CC BY
5
DOI: 10.24412/2074-5036-2023-4-10-14 УДК: 619:616.98:578.853.1
Ключевые слова: Gallería mellonella, штаммы Bacillus thuringiensis, «Антигаллерин», «Лепидоцид», «Битоксибациллин»
Keywords: larvae Galleria mellonella, strains Bacillus thuringiensis, "Antigallerin", "Lepidocid", "Bitoxibacillin"
Желябовская Д. А., Шульга И. С., Лаврушина Л. А., Остякова М. Е.
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ШТАММОВ BACILLUS THURINGIENSIS И ПРЕПАРАТОВ НА ИХ ОСНОВЕ В ОТНОШЕНИИ
ЛИЧИНОК GALLERIA MELLONELLA
COMPARATIVE EVALUATION OF THE BIOLOGICAL EFFICACY OF STRAINS BACILLUS THURINGIENSIS AND PREPARATIONS BASED ON THEM WITH REGARD TO THE LARVAE OF GALLERIA MELLONELLA
ФГБНУ «Дальневосточный зональный научно-исследовательский ветеринарный институт». Адрес: 675000, Россия, г. Благовещенск, ул. Северная, д. 112
Federal State Bugetary Scientific Institución "Far East Zone Research Veterinary Institute". Address: 675005, Russia, Blagoveshchensk, Severnaya st., 112
Желябовская Дина Анатольевна, кандидат биологических наук, заведующая отделом микробиологии, вирусологии и иммунологии. E-mail: dalznivilabmicro @mail.ru
Zhelyabovskaya Dina Anatolyevna, PhD of Biological Sciences, Head of Department of Microbiology,
Virology and Immunology. E-mail: dalznivilabmicro @mail.ru Шульга Ирина Станиславовна, кандидат биологических наук, заместитель директора по науке.
E-mail: dalznivilabmicro @mail.ru Shulga Irina Stanislavovna, PhD of Biological Sciences, Deputy Director for Science. E-mail: dalznivilabmicro @mail.ru. Лаврушина Любовь Анатольевна, научный сотрудник отдела микробиологии, вирусологии и иммунологии.
E-mail: dalznivilabmicro @mail.ru. Lavrushina Lyubov Anatolyevna, Staff Scientist of Department of Microbiology, Virology and Immunology.
E-mail: dalznivilabmicro @mail.ru. Остякова Марина Евгеньевна, доктор биологических наук, доцент, директор. Ostyakova Marina Evgenievna, Doctor of Biological Sciences, Associate Professor, Director.
Аннотация. Важнейшая отрасль сельского хозяйства Дальневосточного федерального округа - пчеловодство. Опасный вредитель медоносной пчелы - большая восковая моль. Наиболее перспективным методом борьбы является применение биоинсектицидов. В качестве основы для биологических инсектицидов широко используются спорообразующие бактерии Bacillus thuringiensis. Штаммы одного и того же вида Bacillus thuringiensis, обладают разными уровнями патогенности к личинкам различных насекомых. Произведено изучение инсектицидной активности разных энтомопатогенных препаратов, содержащих в своем составе культуру Bacillus thuringiensis. Исследования доказывают высокую энтомопатогенную активность опытного препарата «Антигаллерин» и его специфичность в отношении личинок большой восковой моли в сравнении с препаратами «Лепидоцид» и «Битоксибациллин». Так же проведена оценка инсектицидной активности музейных коллекционных штаммов B. thuringiensis за восьмилетний период хранения. Выявлено, что перспективность применения штаммов B. thuringiensis 00045, B. thuringiensis 851 и B. thuringiensis 859 для борьбы с восковой молью остается актуальной.
Summary. The most important branch of agriculture in the Far Eastern Federal District is beekeeping. The large wax moth is a dangerous pest of the honey bee. The most promising method of control is the use of bioinsecticides. The spore-forming bacteria Bacillus thuringiensis are widely used as the basis for biological insecticides. The strains of the same species of Bacillus thuringiensis have different levels of pathogenicity to the larvae of various insects. The insecticidal activity of various entomopathogenic preparations containing the Bacillus thuringiensis culture was analyzed. Our study has proved a high entomopathogenic activity of the experimental drug "Antigallerin" and its specificity against the larvae of the large wax moth in comparison with the drugs "Lepidocide" and "Bitoxibacillin". The insecticidal activity of museum collection strains of B. thuringiensis over an eight-year storage period was also evaluated. It was revealed that the prospects for the use of strains B. thuringiensis 00045, B. thuringiensis 851 and B. thuringiensis 859 for the fight against the wax moth remain relevant.
