CC BY
51
Ключевые слова: кожа, культуры клеток, фибробласты, пролиферативная активность.
COMPARATIVE EVALUATION OF METHODS FOR ISOLATION AND CULTIVATION OF DERMAL FIBROBLASTS
Altai State University, Barnaul N.M. Semenikhina, K.E. Abramova
The research objective was to determine the most optimal method for obtaining a culture of fibroblasts from human eyelid skin with high proliferative activity. The cell culture was obtained both by the enzymatic method with collagenase and by the migration method. The proliferative activity of cells was assessed at the 6th passage. During cultivation, cells of the mesenchymal phenotype, typical fibroblasts, were obtained. Cells are actively dividing, the logarithmic growth phase is 120 hours. The average doubling time of the cell population with the enzymatic method is 42 h +0.38, with the migration method - 42 h +0.64. Both methods have proven effective in obtaining dermal fibroblasts. The enzymatic method is faster, but requires collagenase. The migration method is more time-consuming, but at the same time we immediately get a population of only dermal fibroblasts. Keywords: skin, cell cultures, fibroblasts, proliferative activity.
УДК 576.5
DOI 10.31684/25418475_2021_2_111
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ
Алтайский государственный университет, г. Барнаул
Семенихина Н.М., Абрамова К.Е.
Целью исследования явилось определение наиболее оптимального метода получения культуры фиброб-ластов из кожи век человека, обладающих высокой пролиферативной активностью. Культуру клеток получали как ферментативным методом с коллагеназой, так и миграционным. Оценивали пролифе-ративную активность клеток на 6-м пассаже. В ходе культивирования были получены клетки ме-зенхимального фенотипа, типичные фибробласты. Клетки активно делятся, время логарифмической фазы роста 120 часов. Среднее время удвоения клеточной популяции при ферментативном методе - 42 ч+0,38, при миграционном методе - 42 ч+0,64. Оба метода оказались эффективными для получения дермальных фибробластов. Ферментативный метод более быстрый, однако требует наличия колла-геназы. Миграционный метод более длительный, но при этом мы сразу получаем популяцию только дермальных фибробластов.
Лечение людей с обширными пограничными и глубокими ожогами часто сопровождается осложненным течением ожоговой болезни и длительным периодом восстановления кожного покрова. Одним из путей повышения эффективности лечения в этих условиях является использование клеточных продуктов, в частности, трансплантация культивированных in vitro дермальных фибробластов [1, 2]. Клиническая эффективность фибробластов обусловлена их способностью продуцировать факторы роста и компоненты внеклеточного матрикса, регулировать рост, дифференцировку и функции эпидермальных, дермальных и иммунокомпе-тентных клеток, способствовать миграции кера-тиноцитов [3].
Культуру дермальных фибробластов используют также для получения тканеинженерных конструкций кожи [4]. Для данной цели клетки получают из биоптатов кожи человека и животных разными методами. Так, например, для
выделения клеток из фрагментов разных тканей используют механический или ферментативный методы. Первый метод более предпочтителен для дальнейшей стабильности клеточных культур, в частности, геномной. Опять же, ферментативный метод оказывает более сильный стресс при переводе клеток в условия in vitro [5]. Однако однозначных результатов, свидетельствующих о полном преимуществе одного метода над другим, в литературе нет.
Цель исследования - выявить наиболее оптимальный метод получения культуры дер-мальных фибробластов, обладающих высокой пролиферативной активностью.
Для достижения цели мы поставили перед собой ряд задач:
1) получить культуру фибробластов из биоп-татов кожи век человека ферментативным методом;
2) выделить фибробласты из кожи век человека механическим (миграционным) методом;
3) оценить морфологию и пролифератив-ную активность культур дермальных фиброб-ластов, полученных разными методами, на 6-м пассаже.
Материалы и методы
Выделение фибробластов осуществляли из биоптатов кожи век человека (после блефа-ропластики) от одного донора женского пола в возрасте 56 лет, двумя методами: ферментативным и механическим (миграционным). При получении биоматериала было получено информированное согласие от пациента, а также разрешение от локального этического комитета. Перед выделением клеток кожу очищали от крови и жира; промывали в трех сменах холодного буфера (4°С), нарезали на кусочки размером до 1 мм3 [6, 7].
