчет выросших на агаре колоний проводили через 72 часа.

Определение реактогенности

Реактогенность вакцинного штамма F. tularensis

15 НИИЭГ оценивали по изменению веса морских свинок и мышей после иммунизации. Взвешивание животных производили на электронных весах Scout ProSPU (Ohaus, США) с точностью измерения 0,1 г. Морских свинок взвешивали индивидуально и определяли процентное изменение среднего веса в группе по отношению к весу в день зара-

жения. Мышей взвешивали группой по пять животных в специальном лотке для взвешивания в одно и то же время суток, затем рассчитывали процентное изменение среднего веса мышей в группе. Температуру измеряли в одно и то же время суток, при постоянной температуре помещения и одинаковой влажности, с помощью чипов для термометрии Implantable Electronic ID Transponders (BMDS, США), которые вводили подкожно за сутки до заражения, и сканирующего устройства Pocket Scanner (BMDS, США).

Определение гематологических показателей крови и уровня цитокинов

Определение гематологических показателей проводили у иммунизированных животных. В качестве контрольных групп использовали животных, которым подкожно вводили физиологический раствор. Общий анализ крови животных проводили с помощью автоматического гематологического анализатора для ветеринарии PCE90Vet (High Technology, США). Уровень цитокинов фактор некроза опухоли (ФНО)-альфа и гамма-интерферон (ИФН-гамма) в сыворотке крови мышей оценивали иммуноферментным методом, используя наборы фирмы eBioscience (Австрия) согласно инструкции.

Забор крови у животных производили на 4-е, 7-е и 11-е сутки после иммунизации, подвергая их анестезии с помощью СО2. Животных накануне эксперимента лишали корма, оставляя свободным доступ к воде. Для определения форменных элементов крови с дифференциацией лейкоцитов использовали рекомендованные к гематологическому анализатору микропробирки с антикоагулянтом К2-ЭДТА (Labor Diagnostik Systeme, Германия). Для выявления уровня цитокинов в сыворотке полученные образцы крови оставляли при комнатной температуре на 15 минут, затем тонкой палочкой отделяли сгусток от стенок пробирки и центрифуги-

ровали в течение 10 - 15 минут при 3000 оборотах в минуту.

Сразу после центрифугирования сыворотку отбирали, делили ее на аликвоты и хранили при -20 0С до выполнения анализа.

Определение протективной активности вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ на мышиной модели Через 30 суток после иммунизации мышам подкожно вводили 1000 DCL (5 х 103 м.к.) тест-заражающего штамма F. tularensis 503. Наблюдение за животными вели в течение 21 дня.

Статистические методы

Вычисление величин LD50 производили по методу КегЬег в модификации И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [1].

Результаты и обсуждение

Определение остаточной вирулентности вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ для морских свинок и мышей различных линий

Чувствительность лабораторных мышей и морских свинок к заражению вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ определяли путем подкожного введения бактерий в диапазоне доз 10 -103 КОЕ мышам линий BALB/c, C57BL/6, Swiss Webster и 107 - 109 КОЕ - морским свинкам.

После наблюдения за животными в течение 21 дня рассчитывали величину LD50 и среднюю продолжительность жизни (табл. 1).

Приведенные в таблице 1 данные свидетельствуют, что среди использованных в исследованиях мышей самыми восприимчивыми к заражению вакцинным штаммом туляремии оказались мыши линии C57BL/6 (LD50- 5 (3 + 9) м.к.), наиболее устойчивыми - аутбредные мыши Swiss Webster (LD50 - 316 (190 + 450) м.к.). Чувствительность мышей линии BALB/c оказалась промежуточной (LD50 = 79 (40 + 110) м.к.).

Таблица 1.

Остаточная вирулентность вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ для морских свинок и мышей различных линий

Животные Доза вакцинного штамма, кое Число погибших животных/общее количество Средняя продолжительность жизни погибших животных, сутки Выжившие животные,% Значение LD50, кое

Мыши линии BALB/c 10 102 103 0/5 3/5 5/5 9,3 8,6 100 40 О 79 (40 + 110)

Мыши линии C57BL/6 10 102 103 5/5 4/5 5/5 10 9,8 9,5 О 20 О 5 (3 + 9)

Мыши Swiss Webster 10 102 103 1/5 2/5 2/5 Р®9 сл сл 6 6 8 ООО 316 (190 + 450)

Морские свинки ООО 0/3 0/3 1/3 14 100 100 66 109

Средние сроки жизни для погибших мышей составили 8 - 10 суток вне зависимости от линии.

