CC BY
128
DOI: 10.23868/201703008
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БИОЛОГИЧЕСКИХ КАРКАСОВ
Е.В. Куевда, Е.А. Губарева, А.С. Сотниченко, И.С. Гуменюк, И.В. Гилевич, Р.З. Накохов Кубанский государственный медицинский университет, Краснодар, Россия
Comparative characterization of assessive methods of the cytotoxic properties of biological scaffolds
E.V. Kuevda, E.A. Gubareva, A.S. Sotnichenko, I.S. Gumenyuk, I.V. Gilevich, R.Z. Nakohov Kuban State Medical University, Krasnodar, Russia
Оценка жизнеспособности и метаболической активности клеток на каркасах является важным этапом характеристики качества децеллюляризированного матрикса и возможности его применения для создания тканеинженерных конструкций. Разнообразные методы оценки цитотоксиче-ских свойств матриксов не всегда характеризуются методологическим единством, имеется разброс показателей при использовании разных протоколов проведения исследования, что требует дальнейшего изучения. На примере рецел-люляризации децеллюляризированных матриксов легких и диафрагмы крыс изучены основные методы определения цитотоксических свойств биологических каркасов. Установлено, что описанный в зарубежной литературе колориметрический метод оценки оптической плотности исследуемых образцов и контрольных клеток (триплеты опытных и контрольных ячеек) с последующим сравнительным анализом не дает полного представления о жизнеспособности клеток на каркасах. Расчет клеточной жизнеспособности по математическим формулам представляется наиболее объективным методом оценки цитотоксических свойств биологических каркасов. Перспективным методом оценки клеточной активности на биологических каркасах является измерение флуоресцентной активности реагента Alamar Blue с последующей количественной оценкой пролиферации клеток. Колориметрический анализ поглощения данного реагента без учета флуоресценции малоинформативен, что требует разработки алгоритмов комплексной оценки жизнеспособности клеток на каркасах.
Ключевые слова: цитотоксические свойства, биологические каркасы, легкие, диафрагма.
Введение
Регенеративная медицина является перспективным научным направлением, объединившим фундаментальные и прикладные дисциплины. Тканевая инженерия, широко применяемая для сохранения, восстановления и управляемой регенерации органов и тканей, включает разработку и модификацию биологических или искусственных (синтетических) каркасов, а также оценку жизнеспособности и поддержание метаболической активности клеток, взаимодействующих с указанными матриксами [1, 2]. Именно способность каркасов поддерживать адгезию, рост и пролиферацию клеток является одним из важных критериев качества получаемого децел-люляризированного матрикса и позволяет говорить о возможности использования его для создания функционирующей тканеинженерной конструкции [3]. На сегодняшний день существуют различные методики определения жизнеспособности и про-лиферативной активности клеток (в том числе при рецеллюляризации каркасов), изучения факторов роста, цитокинового профиля, оценки цитотокси-ческих свойств компонентов среды и химических агентов. Так, использование радиоактивного тими-
e-mail: elenakuevda@yandex.ru
Assessment of cell viability and metabolic activity on the scaffolds is an important part of the decellularized matrix characterization and its application possibilities to create tissue-engineered constructs. A variety of methods for assessing the matrix cytotoxic properties is not always characterized by methodological unity and has spread parameters using different protocols that require further investigation. On recellularized biological rat lung and diaphragm matrices the basic methods for determining the cytotoxic properties of biological scaffolds were studied. It is established that widely described in foreign literature colorimetric method for assessing the optical density of the treated and control cells and samples with the subsequent comparative analysis does not give a complete representation of cell viability on the scaffold. Calculation of cell viability based on mathematical formulas seems to be the most objective method of the cytotoxic properties of biological scaffolds evaluation. A promising method for assessing cell activity on biological scaffolds is to measure fluorescent activity of Alamar Blue reagent followed by quantification of cells proliferation. Colorimetric analyses of the absorption of the same agent without regard to the fluorescence afford terminated information and require the development of algorithms for the integrated assessment of cell viability on the scaffolds.
Keywords: cytotoxic properties, biological scaffolds, lungs, diaphragm.
