CC BY
92
Сравнительная оценка двухлетков карпа (Cyprinus Сагрю L.) разного происхождения по морфологическим, гематологическим и иммунологическим показателям
Г.И. Пронина, к.в.н., ГНУ ВНИИР РСХА
Карпы разного генотипа по гену чешуи отличаются друг от друга по многим важнейшим морфологическим и функциональным признакам [1]. Имеются сведения, что карпы с разбросанным чешуйчатым покровом в условиях прудов с повышенными температурами имеют преимущества перед чешуйчатыми [2]. В то же время чешуйчатые карпы обладают высокой поисковой способностью.
Для оценки физиологического состояния рыб, помимо морфометрических, используются гематологические показатели. У костистых рыб наиболее активно гемопоэз происходит в лимфоидных органах, почках и селезёнке [3].
О состоянии иммунитета можно судить по активности фагоцитов крови. В реакциях фа-
гоцитоза у рыб активно участвуют макрофаги и нейтрофилы, последние составляют в периферической крови у разных видов рыб от 5 до 25% [4, 5].
В норме большинство нейтрофилов пребывает в инертном, покоящемся состоянии. Подобно другим лейкоцитам, их функциональные возможности раскрываются только на фоне стимулирующих воздействий. Проявление реактивности зрелого нейтрофила выражается в перестройке метаболизма, миграции, адгезии, поглощении, образовании пищеварительных вакуолей, секреторной дегрануляции.
Стимуляция радикально меняет метаболический профиль нейтрофила. К наиболее ярким сдвигам относится резкое увеличение расхода глюкозы в реакциях ГМФШ (гексозомонофос-фатный шунт). Если в покоящемся нейтрофиле
утилизируется лишь 1—2% глюкозы, то стимулированный нейтрофил способен окислить до 30% глюкозы [5]. Одновременно возрастают потребление кислорода и образование активных форм кислорода (АФК), которые включают в себя перекись водорода и свободные радикалы кислорода [6, 7].
Целью данной работы является сравнительная оценка физиолого-иммунологического статуса зеркальной и чешуйчатой линий карпа, а также определение критериев и нормативной базы по физиологическим и иммунологическим показателям.
Проверяемые двухлетки карпа со сплошным чешуйчатым покровом и разбросанным (зеркальным), отличающимся также по трансфериновым локусам, выращивались в рыбоводном хозяйстве «Ергенинский». В летне-маточном пруду площадью 0,8 га находилось 200 штук годовиков карпа (по 100 экземпляров каждой группы), 100 штук сома и 200 кг карасей, очевидно зашедших на стадии личинки через заградительные сетки. Дополнительного кормления не проводилось, во второй половине сезона карпы находились на полуголодном режиме, что сказалось на их росте и физиологическом состоянии.
Изучаемые рыбы оценивались по морфологическим (включая индексы внутренних органов), гематологическим, цитохимическим показателям. Изучался гемопоэз в почках, селезёнке и периферической крови в сравнительном аспекте. Отпечатки внутренних органов и мазки периферической крови, отобранной из хвостовой вены, окрашивали по Паппенгейму и микроскопировали.
Фагоцитоз оценивался по среднему цитохимическому коэффициенту содержания ли-зосомального катионного белка в нейтрофилах крови (СЦК), а также с помощью НСТ-теста с нитросиним тетразолием.
НСТ-тест позволяет оценить переваривающую способность нейтрофилов и определить долю клеток, способных формировать внутри себя фагосому. В ходе реакции нитросиний те-тразолий восстанавливается до нерастворимого диформазана, откладывающегося в клетках в виде тёмно-синих гранул.
По количеству отложившегося в клетках ди-формазана оценивали их активность в условных единицах и рассчитывали ИАН-индекс активации нейтрофилов [8]:
ИАН= (0 х Н0 + 1 х Н + 2 х Н2 + 3 х Н3)/100, (1)
где Н0, Н\, Н2, Н3 (%) — количество нейтрофилов
с активностью 0, 1, 2 и 3 балла соответственно.
