CC BY
9УДК 635.21:632.07
Вестник защиты растений, 2, 2003
Краткие сообщения
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ С МЕТКОЙ ДИГОКСИГЕНИНОМ (ДИГ) ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ВИРОИДА ВЕРЕТЕНОВИДНОСТИ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ (ВВКК) В МЕРИСТЕМНОМ МАТЕРИАЛЕ
Э.В.Трускинов*, Д.В.Фролова*, Л.П.Козлов**, Л.В.Солянкина**, Т.А.Якуткина**
*Всероссийский НИИ растениеводства им. Н.И.Вавилова, Санкт-Петербург **Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург
Веретеновидность клубней - опасное заболевание картофеля, которое долгое время считали вирусным и лишь в 1970-х годах признали возбудителем болезни особый патоген, названный вироидом (Diener,1968). Вироид веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) представляет собой однонитевую низкомолекулярную РНК, состоящую из 359 нуклеотидов.
Во многих странах мира заболевание считается карантинным и строго контролируется при экспорте-импорте семенного материала (Bull. OEPP,1978). В России и странах СНГ веретеновидность клубней встречается сравнительно часто, нанося значительный ущерб картофелеводству.
ВВКК обладает чрезвычайно высокой инфекционностью, благодаря чему легко проникает в ткани растений, в том числе в ткани апикальной меристемы. Вот почему растения, зараженные ВВКК, непригодны ни для семеноводства, ни для селекции. В отсутствие должного контроля за инфекцией в процессе микро-клонального размножения в культуре in vitro происходит массовое перезаражение меристемного материала, так как основной способ передачи инфекции контактный. Кроме того, вироид обладает очень высокой термостойкостью, позволяющей ему выживать при спиртовом обжиге режущего инструмента.
Единственным реальным способом борьбы с ВВКК является отбор свободного от патогена семенного материала и тщательный контроль за исходными ме-ристемными растениями. Этот контроль может быть осуществлен с помощью различных методов диагностики: визуального, индикаторного, электрофореза в ПААГ, молекулярной гибридизации и
полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Визуальный метод широко используется для определения зараженных растений в поле, но не позволяет проводить диагностику скрытых форм инфекции.
Возможности индикаторной диагностики ВВКК также ограничены. Метод растений-индикаторов - достаточно длительный и не всегда достоверный тест. Он во многом зависит от условий проведения (температуры, освещенности тест-растений).
Из других методов диагностики ВВКК следует выделить электрофорез в ПАГГ, сыгравший положительную роль при отборе семенного материала, свободного от вироида. Во многих странах электрофорез был использован для сертификации картофеля, однако в последние годы он постепенно вытесняется более чувствительными и специфичными молекуляр-но-генетическими методами, такими как ПЦР и молекулярная гибридизация.
Практический интерес к последнему значительно возрос после того, как появилась возможность замены радиоактивной метки нуклеотидов на нерадиоактивные, работать с которыми удобней и безопасней. К числу таких меток относится биотин (Mc Innes et al.,1989), диен-платиновая метка (Дрыгин и др.,1996; Мусин и др,1997) и стероидный гормон дигоксигенин (ДИГ) (Welnicki et al.,1992; Singh et al.,1994,), на основе которого известная фирма Boehringer-Mannheim создала универсальные диагностические наборы (Nucleic Acid Detection Kit), позволяющие проводить гибридизационный анализ различных РНК и ДНК содержащих объектов.
Метод гибридизации с меткой ДИГ
Вестник защиты растений, 2, 2003 был испытан нами для диагностики ВВКК на обширном материале коллекции картофеля in vitro, оздоровленном от вирусов с помощью культуры апикальных меристем, а также исходных мери-стемных клонов районированных и перспективных сортов картофеля, принадлежащих разным семеноводческим учреждениям Ленинградской области.
Методика. Диагностика ВВКК методом молекулярной гибридизации с меткой ДИГ представляет собой сочетание молекулярно-генетического и иммунохи-мического методов и состоит из ряда этапов. В методике использован классический вариант получения кРНК-зонда на ДНК-матрице в присутствии 4-х типов нуклеазид-5-фосфатов и фермента РНК-полимеразы. В данном случае в качестве матрицы взята кДНК, источником которой явилась рекомбинантная плаз-мида рGEM-3Zf, имеющая вставки 4-х копий вироидной РНК, а среди четырех типов нуклеазидов - один (урацил) мечен ДИГ. Полученная таким образом меченная РНК полностью комплементарна ВВКК и способна образовывать с ним специфический гибридный дуплекс. Последний регистрируют с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) анти-ДИГ конъюгатом со щелочной фосфатазой, так как дигоксиге-нин - гаптен и способен вызывать образование специфических антител.
Приготовление кРНК-зонда. В качестве матрицы для приготовления кРНК-зонда был использован 1 мкг линейной к-ДНК. Реакционная смесь общим объемом 20 мкл состояла из кДНК, нуклеазид-фосфатов, один из которых был мечен ДИГ, Т-7 РНК-полимеразы, буфера и дистиллированной воды. Смесь инкубировали 2 часа при 37°С и использовали немедленно или хранили при -20°С.
Подготовка образцов. Подготовка образцов состояла в выделении суммарных РНК из 100 мг листьев исследуемых растений путем экстракции в трис-буфере, обработки фенол-хлороформом с последующим осаждением двумя объемами спирта. Осадки растворяли в 20-40 мкл бидистиллированной воды.