дина и способного замещать его при репликации ДНК бромдезоксиуридина (BrdU) позволяют выявлять пролиферирующие клетки, однако технология выполнения окрашивания весьма сложна и связана с использованием радиоактивных материалов [4]. Колориметрические исследования (MTT и XTT) обладают высокой чувствительностью и позволяют определять метаболическую активность митохондрий, регистрирующуюся только в жизнеспособных клетках. Указанные тесты основаны на способности солей тетразолия восстанавливаться в окрашенные соединения [3 ,5]. МТТ-тест широко используется для оценки цитоксических свойств препаратов и основан на способности живых клеток, в отличие от нежизнеспособных, превращать растворимый желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия в нерастворимые пурпурно-синие внутриклеточные кристаллы формазана. Изменяющийся цвет и интенсивность окрашивания реагента отражают уровень дегидрогеназной активности клеток и определяются активностью сопряженных митохондриальных систем [6]. Отличительной особенностью XTT реагента (2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2H-тетразолий-5-карбоксанилид) является облегченная
процедура измерения оптической плотности в связи с образованием в результате реакции восстановления водорастворимого оранжевого красителя [7—9]. Основными недостатками тестов, основанных на определении метаболической активности клеток по восстановлению солей тетразолия, являются некоторая нестабильность растворов и выраженная цитотоксичность, особенно у МТТ реагента [5]. Исследование жизнеспособности клеток при окрашивании Alamar Blue (alamarBlue®Cell Viability Reagent, Invitrogen, Великобритания) основано на преобразовании нетоксичного водорастворимого резазурина во флуоресцентное вещество резоруфин. Нефлуо-ресцирующий резазурин имеет синюю окраску, проникает через клеточные мембраны, превращаясь под воздействием редуктаз в резоруфин, обладающий яркой флуоресценцией в красном спектре. Процесс преобразования резазурина в резоруфин в жизнеспособных клетках протекает непрерывно, не вызывает гибели клеток, в результате чего формируется сигнал, регистрацию которого можно проводить как количественно (колориметрическим или флуориметрическим методом), так и качественно по видимому изменению синей окраски на розовую [5, 10]. Указанные тестовые системы позволяют оценить токсичность клеток и каркасов в условиях in vitro в относительно короткие сроки от момента начала исследования (24—72 ч), что делает перечисленные методы перспективными также с точки зрения экспресс диагностики эффективности рецел-люляризации каркасов.
Остается неясным, достаточно ли проведения количественного измерения оптической плотности тестируемых и контрольных образцов с последующей сравнительной статистической обработкой полученных результатов, или же необходимо выполнять дополнительные вычисления жизнеспособности клеток на каркасе по математическим формулам. Ряд зарубежных исследователей [11] придерживаются первой точки зрения, в то время как отечественные авторы поддерживают необходимость проведения дополнительных расчетов [6].
Целью нашего исследования явилось сравнение результатов XTT и Alamar Blue тестов при различных вариантах интерпретации для выбора оптимального способа оценки цитотоксических свойств биологических каркасов легких и диафрагмы.
Материал и методы
Децеллюляризацию легких и диафрагмы выполняли детергент-энзиматическим методом по модифицированным протоколам [12, 13]. Органо-комплексы забирали у 20 взрослых крыс-самцов линии Wistar весом 250±20 г; 20 крыс-самцов той же линии были использованы для выделения муль-типотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) из костного мозга [13]. Эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1972 г.) и «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей» (Страсбург, 1986) после одобрения протокола исследования локальным этическим комитетом (протокол № 21/1). Эксплантация органокомплексов и забор костного мозга выполня-
лись после введения летальной дозы барбитуратов (150 мг/кг) интраперитонеально.