Определялся ИАН и после стимуляции зи-мозаном в концентрации 2 мг/мл (НСТ индуцированный).
Показатели ДАН (динамика активации ней-трофилов) и функциональный резерв нейтро-филов расчитывались по формулам:
ДАН = НСТ индуцированный /
НСТ спонтанный (2)
Функциональный резерв нейтрофилов = (НСТ индуцированный —
НСТ спонтанный) х 100% (3)
Рост и развитие двухлетков двух групп были неодинаковыми. Для чешуйчатых характерна более высокая скорость роста, чем зеркальных. По морфометрическим признакам и росту имели определённое преимущество чешуйчатые карпы, имевшие наиболее высокую приспособляемость к неблагоприятным условиям (высокая зарас-таемость водоёма, отсутствие корма).
Зеркальные карпы отличаются повышением индексов печени, почек (кроветворные и выделительные функции), селезёнки (кроветворные функции) и уменьшением значений обхвата тела и индекса зрелости (табл. 1), т.е. реакция на факторы среды у рыб была неодинаковой. Обе группы относятся к высокопродуктивным (в течение двух поколений шла селекция на белковый рост).
Полученные данные свидетельствуют о том, что гемопоэз наиболее интенсивно протекал в почках и селезёнке, чем в периферической крови (табл. 2). Это связано с тем, что бластные формы из кроветворных органов попадают в кровь в небольшом количестве.
Наиболее значительное образование клеток миелоидного ряда отмечалось в почках чешуйчатых карпов по сравнению с селезёнкой и периферической кровью. У зеркальных карпов в почках и селезёнке уровень лимфопоэза был примерно одинаковым и значительно превышал таковой в крови. В изучаемых кроветворных органах относительное содержание метамиелоцитов и нейтрофилов (в основном палочкоядерных) было довольно высоким, особенно в почках чешуйчатых карпов. Данный факт объясняется усилением фагоцитоза погибших клеток и продуктов обмена, накопившихся в период подготовки к зимовке. Кроме того, при созревании гонад наблюдается дополнительный выброс токсинов, которые также подвергаются фагоцитозу в выделительных органах (почках). При этом происходит не только усиленное образование, но и разрушение фагоцитов: моноцитов и нейтрофилов. У исследуемых двухлетков происходило интенсивное созревание гонад, более значительное у зеркальных карпов по сравнению с чешуйчатыми, что видно по морфологическим индексам (у зеркальных примерно в два раза больше).
1. Морфологические показатели двухлетков карпа, «Ергенинский», 2009 г.
Показатели Чешуйчатые Зеркальные
М±т Су М±т Су
Масса, г 994±45,3 13,7 909±51,3 16,9
Относительная скорость роста, % 2332,4 - 1544,7 -
Морфологические индексы, %
Селезёнка 0,22±0,020 21,8 0,23±0,011 14,6
Почки 0,53±0,030 18,4 0,58±0,031 15,8
Печень 2,55±0,100 11,4 3,06±0,166 16,3
Сердце 0,16±0,010 10,6 0,16±0,004 8,2
Плавательный пузырь 0,59±0,020 9,1 0,61±0,015 7,4
Кишечник 1,60±0,10 19,0 1,74±0,133 23,0
Толщина кишечника, г/см 0,20±0,010 16,1 0,22±0,012 16,1
Гонады 1,72±0,300 52 3,49±0,208 70,0
Примечание: в каждой группе исследовалось по 10 экземпляров, масса и относительная скорость роста определялись у 100 рыб — по 50 экземпляров.