Введение
Климатические условия Дальневосточного федерального округа позволяют заниматься одной из важнейших отраслей сельского хозяйства -пчеловодством. Однако, условия благоприятны так же и для развития одного из опасных вредителей медоносных пчел - большой восковой моли. Личинки моли поражают пчелиные семьи, результатом чего является снижение их продуктивности, гибель расплода и в итоге оставление пчелами своих ульев [2].
Для борьбы с личинками большой восковой моли применяют химические инсектициды. Применение данного метода связано со снижением качества и безопасности продуктов питания человека, с нанесением вреда окружающей среде и, следовательно, с негативным воздействием на экологическое благополучие экосистем [8]. Также, несмотря на большое разнообразие и разную структуру химических веществ, применяемых для борьбы с насекомыми, при воздействии одним классом инсектицидных препаратов возникает кросс-резистентность к препаратам других классов. При этом кросс-резистентность может формироваться к химическим веществам, которые раннее не применялись [11].
В условиях органического пчеловодства наиболее перспективным является применение альтернативного метода - использование биологических мер борьбы с Galleria mellonella. Таким методом является применение биоинсектицидов. Они содержат микроорганизмы и продукты их жизнедеятельности. Биоинсектициды экологически безопасны, избирательно действуют на личинок чешуекрылых, безвредны для людей и теплокровных животных, отличаются высокой степенью эффективности и экологичностью, так как не обладают токсичными свойствами для теплокровных животных [1]. В качестве основы для биологических инсектицидов - современной экологически и социально приоритетной альтернативы химическим пестицидам - в настоящее время широко используются спорообразующие бактерии Bacillus thuringiensis [3].
В отделе микробиологии ФГБНУ ДальЗНИ-ВИ на основе спорово-кристаллического комплекса штамма Bacillus thuringiensis 846-Bt, запатентованного под номером RCAM 00045 [10], разработан опытный биоинсектицид для борьбы с большой восковой молью - «Антигаллерин», обладающий высокой энтомопатогенной активностью против личинок Galleria mellonella [12].
Известно, что белки параспоральных кристаллов энтомопатогенной бактерии B. thuringiensis
(5-эндотоксины) проявляют высокоспецифичную активность против ряда насекомых, нематод, клещей и поэтому являются основным токсическим компонентом биопестицидов [4].
Однако разные штаммы одного и того же вида БаеШш thuringiensis могут обладать разными уровнями патогенности к личинкам различных насекомых [9]. Поэтому мы провели сравнительную оценку инсектицидной активности экспериментального препарата «Антигаллерин» на основе штамма БаеШш thuringiensis RCAM 00045 и отечественных препаратов «Лепидоцид» и «Битоксибациллин», которые являются основой экологически безопасной защиты от насекомых-вредителей, в том числе молей и огневок.
Также, по мнению некоторых исследователей, при длительных пересевах энтомопатогенных штаммов БаеШш thuringiensis бактерии способны снижать, а зачастую и терять свою энтомопа-тогенную активность в процессе хранения [6]. В связи с этим фактом принято решение о проведении сравнения инсектицидной активности штаммов БаеШш thuringiensis, находящихся на хранении в отделе в течение восьми лет.
Цель исследования - провести сравнительную оценку биологической эффективности опытного препарата «Антигаллерин», препаратов «Лепидоцид», «Битоксибациллин», а также коллекционных штаммов БаеШш thuringiensis, находящихся на длительном хранении.
Материалы и методы
Материалом для исследования послужили выделенные и идентифицированные ранее штаммы Б. thuringiensis: Bt RCAM 00045, Bt 850, Bt 851 и Bt 859, а также опытный образец препарата на основе штамма Bt RCAM 00045 «Антигаллерин». Исследуемые отечественные биологические препараты «Лепидоцид» и «Битоксибациллин» разработаны на основе Б. thuringiensis уаг. kurstaki и Б. thuringiensis уаг. thuringiensis соответственно.