Для оценки цитотоксических свойств каркаса и жизнеспособности заселенных на него клеток использовали метод статической рецеллюляризации в 96-луночных планшетах с последующим выполнением XTT и Alamar Blue тестов через 72 ч. культивирования в СО2-инкубаторе. В качестве клеточного материала были выбраны ММСК, культивированные до 6 пассажа, с последующим снятием с флакона и осаждением клеток центрифугированием [12]. Суспензию клеток вводили однократно в общем объёме 20х103 клеток на лунку в 200 мкл культураль-ной среды DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% раствора антибиотика-анти-микотика (Gibco, Life Technologies, США). Для каждого тестируемого образца использовались триплеты тестовых ячеек (биологический каркас, заселенный ММСК) и контрольных ячеек (ММСК, культивируемые на пластике без биологического каркаса). Рабочий раствор ХТТ реагента готовили в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя (Cell proliferation assay XTT, AphliChem GmbH, Германия). После 72 ч. культивирования клеток на каркасе в каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 200 мкл рабочего раствора ХТТ, время инкубации 4 ч. (рис. 1). При окрашивании Alamar Blue 20 мкл реагента добавляли к 200 мкл культуральной среды в каждую лунку планшета, инкубировали также 4 ч. [5]. Измерения оптической плотности выполняли на многофункциональном ридере FilterMax F5 (Molecular Devices, США) в стандартных условиях при длинах волн 450 нм (ХТТ), 595 нм (Alamar Blue, абсорбция) и 535/595 нм (Alamar Blue, флуоресценция) по предустановленным протоколам фирмы-производителя прибора. Референсная длина волны при измерении абсорбции ХТТ и Alamar Blue реагентов составила 620 нм, значение рефе-ренсной абсорбции реагентов вычиталось прибором автоматически.
После измерения оптической плотности в ячейках с тестовыми и контрольными образцами обработка результатов проводилась двумя способами: 1) статистическая обработка результатов и сравнительный
Рис. 1. Схематическое изображение подготовки и выполнения ХТТ-теста при определении жизнеспособности клеток и цитотоксических свойств биологических каркасов легких и диафрагмы крыс
анализ усредненных показателей экспериментальных серий по отношению к контрольным данным; 2) расчет жизнеспособности клеток (ЖСП) на каркасе по предлагаемой формуле в процентах:
ЖСП (%) = (ОПэ-ОПср)/ОПкк х 100,
где ОПэ — значение оптической плотности в тестовых сериях; ОПср — значение оптической плотности в лунках со средой; ОПкк — значение оптической плотности в лунках с контрольными клетками [6].
При этом в первом случае производилось вычитание оптической плотности среды в лунках из величин оптической плотности, полученных в тестовых ячейках и ячейках с контрольными клетками [11].
Данные, полученные при измерении флуоресценции Alamar Blue, подвергались обработке с проведением сравнительного анализа достоверности изменения клеточной пролиферации (КП) на испытуемых каркасах по сравнению с контрольными клетками, а также по формуле:
КП = (ИФэ /ИФкк) х100,
где ИФэ — значение интенсивности флуоресценции в тестовых сериях; ИФкк — интенсивность флуоресценции в лунках с контрольными клетками [14].
Средние значения интенсивности флуоресценции культуральной среды (фоновая флуоресценция] предварительно вычитали из данных, полученных для тестовых и контрольных ячеек согласно рекомендациям фирмы-производителя.
Статистическая обработка полученных данных произведена пакетом GraphPadPrism version 6.04. (источник www.graphpad.com). Результаты исследований обработаны с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверными признавались различия при значениях р<0,05.
Результаты и обсуждение
Оценка жизнеспособности клеток, засеянных на биологические каркасы легких и лиофилизирован-ной диафрагмы, показала неоднозначные результаты при измерении оптической плотности с использованием наборов XTT и Alamar Blue реагентов. Так, оптическая плотность тестовых образцов рецеллю-ляризированных каркасов легких при выполнении ХТТ теста составила 0,155±0,009, в контрольных сериях — 3,561±0,028. При исследовании образцов диафрагмы показатели оптической плотности равнялись 0,001 ±0,0005 и 3,999±0,0007 для клеток на каркасе и контрольных серий, соответственно. Различия в оптической плотности контрольных серий при сравнении были статистически значимы (p = 0,0041), в то время как в тестовых сериях достоверность различий отсутствовала (p = 0,2548). Внутригрупповые значения оптической плотности контрольных клеток и клеток, заселенных на каркас, статистически значимо отличались как для образцов легких, так и для образцов диафрагмы (p = 0,0011 и p<0,0001, соответственно) (рис. 2А).