2. Соотношение форменных элементов в периферической крови и кроветворных
органах двухлетков карпа
Показатели Чешуйчатые Зеркальные
кровь почки селезёнка кровь почки селезёнка
Э ритропоэз, %
Гемоцитобласты и эритробласты 0,3±0,11 90,3 2,3±0,29 30,4 1,9±0,33 44,2 0,4±0,12 77,9 1,8±0,43 62,3 1,9±0,23 31,6
Нормобласты 2,6±0,42 40,0 5,2±0,59 28,0 5,0±0,63 31,0 2,7±0,50 48,6 3,5±0,66 50,1 4,3±0,65 40,5
Базофильные эритроциты 11,5±1,42 30,4 12,1±±1,29 26,2 12,9±1,58 30,1 12,2±1,99 43,1 11,5±1,62 37,3 11,7±1,85 41,9
Сумма зрелых и полихроматофильных эритроцитов 85,6±1,66 4,7 81,1±1,21 3,7 80,3±2,17 6,7 84,7±2,51 7,9 83,2±1,84 5,84 82,2±2,04 6,6
Лейкоцитарная формула, %
Миелобласты - 0,2±1,19 264,6 0,3±0,20 170,8 - 0,4±0,29 195,3 0,3±0,22 185,4
Промиелоциты - 1,4±0,26 170,8 - - 0,3±0,27 282,8 0,3±0,27 282,8
Миелоциты - 2,1±0,84 100,5 1,5±0,68 108,4 0,5±0,35 185,2 1,5±0,60 107,8 1,5±0,74 133,2
Метамиелоциты 1,0±0,76 182,9 7,7±1,46 46,8 4,4±1,14 62,8 2,7±0,96 93,8 5,5±1,15 55,7 5,3±0,90 45,3
Палочкоядерные нейтрофилы 2,7±1,22 109,2 6,6±1,40 51,7 5,3±1,02 46,9 3,9±1,60 107,5 6,2±1,08 46,0 6,4±0,94 38,7
Сегментоядерные нейтрофилы 2,3±0,99 103,9 1,0±0,82 193,7 4,0±1,23 75,8 1,4±0,56 108,1 3,5±0.96 72,4 1,8±0,89 130,2
Эозинофилы и псевдоэозинофилы - 0,4±0,32 183,6 0,4±0,31 196,6 0,2±0,15 188,9 0,2±0,15 189,0 0,3±0,19 186,2
Базофилы и псевдобазофилы - - - - 0,4±0,22 148,2 -
Лимфоциты 91,3±0,77 2,1 77,2±1,74 5,5 81,0±0,79 2,38 86,9±1,36 4,16 78,8±1,11 3,8 8 ,6 і> 0, 8
Моноциты 2,6±0,51 22,3 3,9±0,49 30,7 3,3±0,22 16,6 4,3±0,65 40,3 3,2±1,11 93,4 3,6±1,22 89,8
Примечание: в знаменателе Оу — коэффициент вариабельности
Содержание общего белка в сыворотке их крови находилось на высоком уровне для периода подготовки к зимовке (табл. 3).
Фагоцитарная активность зеркальных карпов значительно превышала таковую чешуйчатых по показателям НСТ-теста и по СЦК — среднему цитохимическому коэффициенту содержания лизосомального катионного белка в нейтрофилах
крови. Особенно значительные различия прослеживаются по индуцированному НСТ-тесту.