Примечательно, что рекомендуемые для проведения стандартных исследований морские свинки оказались устойчивыми к заражению высокими дозами вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, величина LD50 при подкожном введении превышала 109 КОЕ.

Оценка приживаемости вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ по степени и длительности обсемененности селезенки

Данные по приживаемости штамма в организме морских свинок и мышей после введения 108 и 102 КОЕ F. tularensis 15 НИИЭГ соответственно отражены на рисунке 1.

На рисунке 1 видно, что для морских свинок характерна постепенная элиминация из селезенки бактериальных клеток. При дозе вакцины для морских свинок 1 х 108 КОЕ высев бактерий из селезенки на 4-е сутки составлял всего 4,5 ± 0,1 log КОЕ/орган и затем происходило постепенное освобождение органа от микробов.

У мышей вакцинный штамм при дозе 1 х 102 КОЕ вызывал инфекционный процесс, о чем свидетельствует нарастание уровня обсемененности селезенок, который на 4-е сутки у мышей линии C57BL/6 составил 2,9 ± 0,2 log КОЕ/орган, у аут-бредных мышей Swiss Webster - 3,1 ± 0,4 log КОЕ/орган и у мышей линии BALB/c - 3,1 ± 0,3 log КОЕ/орган. Максимальных значений обсеме-

ненность селезенок достигала к 7-м суткам (от 4,98 ± 0,7 до 6,0 ± 0,2 log КОЕ/орган), а к 11-м суткам наблюдалось ее существенное снижение. К 21-м суткам единичные колонии штамма F. tularensis 15 НИИЭГ высевались только из селезенок мышей линии BALB/c (данные не приводятся).

Полученные результаты исследования позволяют предположить, что у морских свинок и мышей характер развития инфекционного процесса на начальном этапе иммунизации различен.

Оценка реактогенности вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ для лабораторных животных по изменению веса, температуры тела и гематологических показателей

В соответствии с МУ 3.3.1.2161-07 [4] определение реактогенности вакцинного штамма проводят на морских свинках (при их подкожной иммунизации) путем оценки местной (увеличение регионарных лимфатических узлов в месте введения) и общей (повышение температуры и снижение массы тела) реакций. Параметры реактогенности по общей реакции определяли у экспериментальных животных, зараженных подкожно дозой 1 х 108 КОЕ для морских свинок и 1 х 102 КОЕ для мышей линий BALB/c, C57BL/6 и Swiss Webster.

Взвешивание и термометрирование животных проводили в течение 14 суток после вакцинации. Изменение температуры тела у животных приведено на рисунке 2.

Рисунок 1.

Обсемененность селезенок мышей различных линий и морских свинок после иммунизации вакцинным штаммом F. Ш!агеп^ 15 НИИЭГ

Рисунок 2.

Динамика изменения температуры тела у лабораторных животных после их вакцинации штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ по отношению к первому дню иммунизации

Ф ^

О О 1=

СО ф

>

Ü

о.

ф

1=

5

ф

н

ф

I

ф

I

ф

2,5 -|

2,0 -

1,5 -

1,0 -

с 0,5 -

I 0,0 -

^ -0,5 -

1-1,0 -

-1,5 --2,0 -2,5

-3,0 -

морские свинки C57BL/6

BALB/c Swiss Webster

О

> Op Ъ л > ^ ^ ^ ^ ^ ^ \ <Ъ (v'41 А' Ъ О)' .CY N\- r¡; к.'4

or Л" Ъ" °Г Дни наблюдений

№

Как видно на рисунке 2, изменение температуры тела у морских свинок имело сходный характер с изменением температуры только у аутбредных мышей: повышение температуры наблюдалось в течение первых четырех суток после введения вакцины, с последующим постепенным снижением и приближением к нормальной. Напротив, у мышей линий BALB/c и C57BL/6 отмечались понижение температуры в течение первых суток, а затем подъем температуры в течение последующих трех суток. Далее снижение температуры у мышей линии C57BL/6 на 1,2 0C совпало с гибелью всех животных этой линии, в то время как снижение температуры на 1,5 0C на 10-е сутки у мышей линии BALB/c существенно не повлияло на их жизнеспособность. Следует отметить, что за счет значительных колебаний индивидуальных показателей температуры у мышей внутри групп разница между средними значениями температур для всех линий оказалась статистически недостоверной.