□ легкие ■ диафрагма
0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 О
□ легкие ■ диафрагма
120.00% -| 100.00% -80.00% -60.00% -40.00% -20.00% -0.00% -
□ легкие ■ диафрагма
ЖСП (ХТТ)
НСП(АВ)
: £ 200000000
■е- х 100000000
□ легкие ■ диафрагма
I
КК
Рис. 2. Результаты цитотоксических тестов биологических каркасов легких и диафрагмы: А — оптическая плотность при проведении ХТТ-теста; Б — абсорбция Alamar Blue реагента; В — расчет ЖСП при использовании ХТТ и Alamar Blue реагентов; Г — интенсивность флуоресценции клеток при проведении Alamar Blue тестов. Клетки — показатели в контрольных ячейках, КК — в тестовых (клетки, заселенные на каркас). Тип использованного реагента указан в индексе после расширения и в круглых скобках на графике В
Таким образом, культивирование клеток на децел-люляризированных матриксах легких и диафрагмы, согласно данным количественной оценки ХТТ-теста при использовании колориметрического метода, приводило к достоверному снижению метаболической активности и жизнеспособности клеток.
Результаты, полученные с использованием формулы расчета ЖСП клеток на испытуемых каркасах при выполнении XTT-теста, подтвердили снижение метаболической активности клеток. Так, через 72 ч. культивирования в стандартных условиях ЖСП клеток на биологическом каркасе легкого крысы составила 14,55%, диафрагмы — 0,05% (рис. 2В).
При анализе результатов абсорбции Alamar Blue реагента колориметрическим методом оптическая плотность равнялась 0,203±0,039 для образцов рецеллюляризированных легких и 0,353±0,052 — для образцов диафрагмы (рис. 2Б). В ячейках с контрольными клетками оптическая плотность составила 0,266±0,023 и 0,284±0,052 для образцов легких и диафрагмы, соответственно. Статистически значимых различий внутри групп между показателями оптической плотности в тестовых и контрольных ячейках не было (p = 0,4081 для образцов легких и p = 0,1443 для образцов диафрагмы). Показатели оптической плотности в ячейках с контрольными клетками и в ячейках с тестовыми образцами при межгрупповом сопоставлении результатов также не имели статистически значимых отличий: p = 0,1657 — для контрольных ячеек и p = 0,2368 — для опытных. Таким образом, при колориметрическом анализе уменьшение абсорбции Alamar Blue реагента позволяет говорить о том, что пролифе-ративная активность клеток, засеянных на каркасы легких, снизилась в 1,3 раза, в то время как при рецеллюляризации каркаса диафрагмы пролифера-тивная активность клеток увеличилась в 1,2 раза по сравнению с контрольными ячейками.
ЖСП клеток при выполнении Alamar Blue теста составила 62,86% для образцов легких и 103,9% — для диафрагмы (рис. 2В).
Как и при анализе результатов ХТТ-теста, отмечалось понижение пролиферации и жизнеспособности клеток на каркасе легких, однако темпы снижения не соответствовали результатам, полученным в предыдущем исследовании. При рецеллюляриза-ции каркасов диафрагмы происходило увеличение пролиферативной активности клеток по сравнению с контрольными данными.
Результаты интенсивности флуоресценции клеток, заселенных на каркасы легких и диафрагмы в сравнении с показателями интенсивности флуоресценции контрольных клеток представлены на рис. 2Г. Пролиферация клеток на каркасе легких составила 20% от контрольного уровня (от пролифера-тивной активности клеток в контрольных ячейках), на каркасе диафрагмы — 42%. Полученные данные подтвердили тенденцию к снижению пролифератив-ной активности клеток на каркасах после децеллю-ляризации последних детергент-энзиматическим методом. Однако в количественном выражении полученные данные не согласуются с результатами предыдущих исследований с использованием реагентов ХТТ и Alamar Blue (при определении абсорбции последнего), занимая усредненную позицию.
В ходе проведенных экспериментов по определению метаболической активности, жизнеспособности и пролиферативной активности клеток
на биологических каркасах легких и диафрагмы с использованием тестовых наборов Alamar Blue и ХТТ и различных вариантов обработки результатов установлено отсутствие унифицированного подхода к выполнению исследований. Так, при анализе результатов ХТТ-тестов каркасы представляются непригодными для клеточного роста и пролиферации, а протоколы их получения нуждаются в доработке. В то же время, при расчете ЖСП в процентах каркасы легких демонстрируют большую клеточную выживаемость по сравнению с каркасами диафрагмы, однако все же ЖСП не достигает 50%.