Испытание инсектицидной активности культур и препарата проводили в лабораторных условиях в соответствии с методическими рекомендациями [5] и методическими указаниями [7].
Для получения опытного препарата проводили культивирование бактерий штамма БаеШш thuringiensis ВНИИСХМ RCAM 00045 на МПА в аэробных условиях. Учитывали инсектицидную активность культуры БаеШш thuringiensis. Отбирали культуры со 100 %-ной инсектицидной активностью в отношении личинок большой восковой моли.
В процессе работы изготавливали мазки культуры, окрашивали их и методом световой
микроскопии определяли способность культуры к образованию белковых кристаллов. Действующее начало препарата - спорово-кристаллический комплекс Bacillus thuringiensis ВНИИСХМ RCAM 00045. Полученный опытный инсектицидный препарат представляет собой однородный порошок светло-серого цвета.
Для проведения эксперимента по выявлению инсектицидной активности в отношении личинок большой восковой моли опытного биоинсектицида «Антигаллерин» и препаратов «Лепидоцид» и «Битоксибациллин» были сформированы контрольная и три опытных группы по 10 личинок в каждой. Для заражения личинок восковой моли использовали вощину, предварительно обработанную суспензией испытуемого препарата «Анти-галлерин». Разведение препаратов «Лепидоцид» и «Битоксибациллин» проводили согласно инструкции по их применению. Личинкам, принадлежащим контрольной группе, скармливали необработанное восковое сырье. Гибель тест-объектов учитывали в течение 10 суток. Эксперимент проведен в трех повторностях.
Для проведения исследования по изучению инсектицидной активности штаммов Bacillus thuringiensis: Bt RCAM 00045, Bt 850, Bt 851 и Bt 859, находящихся в коллекции культур научно-исследовательского института, были сформированы контрольная и пять опытных групп по 10 личинок большой восковой моли в каждой. Эксперимент также проведен в трех повторностях.
Заражение личинок проводили перораль-но, методом свободного поедания воскового
сырья, предварительно обработанного спо-рово-кристаллическим комплексом исследуемых штаммов Bacillus thuringiensis, хранение которых осуществляли в течение восьми лет. На начальной стадии хранения инсектицидная активность составляла 100 % штаммов Bacillus thuringiensis.
Обработанный и высушенный корм в количестве 3-5 г помещали в стерильные чашки Петри и подсаживали в каждую по 10 личинок восковой моли одного возраста. Тест-объектам контрольной группы скармливали необработанное восковое сырье. Гибель гусениц учитывали в течение 10 суток.
Инсектицидную активность испытуемого препарата рассчитывали по формуле Аббота [5].
Результаты исследований и их обсуждение
Результаты сравнения инсектицидной активности экспериментального препарата «Антигалле-рин» и отечественных препаратов «Лепидоцид» и «Битоксибациллин» отражены в таблице 1.
Массовая гибель личинок большой восковой моли в группе, где использовали препарат «Антигаллерин»? началась на второй-третий день после постановки эксперимента и в итоге оказалась в первой и второй повторностях эксперимента 100 %-ной и в третьей повторности -90 %-ной (Табл. 1).
В группах, где применяли «Лепидоцид» и «Би-токсибациллин», смертность личинок большой восковой моли была незначительной, всего 5 и 12 тест-объектов соответственно за весь период на-
Таблица 1
Инсектицидная активность экспериментального препарата «Антигаллерин» и отечественных препаратов «Лепидоцид» и «Битоксибациллин»
Количество Учет гибели личинок, сут., шт. Инсекти-
Испытуемый препарат Повтор-ность тест-объектов в опыте, шт. 3 5 7 10 за 10 сут. цидная активность по Абботу, %
1 10 6 4 0 0 10
«Антигаллерин» 2 10 5 3 2 0 10 96,6
3 10 4 2 3 0 9
1 10 0 0 0 1 1
«Лепидоцид» 2 10 0 0 1 1 2 16,6
3 10 0 0 2 0 2
1 10 0 1 3 1 5
«Битоксибациллин» 2 10 0 0 2 1 3 40,0
3 10 0 1 1 2 4
1 10 0 0 0 0 0
Контроль 2 10 0 0 0 0 0 -
3 10 0 0 0 0 0
блюдения, остальные личинки выжили и продолжили свой цикл развития.