Одним из показателей метаболической активности организма животных при вакцинации может служить изменение веса. Динамика изменения веса у морских свинок и мышей после введения подкожно бактерий в дозе 1 х 108 КОЕ морским свинкам и 1 х 102 КОЕ - мышам линий BALB/c, C57BL/6 и Swiss Webster отражена на рисунке 3.

Снижение веса у вакцинированных морских свинок, свидетельствующее об угнетении физиологических функций, наблюдалось с первых суток после введения дозы, причем наибольшее снижение веса (на 23%) регистрировалось на 4-е сутки.

Затем вес постепенно повышался, однако к 14-м суткам вес животных был ниже, чем до вакцинации (см. рис. 3).

Мыши также реагировали на вакцинацию снижением веса, однако сходную с морскими свинками динамику наблюдали у мышей линий BALB/c и C57BL/6 (снижение веса уже через сутки), но не у аутбредных мышей (снижение веса только на 3-и сутки). В отличие от морских свинок максимальное снижение веса у вакцинированных мышей всех линий наблюдалось на 7-е - 10-е сутки. Интересно отметить, что у мышей линии BALB/c к 11-м суткам начиналась постепенная прибавка в весе, в то время как мыши линии C57BL/6 уже к 8-м суткам погибли. В целом можно сказать, что у мышей линии BALB/c динамика снижения веса близка к таковой морских свинок, поэтому мы считаем, что оценку реактогенности по изменению веса можно успешно проводить с использованием мышей линии BALB/c.

Для оценки реактогенности вакцинного штамма были определены гематологические показатели крови у экспериментальных животных в различные сроки после вакцинации. Несмотря на общепризнанную важность определения таких показателей при изучении иммунопатогенеза туляремии, в научной литературе практически не встречается публикаций, касающихся этого аспекта.

При определении гематологических показателей крови морских свинок и мышей в различные сроки после вакцинации количество эритроцитов и уровень гемоглобина не отличались от таковых в контрольных группах: у морских свинок гемоглобин

Рисунок 3.

Динамика изменения веса лабораторных животных после вакцинации штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ к первому дню иммунизации

15 10 5 0 -5 -10 -15 -20 -25 -30 -35

морские свинки C57BL/6

BALB/c Swiss Webster

> <i- > У V1 <Ъ'

>

л

> >

Дни наблюдений

находился в диапазоне 149 - 167 г/л, количество эритроцитов составляло 5,84 - 6,61 х 1012/л, у мышей гемоглобин был в пределах 102 - 128 г/л, количество эритроцитов - 7,37 - 9,42 х 1012/л.

Основные изменения в крови вакцинированных животных были выявлены при определении лейкоцитов, лимфоцитов, гранулоцитов и тромбоцитов (рис. 4 - 6).

Согласно приведенным данным, на 4-е сутки после вакцинации у всех видов экспериментальных животных уровень лейкоцитов снижался. На 7-е сутки у морских свинок и аутбредных мышей количество лейкоцитов в крови приближалось к величинам, характерным для интактных животных. У мышей линии BALB/c количество лейкоцитов

Рисунок 4.

Динамика изменения количества лейкоцитов в крови лабораторных животных после вакцинации штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ

□ морские свинки

16,0

Я ст>сЭ

5

О

1 BALB/c □ C57BL/6 □ Swiss Webster

контроль 4-е сутки 7-е сутки

Время наблюдений

11-е сутки

Рисунок 5.

Динамика изменения количества лимфоцитов и гранулоцитов в крови лабораторных животных после вакцинации штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ

%

90 80 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 -0

□ морские свинки

BALB/c

□ C57BL/6

■

п

□ Swiss Webster

|Ъ

4-е сутки 7-е сутки 11-е сутки контроль 4-е сутки 7-е сутки 11-е сутки

лимфоциты танулошиты

Рисунок 6.

