CC BY
1346
УДК 635.25:632.38
Вестник защиты растений, 2, 2002
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ВИРОИДА ВЕРЕТЕНОВИДНОСТИ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ
Л.В.Солянкина
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург
Проведена сравнительная оценка различных методов диагностики ВВКК (визуального, индикаторного, электрофореза в ПААГ) с точки зрения их пригодности для массовых анализов в системе сертификации. Использование только визуального метода недостаточно для точной диагностики ВВКК. Индикаторный метод непригоден для быстрой диагностики большого количества образцов из-за длительности получения результатов, трудоемкости и отсутствия абсолютной надежности. Из трех методов диагностики вироида наиболее приемлемым для массовых анализов признан метод электрофореза в ПААГ с использованием томатов-посредников. Апробирована методика определения зоны РНК вироида по номограмме с использованием константы Rm.
Вироидное заболевание - веретено-видность клубней картофеля (ВВКК) в последние годы стало препятствием развития картофелеводства в России. В 1991-1993 гг. на территории Северо-Запада произошла вспышка этого заболевания, охватившая Ленинградскую, Псковскую, Вологодскую, Калининградскую области, а также Карелию. В результате вироидом оказались поражены наиболее ценные районированные сорта.
Широкому распространению ВВКК способствовало то, что в России не были разработаны четкие методы диагностики
вироида, пригодные для массовых анализов, и отсутствовал контроль за вироид-ной инфекцией. ГОСТ 29267-91 на оздоровленный семенной и посадочный материал предусматривает лишь визуальную оценку на ВВКК, что совершенно недостаточно в случае латентной формы заболевания. Цель настоящей работы - сравнительная оценка различных методов диагностики ВВКК (визуального, индикаторного, электрофореза в ПААГ) с точки зрения их пригодности для введения в ГОСТ и дальнейшего использования в системе сертификации.
В опыте были использованы инфекционные растения картофеля, выращенные из зараженных вироидом клубней, следующих сортов: Невский, Петербургский, Елизавета, Лукьяновский, Луговской, Ад-ретта, Фреско. Контролем служили здоровые растения картофеля тех же сортов, ранее проверенные на ВВКК. По 10 виро-идных и контрольных растений каждого сорта выращивали в теплице в течение вегетационного периода, в ходе которого наблюдали за развитием симптомов.
В качестве растений-индикаторов использовали томат сортов Невский, Волгоградский 5/95, Сибирский скороспелый, Карлик 1185, Rutgers. Томат выращивали в условиях светоустановки при следующем режиме: cветовой день 16 ч, температура 20-25°С, освещенность 5000-7000 лк. Заражали по 10 растений каждого
сорта в фазе 2-4 настоящих листьев. Заражение проводили механически, соком из листьев картофеля сорта Невский, пораженного ВВКК. В качестве контроля использовали здоровые растения томата тех же сортов.
ВВКК в составе суммарной низкомолекулярной РНК выделяли из листьев картофеля сорта Невский, а также из листьев томатов-посредников сортов Невский, Волгоградский 5/95, Сибирский скороспелый, Карлик 1185, Rutgers. Для каждого варианта опыта заражали по 4 растения томата в фазе 2-4 настоящих листьев. Опыт проводили в двукратной повторности. В качестве контроля использовали здоровые растения картофеля и томата. Для выделения суммарной низкомолекулярной РНК использовали методику Морриса и Смита (Morris,
Вестник защиты растений, 2, 2002 Smith,1977). Методика была модифицирована нами - уменьшено время проведения диализа (3 часа вместо диализа в течение ночи), что значительно сократило время анализа и упростило его проведение при сохранении качества и коли-
Результаты
Визуальный метод. Визуальная диагностика остается основным приемом при оценке растений в поле. Главная трудность визуальной диагностики связана с тем, что проявление внешних симптомов часто зависит от погодных условий и условий выращивания растений (Леонтье-ва,Можаева,1988). Следует отметить, что погодные условия 1999 г. были крайне благоприятны для развития заболевания и проявления симптомов, которые обычно лучше видны в период жаркого и сухого лета. Симптомы были хорошо заметны при выращивании растений в теплице, где в солнечные дни температура достигала 35-40°С.
При осмотре растений, выращенных из зараженных клубней, мы отмечали растения с внешними симптомами, сходными с симптомами, вызываемыми ВВКК. Эти симптомы были хорошо заметны: одно-стебельчатость, укорочение боковых побегов, листья приподняты кверху и прижаты к стеблю, некоторые листья слабоморщинистые и деформированные. Больные растения существенно отставали в росте и развитии по сравнению с контрольными. После окончания вегетации на большинстве клубней также отмечали симптомы заболевания. Форма клубней была удлиненной, часто уродливой. Количество глазков на клубнях было увеличено, поверхность их более выпуклая, брови более резкие. Среди клубней, полученных от контрольных растений, такие симптомы отмечены не были. Наряду с клубнями, имеющими признаки верете-новидности, в потомстве зараженных растений были клубни без признаков заболевания. Наибольшее количество клубней с признаками веретеновидности было отмечено на сортах Петербургский и Лу-говской, а более четкие симптомы ВВКК на вегетирующих растениях - на Лугов-
чества выделенной РНК. Электрофорез низкомолекулярной РНК проводили в цилиндрических вертикальных установках с 5% полиакриламидным гелем на аппарате фирмы Reanal (Венгрия) в трис-ацетатной буферной системе.