В контроле личинки активно потребляли корм, были подвижны, по мере завершения цикла развития превращались в куколки, из которых впоследствии выводились бабочки большой восковой моли. Гибели тест-объектов в контрольных группах не наблюдалось.
Инсектицидная активность по Абботу препарата «Антигаллерин» составила 96,6 %. У препарата «Битоксибациллин» активность была меньше в 2,4 раза, а у «Лепидоцида» - в 5,8 раза по сравнению с опытным препаратом «Антигаллерин».
При этом гибель тест-объектов после воздействия на них опытным препаратом «Антигалле-рин» наблюдалась преимущественно с третьего по седьмой день эксперимента, а личинки большой восковой моли после воздействия на них препаратами «Битоксибациллин» и «Лепидо-цид» гибель насекомых отслеживалась с пятого по десятый дни опыта.
Сравнительное изучение инсектицидной активности разных энтомопатогенных препаратов, содержащих в своем составе культуру Bacillus thuringiensis, доказывает высокую энтомопато-генную активность препарата «Антигаллерин» и его специфичность в отношении личинок большой восковой моли.
Инсектицидная активность штаммов Bacillus thuringiensis, отобранных для хранения в отделе научно-исследовательского института, была 100 %-ной, поэтому полученные экспериментальные данные по инсектицидной активности коллекционных штаммов Bacillus thuringiensis сравнили со 100 %-ным результатом (табл. 2).
Гибель личинок большой восковой моли во всех опытных группах началась на второй-тре-тий день после постановки эксперимента. Личинки контрольных групп были активными, подвижными и впоследствии продолжали свой цикл развития. Гибели личинок восковой моли в контроле не наблюдали.
Анализ таблицы 2 показал, что в процессе хранения коллекционных штаммов, через восемь лет 100 %-ная инсектицидная активность сохранилась только у двух штаммов: Bt RCAM 00045 и Bt 851. У штамма B. thuringiensis 850 инсектицидная активность снизилась 26,7%, у штамма B. thuringiensis 859 - на 6,7 % от первоначальной, 100 %-ной активности по Абботу. Несмотря на некоторое снижение инсектицидной активности у коллекционных штаммов B. thuringiensis за прошедшие восемь лет, у штаммов B. thuringiensis RCAM 00045, B. thuringiensis 851 и B. thuringiensis 859 перспективность их применения для борьбы с восковой молью остается актуальной.
Таблица 2
Сравнительная характеристика инсектицидной активности коллекционных штаммов Bacillus thuringiensis
Испытуемый штамм Bacillus thuringiensis Инсектицидная активность по Абботу в начале хранения, % Повторность Количество насекомых в опыте, шт. Учет гибели личинок за 10 суток Инсектицидная активность по Абботу через 8 лет хранения, %
B. thuringiensis RCAM 00045 1 10 10
100 2 10 10 100
3 10 10
B. thuringiensis 850 1 10 8
100 2 10 6 73,3
3 10 8
B. thuringiensis 851 1 10 10
100 2 10 10 100
3 10 10
B. thuringiensis 859 1 10 10
100 2 10 9 93,3
3 10 9
1 10 0
Контроль - 2 10 0 -
3 10 0
Заключение
При изучении сравнительной оценки инсектицидной препарата «Антигаллерин» на основе штамма Bacillus thuringiensis RCAM 00045 и отечественных препаратов «Лепидоцид» и «Битоксибациллин» установлено, что инсектицидная активность препарата «Антигаллерин» составила 96,6 %. У препарата «Битоксибациллин» и «Лепидоцида» активность была ниже в 2,4 и в 5,8 раза по сравнению препаратом «Антигаллерин». Наблюдаем высокоспецифич-ность инсектицидного действия и высокую энтомопатогенную активность опытного препарата «Антигаллерин» в отношении личинок Galleria mellonella.
В процессе хранения музейных коллекционных штаммов B. thuringiensis, за восьмилетний период сохранность 100 %-ной инсектицидной активности наблюдалась у двух штаммов: B. thuringiensis RCAM 00045 и B. thuringiensis 851. У штамма B. thuringiensist 850 произошло снижение данного показателя на 26,7%, у B. thuringiensist 859 - на 6,7 % от первоначальной 100 %-ной активности, но эффективность коллекционных штаммов в отношении личинок восковой моли является довольно высокой и не становится ниже отметки в 70%. Таким образом, перспективность применения штаммов B. thuringiensis 00045, Bt 851 и Bt 859для борьбы с восковой молью остается актуальной.