При активации нейтрофила происходит значительный расход глюкозы клеткой. Можно предположить, что тенденция к уменьшению содержания глюкозы в сыворотке крови зеркальных карпов по сравнению с чешуйчатыми связана с её повышенным расходованием при
3. Биохимические показатели сыворотки крови и цитохимические показатели фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови двухлеток карпа
Показатели Чешуйчатые Зеркальные Р-достоверность
Общий белок, г/дл 17,2±1,03 17,4±1,18 >0,05
Глюкоза, ммоль/л 9,1±1,12 7,6±1,24 >0,05
НСТ спонтанный 0,23±0,01 0,29±0,01 <0,05
17,4 12,6
% активности 11,9±0,62 16,1±0,91 <0,05
16,6 17,9
НСТ индуцированный 3 ,0 о" ^ Л ^ 62 ,4 0, 0,69±0,03 15,5 <0,05
% активности 21,6±1,54 32,0±1,43 <0,05
22,5 14,1
ДАН 2,03±0,19 29,2 2,43±0,16 20,3 >0,05
Функциональный резерв нейтрофилов, % 22,4±3,6 50,3 40,1±3,5 27,6 <0,05
СЦК 1,62±0,15 2,29±0,05 <0,05
Примечание: в знаменателе Оу — коэффициент вариабельности
4. Коэффициент корреляции Пирсона
Показатели Чешуйчатые Зеркальные
индекс почек индекс селезёнки индекс почек индекс селезёнки
% в крови
Палочкоядерные нейтрофилы -0,16 -0,55 0,55 -0,41
Сегментоядерные нейтрофилы 0,38 0,28 -0,46 0,76
Всего нейтрофилов 0,23 -0,52 0,44 -0,16
Лимфоциты -0,24 0,60 -0,77 0,67
Моноциты 0,54 -0,29 0,22 -0,44
% в почках
Метамиелоциты 0,40 -0,05 -0,69 0,77
Палочкоядерные нейтрофилы -0,39 -0,06 0,45 -0,48
Сегментоядерные нейтрофилы -0,01 0,15 -0,55 0,36
Всего нейтрофилов -0,39 0,03 -0,03 -0,13
Лимфоциты -0,18 0,07 0,24 -0,67
Моноциты -0,16 -0,40 0,09 0,28
% в селезёнке
Метамиелоциты -0,03 -0,29 0,32 -0,21
Палочкоядерные нейтрофилы -0,68 0,66 0,20 -0,25
Сегментоядерные нейтрофилы 0,42 0,12 -0,19 -0,25
Всего нейтрофилов -0,15 0,55 0,02 -0,20
Лимфоциты -0,06 -0,19 0,53 -0,29
Моноциты 0,61 0,04 -0,74 0,54
метаболическом взрыве нейтрофилов в процессе фагоцитоза.
Отмечается корреляция индексов внутренних органов (почек, селезёнки) с относительным содержанием нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов в периферической крови, почках, селезёнке (табл. 4). Имеются отличия разных групп карпов по этим показателям.
Показатели фагоцитарной активности по НСТ-тесту (спонтанная и индуцированная фагоцитарная активность, а также коэффициент стимуляции нейтрофилов и функциональный резерв нейтрофилов крови) в эксперименте не зависели от индекса внутренних органов рыб. Данный факт вполне понятен, так как активность фагоцитов связана с внутренним резервом самих клеток.
Однако отмечена значительная корреляция у рыб обеих групп с процентным содержанием палочкоядерных нейтрофилов в крови, почках и селезёнке (табл. 5).
Прослеживается следующая закономерность. Корреляция палочкоядерных нейтрофилов (высокая степень достоверности) с показателем спонтанного НСТ-теста отрицательная, а с индуцированным — положительная. Исключение составляет отсутствие корреляции нейтрофилов периферической крови чешуйчатых карпов с показателями НСТ-теста. Положительная корреляция с высокой степенью достоверности наблюдается по показателю относительного содержания палочкоядерных нейтрофилов в периферической крови, почках, селезёнке и динамикой их активации у зеркальных карпов.