Далее при ферментативном методе в гомогенизированную ткань добавляли фермент коллагена I типа с активностью 260,00 Ед/мг (Sigma, США), инкубировали при температуре 37°С в течение 12 часов, фильтровали через клеточный фильтр в пробирку с 10 мл ростовой среды; центрифугировали при 250 G 10 минут; осадок диссоциировали в ростовой среде ДМЕМ/ F12 (Gibco, США), 10% эмбриональной бычьей сыворотке (HyClone, США), антибиотик-ан-тимикотик 100Х (Gibco, США) и перенесли во флаконы площадью 25 см2. Культивирование осуществляли в СО2 инкубаторе при температуре 37°С и 5% СО2 до получения 80% монослоя. Культивирование производили до 6 пассажа.
При миграционном способе измельченную ткань переносили в чашку Петри и накрывали стерильным предметным стеклом для препятствия всплытия кусочков ткани. Далее добавляли ростовую среду ДМЕМ/Б12 (Gibco, США), 10% эмбриональную бычью сыворотку (Hy-Clone, США), антибиотик-антимикотик 100Х (Gibco, США). Культивирование осуществляли в СО2 инкубаторе при температуре 37°С и 5%
Рисунок 1 - Популяция клеток на 1 сутки культивирования.
СО2 Смену среды проводили ежедневно до тех пор, пока не удалились неприкрепившиеся к культуральной поверхности фрагменты ткани. При достижении зоны роста клеток размером 5-10 мм2 произвели процедуру пересева [7]. Культивировали до 6 пассажа во флаконах площадью 25 см2 в той же ростовой среде.
Морфологический анализ клеточных популяций производили под инвестированным микроскопом (№етп, Япония), при этом обращали внимание на форму клеток и ядер, их расположение.
Пролиферативную активность оценивали по индексу пролиферации (ИП) на 6-м пассаже [8, 9]. Строили кривую роста клеточной популяции. Для измерения среднего времени удвоения клеточной популяции каждый эксперимент повторяли 3 раза, ежедневно считая клетки в течение 5 суток (120 часов). Среднее время одного удвоения клеточной популяции (а) определяли по формуле Седова:
а=: 1п2/1п (МШо), где
Mt - количество клеток в момент времени ^
Мо - начальное количество клеток;
t - время логарифмической фазы роста клеточной культуры.
Достоверность полученных данных оценивали при помощи критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
При использовании как ферментативного, так и механического метода нами были получены популяции клеток.
Изначально при ферментативном воздействии коллагеназы 1 типа в течение 12 часов на кусочки кожи нами была получена популяция клеток со смешанным фенотипом, то есть была представлена клетками как мезенхималь-ного, так и эпителиального типов. Все клетки в течение часа прикрепились к поверхности чашки Петри (рисунок 1).
Рисунок 2 - Популяция клеток на 3 сутки культивирования.
Далее на протяжении 7 дней происходила пролиферация фибробластоподобных клеток, образование их колоний и отмирание эпителиальных клеток (рисунок 2). В ходе дальнейшего культивирования культура клеток постепенно приобретала однородный морфологический состав, к 3-му пассажу имела полностью мезен-химальный фенотип. При этом клетки имели веретеновидную или звездчатую форму, фор-
• - • • . " -
■ ш ф
Ж V ' ■
У: ' ,
:
Рисунок 3 - Культура клеток, полученная ферментативным методом.
Через 14-16 дней выявляли наличие клеток вокруг кусочков ткани, занимающих 70-80% площади чашки Петри.
При этом клетки имели гомогенный состав с мезенхимальным фенотипом: клетки верете-новидной или звездчатой формы, расположенные параллельно друг другу, образующие пучки.
К 5-му пассажу при пересадке в количестве 2,5 тыс. на 1 мл ростовой среды клетки достигали 80-100% монослоя через 6-7 дней. Количество клеток во флаконах при подсчете при помощи камеры Горяева составляло от 58 до 63 тысяч.