Динамика изменения количества тромбоцитов в крови лабораторных животных после вакцинации штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ

1200 п морские свинки

1000 -

оо

со О н

5 J

о \о

° 400 I-

о со н

о ф

т 5

о

200 -

BALB/c

□ C57BL/6

□ Swiss Webster

800 -

600

контроль

4-е сутки 7-е сутки

Время наблюдений

11-е сутки

практически не менялось с 4-х до 7-и суток, тогда снизилось - до 1,2 ± 0,1109/л. На 11-е сутки у мор-как у мышей линии C57BL/6 их количество резко ских свинок, аутбредных мышей и мышей линии

Рисунок 7.

Концентрация ФНО-альфа в сыворотках крови мышей различных линий после иммунизации штаммом F. Ш!агеп^ 15 НИИЭГ

BALB/c уровень лейкоцитов вернулся к первоначальным значениям. Большой разброс значений, полученных для аутбредных мышей, вероятно, объясняется генетической гетерогенностью животных.

В процессе вакцинации изменялось не только количество лейкоцитов, но и их популяционный состав. Динамика изменения количества лимфоцитов и гранулоцитов приведена на рисунке 5.

Для контрольных групп было характерно большее содержание лимфоцитов по отношению к количеству гранулоцитов, а у всех видов иммунных животных наблюдалась обратная картина - доля гранулоцитов была выше доли лимфоцитов. Динамика изменений популяционного состава морских свинок и мышей линий BALB/с и C57BL/6 была сходной (см. рис. 5).

Динамика изменения количества тромбоцитов отражена на рисунке 6.

Анализ данных позволил выявить наличие абсолютной (ниже установленных норм) тромбоцитопе-

нии у морских свинок на 4-е сутки и относительной (ниже контрольных значений) тромбоцитопении у мышей всех линий на 4-е - 7-е сутки после вакцинации. На 11-е сутки у всех животных имело место восстановление количества тромбоцитов.

Уровень синтеза провоспалительных цитокинов ИФН-гамма и ФНО-альфа был определен у вакцинированных мышей различных линий. Результаты представлены на рисунках 7 и 8.

Все линии мышей показали сходную динамику изменения уровня продукции цитокинов в сыворотке крови, который достигал максимальных значений на 7-е сутки, однако у аутбредных мышей концентрации ИФН-гамма и ФНО-альфа в крови были выше, чем у мышей линий BALB/c и C57BL/6.

Следует подчеркнуть, что уровень индукции синтеза обоих видов цитокинов имел обратную зависимость от устойчивости линий мышей к вакцинации - у наиболее чувствительных к введению вакцинного штамма мышей линии C57BL/6 выяв-

Рисунок 8.

Концентрация ИФН-гамма в сыворотках крови мышей различных линий после иммунизации штаммом F. Ш!агеп-^ 15 НИИЭГ

1600-, 140012001000800600 400 200 0

Swiss Webster

BALB/c

C57BL/6

4-е сутки 7-е сутки 11-е сутки 21-е сутки Время наблюдений

лен наименьший уровень индукции синтеза обоих видов цитокинов, а у наиболее устойчивых мышей линии Swiss Webster - наибольший уровень (см. рис. 7 и 8).

У всех вакцинированных животных был сформирован протективный иммунитет. Через 30 дней после вакцинации экспериментальных животных заражали 1000 DCL штамма F. tularensis 503. Уровень защиты для всех животных составил 100%.

Таким образом, нами проведено сравнение экспериментальных моделей туляремии для изучения вакцинных препаратов с использованием морских свинок и мышей инбредных линий BALB/c(H2d) и C57BL/6(H2b) и аутбредных мышей Swiss Webster.

Присущие линиям мышей особенности иммунной системы и сила ответа врожденного иммунитета [8] обуславливают различия в чувствительности различных мышиных линий к экспериментальной туляремии [15].

Выводы

1. Мыши линии C57BL/6 являются наиболее чувствительными к введению вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, а BALB/c занимают среднее положение по сравнению с мышами линии C57BL/6 и аутбредными мышами Swiss Webster.