5. Коэффициент корреляции показателей НСТ-теста с относительным содержанием нейтрофилов в периферической крови и внутренних органах двухлетков карпа
Показатели Кровь Почки Селезёнка
* ** ***о * ** *** * ** ***
Чешуйчатая группа
НСТ спонтанный 0,09 -0,14 -0,03 -0,32 -0,09 -0,37 -0,72 -0,20 -0,81
% активности О,1О -0,22 -0,13 -0,30 0,15 -0,20 -0,58 -0,21 -0,61
НСТ индуцированный 0,06 -0,01 0,08 -0,13 0,79 0,33 0,13 -0,41 0,20
% активности 0,03 -0,06 -0,03 -0,09 0,79 0,37 0,06 -0,32 0,20
ДАН 0,06 0,02 0,06 0,28 0,61 0,62 0,60 -0,11 0,75
Функциональный резерв нейтрофилов 0,02 0,05 0,09 0,01 0,78 0,46 0,42 -0,30 0,52
Зеркальная группа
НСТ спонтанный -0,52 0,67 -0,32 -0,64 0,34 -0,28 -0,65 0,16 -0,40
% активности 0,87 -0,31 0,86 0,32 -0,74 -0,27 0,25 -0,30 -0,03
НСТ индуцированный 0,52 0,28 0,69 0,29 -0,19 0,10 0,18 -0,09 0,08
% активности 0,27 0,60 0,55 -0,17 -0,11 -0,22 -0,19 -0,06 -0,19
ДАН 0,76 -0,24 0,76 0,66 -0,40 0,24 0,57 -0,20 0,31
Функциональный резерв нейтрофилов 0,66 0,46 0,77 0,49 -0,29 0,19 0,39 -0,14 0,21
Примечание: * палочкоядерные, ** сегментоядерные, *** всего нейтрофилов
Для чешуйчатых данная закономерность проявилась только по селезёнке, тогда как в почках индуцированная фагоцитарная активность и её динамика напрямую зависят от относительного количества сегментоядерных нейтрофилов. Вероятно, для чешуйчатых карпов сегментоядерные, а у зеркальных палочкоядерные нейтрофилы в селезёнке в большей степени несут нагрузку при индукции in vitro.
Таким образом, отмечаются определённые различия двух групп карпов по морфометрическим, гематологическим, цитохимическим показателям, что обусловлено их генетической и физиологической разнокачественностью. С большой степенью достоверности можно говорить о том, что фагоцитарная активность (по цитохимическому коэффициенту лизосомаль-ного катионного белка в нейтрофилах крови) у зеркальных карпов значительно превосходит таковую чешуйчатых карпов.
При этом карпы обеих линий имели довольно высокий коэффициент динамики активации нейтрофилов (по НСТ-тесту). Это в 2—2,5 раза больше, чем по данным, полученным Е.А. Забот-
киной [9] на карпах неизвестного происхождения. Очевидно, отбор карпов обеих групп на белковый рост (по АЛТ-аланинаминотрансферазе) существенно улучшил иммунофизиологический статус рыб.
Литература
1. Кирпичников В.С. 1979. Генетические основы селекции рыб. М.: Наука. 391 с.
2. Товстик В.Ф. Выращивание прудовой рыбы. Харьков: Прапор, 1989. 116 с.
3. Анисимова И.М., Лавровский В.В. Ихтиология. М.: Агро-промиздат, 1991. 288 с.
4. Микряков В.Р., Балабанова Л.В. Клеточные основы иммунитета рыб // Физиология и паразитология пресноводных животных. Л.: Наука, 1979. С. 125-132.
5. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1989. 344 с.
6. Firth M.A., Sheven P.E., Hodgins D.S. Passive and active components of neonatal innate immune defenses // Anim. Health. Res. Rev. Vol. 6, 2005. № 2. P. 143-158.
7. Marodi L. Innate cellular immune responses in newborns // Clinical Immunology. Vol. 118. 2006. P. 137-144.
8. Виксман М.Е., Маянский А.Н. Способ оценки функциональной активности нейтрофилов человека по реакции восстановления нитросинего тетразолия: метод. рекомендации. Казань: Казанский НИИЭМ, 1979. 11 с.
9. Заботкина Е.А. Особенности функциональной активности лейкоцитов периферической крови костистых рыб // Расширенные материалы Международной конференции «Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов». Борок, 2007. С. 23-27.