Проведение анализа. Все этапы анализа проводили на нейлоновой мембране (Boehringer Mannheim Nylon Membranes) размером 10-15 см. Мембраны были предварительно расчерчены карандашом на клетки для нанесения проб (0.5x0.5 см). Пробы объемом 2 мкл наносили на мембрану. В качестве положительного контроля наносили пробы, выделенные из зараженных ВВКК растений, в качестве отрицательного контроля - из заведомо здоровых растений картофеля. После нанесения проб мембрану подсушивали, а затем фиксировали в термостате при 80°С в течение 2 часов. Если мембрану не использовали сразу, то ее хранили в сухом и темном месте при комнатной температуре. Подготовку мембраны к гибридизации (прегибридизацию) проводили в герметичном полиэтиленовом пакете размером чуть больше мембраны, в специальном буфере фирмы при 60-68°С в течение 30 мин или ночи. Гибридизацию проводили при 68°С в течение ночи, выдерживая мембрану в растворе, который содержал гибридиза-ционный буфер и реакционную смесь кРНК. После гибридизации мембрану дважды промывали в буферных растворах при 60-68°С в течение 20 мин. Затем проводили иммунологическую диагностику, все этапы которой выполнялись при комнатной температуре. Мембрану отмывали в промывочном буфере 1 мин, а затем инкубировали 30 мин в блокирующем буфере. Мембрану обрабатывали анти-ДИГ конъюгатом в разведении 1:5000 в течение 30 мин. После трехкратного промывания мембраны в специальных буферах ее обрабатывали раствором, содержащим субстрат нитрого-лубой тетразолил (NBT), 5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфат (BCIP) и трис-буфер с рН 9.5. Для развития окраски мембрану выдерживали 30-60 мин в темноте при 37 °С. При наличии ВВКК в пробах анализируемых растений на мембране проявлялись пятна голубого цвета, хорошо заметные визуально.
Результаты исследований. Из 146 образцов проверенного материала ВИР ви-
роид выявлен в 14 образцах. Из них он обнаружен только в одном из образцов in vitro, освобожденных от вирусов методом культуры апикальных меристем в ВИР-сорт Агрономический, а также четырех сортах, присланных в культуре in vitro из НИИ картофельного хозяйства (Голубизна, Десница, Осень, Ресурс). Наличие в них вироида подтверждено данными, полученными в Польше методом ПЦР. Кроме того, ВВКК обнаружен в одном из тепличных образцов Solanum andigenum без симптомов поражения, а также в образцах диких видов S.berthaultii и S.tarijense, предварительно искусственно зараженных вироидом. Остальные образцы (сорта Невский, Луговской) были отобраны ранее на семеноводческих посадках в Ленинградской области по признакам симптомного поражения ВВКК.
Около 100 исследованных ВИЗР образцов были представлены исходным материалом районированных и перспективных сортов, принадлежащих ведущим хозяйствам Ленинградской области, размножающим меристемные растения. Значительная часть этих сортов была проверена на ВВКК в 1998-1999 годах методом электрофореза в ПААГ и ПЦР, а затем передана для размножения в хозяйства в рамках региональной программы "Вироид". Среди тестированных сортов Невский, Петербургский, Чародей, Елизавета, Рождественский, Снегирь, Жаворонок, Оредежский, Елисеевский, Сказка, а также некоторые сорта зарубежной селекции - Sante, Timo, Adretta, Latona и др. Все исследованные сорта
Вестник защиты растений, 2, 2003 дали отрицательную реакцию гибридизации с ДИГ. Это доказывает, что в настоящее время семеноводческие хозяйства области работают с материалом, свободным от вироида.
Таким образом, диагностика ВВКК ДИГ-гибридизацией является высокочувствительным и специфичным методом исследования. Он пригоден для тестирования меристемных растений. Для приготовления пробы требуется небольшое количество материала, при этом для диагностики можно брать листья, ростки и клубни картофеля.
Метод не требует сложной аппаратуры и с его помощью можно проводить одновременно сотни анализов. Результаты тестирования регистрируют визуально. Данные литературы показывают, что гибридизация с ДИГ позволяет определять как слабые, так и сильные штаммы ВВКК (Singh et al.,1994). Еще одно достоинство метода состоит в его универсальности. При наличии соответствующего меченного ДИГ - зонда и небольших изменений в методике он может служить хорошим тестом для некоторых вирусов растений. Единственная причина, ограничивающая его использование, - относительно высокая стоимость фирменных наборов, однако при экономном расходовании реактивов затраты на приобретение набора могут быть оправданы.
Работа выполнена в рамках международного проекта CEEM. Авторы выражают благодарность сотруднику Корнелл-ского университета (США) П.Руссо за оказанную помощь при проведении работы.
Дрыгин Ю.Ф., Мусин С.М., Кондакова О.А., Савенков Е.И., Соломатин С.В., Можаева К.А., Атабеков И.Г. Молекулярная диагностика зараженности оздоровленных сортов картофеля ВВКК. /Доклады РАСХН, 6, 1996, с.24.
Мусин С.М., Бойко В.В., Анисимов Б.В., Дрыгин Ю.Ф. Разработка метода для определения ВВКК и создание диагностикума с нерадиоактивной меткой. /Актуальные проблемы современного картофелеводства. М., 1997, с.103-105.
Diner T.O. Potato spindle tuber virus: in situ sensitivity of the infection agent to ribonuclease.
/Phytopathology, 58, 1968, p.1048.
Mc Innes G.L., Habili N., Symons R.H. Nonradioactive, photobiotin-labelled DNA probes for routine diagnosis of viroids in plant extracts. /J. Virol. Methods, 23, 3, 1989, p.299-312.
Singh R.P., Doucher A., Larshaman D.K., Tavantzis S.M. Multimeric non-radioactive c RNA probes improve detection of PSTV. /J. Virology Methods, 49, 1994, p.221-234.
Welnicki M., Hiruki C. Highly sensitive di-goxigenin - labeled DNA probe for the detection of PSTV. /J. Virol. Methods, 39, 1992, p.91-99.