2. Выявлена корреляция по изменению веса и гематологических показателей между морскими свинками и мышами.

3. Мыши всех изученных линий могут быть использованы в качестве альтернативной модели для изучения реактогенности штаммов туляре-мийного микроба.

4. Высокая чувствительность мышей линии C57BL/6 позволяет использовать их в качестве модели организмов со сниженным иммунитетом.

5. Аутбредные мыши, обладая значительной устойчивостью к туляремийной инфекции, являются генетически неоднородными и не дают возможности получать статистически достоверные результаты на малых популяциях животных.

6. Оптимальной адекватной моделью для проведения исследований и оценки перспективных туля-ремийных вакцин служат мыши линии BALB/c.

Главная задача при создании новых вакцинных штаммов - снижение их реактогенности, один из аспектов которой - возможность развития инфекционного процесса в организме. Учитывая это, на наш взгляд, оценку перспективных вакцинных штаммов на более чувствительной мышиной модели следует считать даже показательнее, чем на модели морских свинок.

Работа выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Научные исследования и разработки с целью обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в Российской Федерации» (на 2011 - 2015 гг.).

Литература

i. 2.

3.

4.

5.

6. 7.

10. 11. 12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Л.: Гос. изд-во мед. лит., 1962. - 180 с. Домарадский И.В. Проблемы патогенности франсиселл и пути их решения // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2005. № 1. С. 106 - 110. Каркищенко Н.Н. Основы биомоделирования. - М.: Изд-во ВПК, 2005. - 608 с.

МУ 3.3.1.2161-07 «Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба» // Бюл. норм. и методич. док. Госсанэпиднадзора. 2007. Вып. 2 (28). С. 111 - 148.

Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. - М.: Медицина, 1975. - 192 с. СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности». - М., 2003. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности». - М., 2008.

Трунова Г.В., Макарова О.В., Диатроптов М.Е. и др. Морфофункциональная характеристика иммунной системы мышей линий BALB/c и C57BL/6 // Бюл. экспер. биол. и мед. 2011. Т. 151. № 1. С. 112 - 115.

Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19.06.2003 года № 267 «Правила лабораторной практики в Российской Федерации».

Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. - СПб., - 48 с. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. - National Acad. Press Washington, D.C., 1996. - 138 с. Conlan J.W., Chen W., Bosio C.M. et al. Infection of mice with Francisella as an immunological model // Curr. Protoc. Immunol. 2011, April; Chapter: Unit - 19.14.

Conlan J.W., Oyston P.C.F. Vaccines against Francisella tularensis // Ann. NY Acad. Sci. 2007. V. 1105. Р. 325 - 350.

Elkins K.L., Cowley S.C., Bosio C.M. Innate and adaptive immunity to Francisella // Ann. NY Acad. Sci. 2007. V. 1105. P 284 - 324.

Green M., Choules G., Rogers D. et al. Efficacy of the live attenuated Francisella tularensis vaccine (LVS) in a murine model of disease // Vaccine. 2005.

V. 23 (20). P. 2680 - 2686.

Griffin K.F., Oyston P.C., Titball R.W. Francisella tularensis vaccines // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2007. V. 49. P 315 - 323.

Kirimanjeswara G.S., Golden J.M., Bakshi C.S. et al. Prophylactic and therapeutic use of antibodies for protection against respiratory infection with Francisella tularensis // J. Immunol. 2007. V. 179. P. 532 - 539.

Lyons C.R., Wu T.H. Animal models of Francisella tularensis infection //Ann. NY Acad. Sci. 2007. V. 1105. P 238 - 265.

Pechous R.D., McCarthy T.R., Mohapatra N.P et al. A Francisella tularensis Schu S4 purine auxotroph is highly attenuated in mice but offers limited protection against homologous intranasal challenge // PLoS One // www.plosone.org 1 June 2008. V. 3. Issue 6. P e2487

Twine S., Shen H., Harris G. et al. BALB/c mice, but not C57BL/6 mice immunized with a A-clpB mutant of Francisella tularensis subspecies tularensis are protected against respiratory challenge with wild-type bacteria: association of protection with post-vaccination and post-challenge immune responses // Vaccine. 2012. V. 75 (30). P. 3634 - 3645.