исследований
ском. На растениях картофеля сорта Невский симптомы на ботве и клубнях развивались слабее, чем на остальных сортах.
Метод растений-индикаторов. Первые симптомы на томате отмечали через 3050 дней после инокуляции. Симптомы ВВКК проявлялись в задержке роста и незначительной деформации листьев у сортов Невский, Волгоградский 5/95, Rutgers. Зараженные растения цвели и формировали плоды позже контрольных на 1.5-2 недели. Плоды были мелкие (2535 мм в диаметре), со слаборазвитыми семенами. В наиболее сильной степени разница высоты контрольных и зараженных растений была отмечена на сортах Сибирский скороспелый, Волгоградский 5/95 и Rutgers.
Другие характерные признаки поражения растений ВВКК - укорочение междоузлий, некроз жилок, резкая эпи-настия листьев, кустистость верхушки нами отмечены не были. Вероятно, это можно объяснить тем, что используемый в опытах изолят ВВКК относится к мягкому штамму. По данным ряда отечественных и зарубежных авторов (Леонтье-ва,1971,1980; Singh,1971), при заражении мягкими штаммами томат может реагировать лишь слабыми симптомами, либо вообще не проявлять признаков болезни.
Метод электрофореза в ПААГ. Электрофорез является одним из самых распространенных методов диагностики ВВКК и используется для сертификации семенного материала во многих странах мира.
При тестировании ВВКК методом электрофореза непосредственно с растений картофеля возникал ряд трудностей с определением места локализации полосы вироидной РНК. Это происходило из-за множественности полос нуклеиновых кислот, а также из-за того, что полоса РНК вироида занимала самые разные
положения относительно полос других нуклеиновых кислот. Наиболее четкие результаты электрофореза были получены при тестировании ВВКК с использованием томатов - посредников. При идентификации вироидной полосы отмечали гораздо меньше сомнительных случаев -использование томата позволяло избегать негативных явлений, связанных с разнообразием генотипов картофеля (van Gelber, Treur,1982). Наиболее подходит для использования в качестве посредников томат сортов Невский, Волгоградский 5/95, Rutgers.
При использовании методики тестирования ВВКК с томатами - посредниками зоны РНК при электрофоретическом разделении располагались в следующем порядке: на старте остатки ДНК и высокомолекулярных РНК, затем зона ВВКК, зона 9S-РНК, зона 5S-РНК и t-РНК. Ви-роидная РНК с константой седиментации от 7S до 9S занимала промежуточное положение и могла быть ошибочно принята за полосу нуклеиновой кислоты 9S. В таких сомнительных случаях нами была апробирована методика определения зо-
Вестник защиты растений, 2, 2002 ны РНК вироида по номограмме с использованием константы Rm (van Gelber, Treur,1982). Этот показатель определяет положение зоны ВВКК относительно зоны 5S, которая всегда четко видна на электрофореграмме. Отношение расстояния от старта до полосы вироида к расстоянию от старта до полосы 5S соответствует для ВВКК значению Rm=0.61. Наши опыты подтвердили, что у большинства тестируемых образцов показатель Rm равнялся значению 0.61, благодаря чему полоса РНК вироида могла быть легко идентифицирована.
Выводы
Для диагностики вироида наиболее приемлемым является метод электрофореза в ПААГ с использованием томатов -посредников. Для выделения суммарной низкомолекулярной РНК из анализируемых растений считаем наиболее приемлемой методику Морриса и Смита (1977). В случаях затруднений при определении полосы РНК ВВКК может быть использована методика определения зоны ви-роида по номограмме.
Литература
Леонтьева Ю.А. Веретеновидность клубней (готика) - одно из основных вирусных заболеваний картофеля в Поволжье. Автореф. докт. дисс., СПб, Пушкин, 1971, 43 с.
Леонтьева Ю.А. Вироид веретеновидности клубней на картофеле и томатах. Вирусные болезни сельскохозяйственных культур. М., 1980, с.102-104.
Леонтьева Ю.А., Можаева К.А. Методические указания по диагностике и идентификации вироидов веретеновидности клубней картофеля и карликовости хризантем. М., 1988, 43 с
Morris T.S., Smith E.M. Potato spindle tuber disease: procedures for the detection of viroid RNA and the certification of disease -free potato tubers. /Phytopathology, 67, 2, 1977, p.145-150.
Singh R.P. A local lesion host for potato spindle tuber virus. /Phytopathology, 61, 8, 1971, p.1034-1035.
Van Gelber W. M.-J., Treur A. Testing of imported potato genotypes of potato spindle tuber viroid with a tomato-intermediata. /Bull. OEPP, 12, 4, 1982, p.297-305.
A COMPARATIVE ANALYSIS OF DIFFERENT DIAGNOSTIC METHODS OF POTATO SPINDLE TUBER VIROID L.V.Solyankina
A comparative analysis of different PSTV diagnostic methods (visual, bioassay on plant indicators, electrophoresis on PAAG) has been carried out for their use for mass analyses in certification system. The use of only visual method is insufficient for precise PSTV diagnostics. Bioassay on plant indicators is unusable for quick diagnostics of large quantity of samples because of long period of time necessary for receiving the results, labor-consuming nature of the process and lack of absolute reliability. The electrophoresis in PAAG with use of tomato - intermediate is the most suitable for mass analyses among 3 methods of PSTV diagnostics studied. Method of RNA viroid band determination by nomogram with the use of Rm constant is approbated.