Список литературы
1. Бойкова И. В. Биологическая эффективность новых препаративных форм биоинсектицида на основе Bacillus thuringiensis против колорадского жука / И. В. Бойкова, И. И. Новикова, С. Р. Фасулати, В. А. Павлюшин // Вестник защиты растений, 2012. № 4. С. 57-60.
2. Гробов О. Ф. Болезни и вредители медоносных пчел: Справочник / О. Ф. Гробов, А. М. Смирнов, Е. Г. Попов. М.: Агропромиздат, 1987. 334 с.
3. Ермолова В. П. Инсектицидные свойства Bacillus thuringiensis var. israelensis. Сообщение I: Спектр дей-
ствия ларвицидного препарата на основе производственного штамма 7-1/23А / В. П. Ермолова, С. Д. Гричешкина, А. М. Рахман, К. С. Антонец, М. Е. Белоусова, В. В. Яхно, А. А. Нижников // Сельскохозяйственная биология, 2019. Т 54. № 6. С. 1267-1280.
4. Климентова Е. Г. Антибиотическое действие белков параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis на условно патогенные бактерии микробиоты толстого кишечника животных / Е. Г. Климентова, Т. Г. Юдина, Д. А. Васильев, Н. А. Феоктистова // Актуальные вопросы ветеринарной биологии, 2012. № 4(16). С. 12-16.
5. Кольчевский А. Г. Выделение и отбор высоковирулентных культур Bacillus thuringiensis var. galleriae: методические рекомендации / А. Г. Кольчевский [и др.]; ВНИИ защиты растений. Л., 1987. 21с.
6. Крыжко А. В. Выделение и изучение новых высокоактивных штаммов Bacillus thuringiensis / А. А. Крыжко, Л. Н. Кузнецова // Таврический вестник аграрной науки, 2016. № 4(8). С. 30-36.
7. Лескова А. Я. Идентификация культур Bacillus thuringiensis и оценка их патогенных свойств: метод. указания / А. Я. Лескова [и др.]; ВНИИ защиты растений, ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии. Л.,1984. 20 с.
8. Липатников К. В. Изучение ларвицидной активности производных гетариламмония / К. В. Липатников, Ф. В. Со-бин, Н. А. Пулина, И. П. Рудакова // Фармация, 2017. Т. 66. № 4. С. 45-47.
9. Лозовская М. В. Оценка биологической активности некоторых коллекционных штаммов Bacillus thuringiensis по отношению к личинкам чешуекрылых на модельном объекте Galleria mellonella / М. В. Лозовская, И. И. Новикова, И. В. Бойкова, Н. В. Смирнова, М. И. Пироговский, А. С. Павленко, Г. А. Кузнецова // Естественные науки, 2014. № 4 (49). С. 95-100.
10. Пат. 2453595 Российская Федерация, МПК d2N 1/20 Штамм бактерий Bacillus thuringiensis для получения биоинсектицида для борьбы с большой восковой молью / Н. Е. Горковенко, Ю. А. Макаров, В. А Серебрякова; Заявитель и патентообладатель Дальневосточный зон. науч.-ис-след. ветеринар. ин-т. - № 2011110498/10; опубл. 20.06.2012, Бюл. № 17. 4 с.
11. Соколянская М. П. Кросс-резистентность устойчивых к битоксибациллину линий комнатной мухи Musca Domestica / М. П. Соколянская // Вестник защиты растений, 2018. № 1 (95). С. 57-60.
12. Шульга И. С. Сравнительная оценка эффективности препаратов против большой восковой моли / И. С. Шульга, Д. А. Желябовская, Л. А. Лаврушина, И. Е. Горбачева // Актуальные вопросы ветеринарной биологии, 2020. № 3 (47). С. 57-60.
I Хотите быть в курсе всех новостей журнала «Актуальные |
| вопросы ветеринарной биологии» ? - вступайте в группу в ВК |
\ https://vk.com/ivbspbed \
%ммммммммммммммммммммммммммммммммммм