Для оценки скорости роста популяций фи-бробластоподобных клеток, выделенных разными методами, нами был вычислен индекс пролиферации и составлен график кривой роста на 6-м пассаже.
Анализ кривой роста показал, что клетки при обоих методах получения активно делятся, время логарифмической фазы роста составило 120 часов. Среднее время удвоения клеточной популяции при ферментативном методе - 42 ч +0,38, при миграционном методе - 42 ч+0,64.
Оба метода, ферментативный и механический (миграционный), показали свою эффективность при получении дермальных фибробластов из биоптатов кожи человека. Ферментативный метод более быстрый, так как уже через 7 дней возможно получить более или менее однородную популяцию фибробласто-подобных клеток. Однако для этого метода требуется дорогостоящий фермент коллагена-
мировали пучки. Цитоплазма клеток содержала мелкую зернистость, ядро было расположено в центре овальной формы, ядерно-цитоплазма-тическое соотношение среднее, ядрышек от 1 до 3 (рисунок 3).
При механическом (миграционном) методе выделения первый выход фибробластоподоб-ных клеток отмечался через 7 дней (рисунок 4).
-
--
V ЯШ 1
* 21' 1 ■
г ,нДНЯ1
\Ч Ji
У 11
~'' ИВ
/ ' 1 ' В ^7/ у
%
Рисунок 4 - Выход клеток из фрагмента кожи на 14 день культивирования.
за и необходимость контролирования времени воздействия, чтобы снизить риск его отрицательного влияния на клетки.
Механический метод более простой и дешевый, так как не требует использования ферментов. Однако он занимает намного больше времени (более 14 дней), в связи с чем идет расход ростовой среды. Но при этом мы получаем популяцию только дермальных фибробластов.
Заключение
Таким образом, учитывая, что скорость пролиферации дермальных фибробластов, выделенных разными методами на 6-м пассаже, совпадает, можно судить, что оба метода оказались эффективными для получения данной культуры клеток. Выбор метода основывается на наличии ферментных препаратов, в частности, коллагеназы, и количества времени, необходимого для получения культуры. При этом клетки при обоих методах получения активно делятся, время логарифмической фазы роста составляет 120 часов. Среднее время удвоения клеточной популяции при ферментативном методе - 42 ч +0,38 при миграционном - 42 ч+0,64.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Список литературы:
1. Островский Н.В., Одун Р.Д., Шиповская А.Б. Современные биотехнологии в лечении ожоговых ран. Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. 2007; 3-4: 88-90.
2. Блинова М.И., Хотин М.Г., Михайлова
H.А. Роль фибробластов в регенерации кожной ткани при заживлении ран. Гены и клетки. 2017; 12: 3.
3. Жиркова Е.А. Клинико-экспериментальное обоснование применения аллогенных фибробластов для лечения ожоговых ран Ша степени: автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2011. 25 с.
4. Мельникова Е.В., Меркулова О.В., Борисе-вич И.В., Меркулов В.А. От клеточных технологий к биомедицинским клеточным продуктам: опыт использования препаратов на основе жизнеспособных клеток человека в Российской Федерации. Цитология. 2018; 60(4): 231-240.
5. Mathilde Roger, Nicola Fullard, Lydia Costel-lo, Steven Bradbury. Bioengineering the microanatomy of human skin. Journal of Anatomy. 2019; 234(4): 438-455.
6. Williams R., Thornton M.J. Isolation of Different Dermal Fibroblast Populations from the Skin and the Hair Follicle. In: Botchkareva ., Westgate G. (eds) Molecular Dermatology. Methods in Molecular Biology, vol 2154. Humana, New York, NY, 2020. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0648-3_2
7. Крылова Т.А., Мусорина А.С., Зенин В.В., Кропачева И.В., Турилова В.И., Яковлева Т.К., Полянская Г.Г. Получение и характеристика неиммортализованных клеточных линий дер-мальных фибробластов. Цитология. 2016; 58(11): 850-864.
8. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н., Кольцова А.М. и др. Методическое пособие по работе с клеточными культурами человека и животных. СПб.: ПОЛИТЕХ-ПРЕСС, 2019. 114 с.
9. Ge S, Mrozik KM, Menicanin D, Gronthos S, Bartold PM. Isolation and characterization of mesenchymal stem cell-like cells from healthy and inflamed gingival tissue: potential use for clinical therapy. Regen Med. 2012; 7(6): 819-32. https:// doi:10.2217/rme.12.61
References
1. Ostrovsky N.V., Odun R.D., Shipovskaya A.B. Modern biotechnology in the treatment of burn wounds. Issues of Reconstructive and Plastic Surgery 2007; 3-4: 88-90. (In Russ.)
2. Blinova M.I., Khotin M.G., Mikhailova N.A. The role of fibroblasts in the regeneration of skin tissue during wound healing. Genes and Cells. 2017; 12: 3. (In Russ.)
3. Zhirkova E.A. Clinical and experimental substantiation of the use of allogeneic fibroblasts for the treatment of grade Ilia burn wounds: Author's abstract of the dis. ... of the cand. of med. sciences. Moscow, 2011. 25 p. (In Russ.)
4. Mel'nikova E.V., Merkulova O.V., Borisevich
I.V., Merkulov V.A. From cell technologies to biomedical cell products: experience of using drugs based on viable human cells in the Russian Federation. Cytology. 2018; 60(4): 231-240. (In Russ.)
5. Mathilde Roger, Nicola Fullard, Lydia Costel-lo, Steven Bradbury. Bioengineering the micro-anatomy of human skin. Journal of Anatomy. 2019; 234(4): 438-455.
6. Williams R., Thornton M.J. Isolation of Different Dermal Fibroblast Populations from the Skin and the Hair Follicle. In: Botchkareva ., Westgate G. (eds) Molecular Dermatology. Methods in Molecular Biology, vol 2154. Humana, New York, NY, 2020. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0648-3_2
7. Krylova T.A., Musorina A.S., Zenin V.V., Kro-pacheva I.V., Turilova V.I., Yakovleva T.K., Poly-anskaya G.G. Obtaining and characterization of non-immortalized dermal fibroblast cell lines. Cytology. 2016; 58(11): 850-864. (In Russ.)
8. Polyanskaya G.G., Efremova T.N., Koltso-va A.M. et al. Guidance manual for working with cell cultures of humans and animals. SPb .: POLI-TECH-PRESS, 2019.114 p. (In Russ.)
9. Ge S, Mrozik KM, Menicanin D, Gronthos S, Bartold PM. Isolation and characterization of mesenchymal stem cell-like cells from healthy and inflamed gingival tissue: potential use for clinical therapy. Regen Med. 2012; 7(6): 819-32. https:// doi:10.2217/rme.12.61
Контактные данные
Автор, ответственный за переписку: Абрамова Кристина Евгеньевна, лаборант Научно-исследовательского института биологической медицины Алтайского государственного университета, г. Барнаул. 656049, г. Барнаул, пр. Ленина, 61. Тел.: (3852) 298185. E-mail: asu.nii@mail.ru
Информация об авторах
Семенихина Наталья Михайловна, к.вет.н., старший научный сотрудник Научно-исследовательского института биологической медицины Алтайского государственного университета, г. Барнаул.
656049, г. Барнаул, пр. Ленина, 61. Тел.: (3852) 298185. E-mail: asu.nii@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-4954-1716
Поступила в редакцию 12.05.2021 Принята к публикации 16.06.2021
Для цитирования: Семенихина Н.М., Абрамова К.Е. Сравнительная оценка методов выделения и культивирования дермальных фиброб-ластов. Бюллетень медицинской науки. 2021;2(22): 111-114.
Citation: Semenikhina N.M., Abramova K.E. Comparative evaluation of methods for isolation and cultivation of dermal fibroblasts. Bulletin of Medical Science. 2021;2(22): 111-114. (In Russ.)