Исследование с учетом абсорбции реагента Alamar Blue также демонстрирует тенденцию к некоторому уменьшению пролиферативной активности клеток на каркасе легких (различия статистически не достоверны). Однако в случае с каркасом диафрагмы ситуация прямо противоположная: отмечается некоторый рост пролиферативной активности (без статистической значимости). Расчет ЖСП подтверждал результаты количественного анализа абсорбционного теста, в обоих случаях показатели превышали 50%. Следовательно, каркасы поддерживают клеточный рост и пролиферацию, протоколы не нуждаются в пересмотре.
Интенсивность флуоресценции жизнеспособных и пролиферирующих клеток на каркасе по отношению к контрольным клеткам в обоих случаях считалась удовлетворительной (20% и 42% для легких и диафрагмы соответственно). Практически треть заселенных клеток прикрепилась к каркасам и проявляла пролиферативную активность, однако протоколы получения рекомендуется изменить для снижения цитотоксических свойств биологических каркасов.
Заключение
Таким образом, при анализе трех методологических подходов к проведению оценки цитотоксических свойств биологических каркасов легких и диафрагмы крыс, получаемых при децеллюляризации с использованием детергентов и ферментов, обнаружена неоднозначность трактовки результатов в зависимости от выбранного способа оценки и интерпретации данных. Также имеются колебания и разброс показателей при использовании разных протоколов проведения исследования, предлагаемых различными фирмами-производителями. Указанные трудности препятствуют унификации существующих методов оценки пролиферативной активности и затрудняют воспроизводимость указанных методов другими исследователями, требуя подробного описания методики проведения цитотоксических тестов с указанием каталожных номеров и фирм-производителей реагентов. Методика расчетов показателей проли-феративной активности клеток также должна быть подробно расписана для облегчения восприятия и воспроизведения другими исследователями.
Разброс данных, полученных в ходе нашего исследования, заставляет задуматься о ненадежности использования только лишь одного метода оценки жизнеспособности клеток на каркасе и цитотокси-ческих свойств самого каркаса. Необходимо проведение дальнейших исследований по изучению закономерностей и особенностей проведения различных цитотоксических тестов для разработки унифицированных систем подсчета пролиферативной
активности клеток, позволяющих получать однородные результаты различными исследователями.
Благодарности
Работа выполнена в рамках комплексной НИР лаборатории фундаментальных исследований в области
регенеративной медицины ФГБОУ ВО Минздрава России «Клеточные механизмы регенерации интра-торакальных органов и тканей. Разработка тканеин-женерных конструкций с использованием биологических и синтетических каркасов» (приказ № 145 от 29.02.2016 г).
ЛИТЕРАТУРА:
1. Куевда Е.В., Губарева Е.А., Сотниченко А.С. и др. Перспективы создания тканеинженерных легких с использованием методов-регенеративной медицины. Гены и клетки 2015; 10(1): 35-40.
2. Atala A. Tissue engineering, stem cells and cloning: current concepts and changing trends. Expert opinion on biological therapy 2005; 5(7): 879-92.
3. Badylak S.F., Taylor D., Uygun K.Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.Annu.Rev. Biomed.2011; 13: 27-53.
4. Wilson G.D., McNally N.J., Dische S. et al. Measurement of cell kinetics in human tumours in vivo using bromodeoxyuridine incorporation and flow cytometry.British J. Canc. 1988; 58: 423-31.
5.Rampersad S.N. Multiple applications of Alamar Blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays.Sensors2012;12: 12347-60.
6.Багаева В.В., Попова В.М., Пашкова Г.С. и др. Изучение эффективности и безопасности применения антимикробных средств. Исследования и практика в медицине 2015; 2(3):35-42.
7.JostL.M., KirkwoodJ.M., WhitesideT.L.Improved short- and long-term XTT-based colorimetric cellular cytotoxicity assay for melanoma and other tumor cells. J. Immunol. Methods 1992; 147(2): 153-65.
8. Huyck L., Ampe C., Van Troys M. The XTT cell proliferation assay applied to cell layers embedded in three-dimensional matrix. Assay Drug Dev. Technol. 2012; 10(4): 382-92.
9. Scudiero D.A., Shoemaker R.H., Paull K.D.et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Res. 1988; 48(17): 4827-33.
10. Al-Nasiry S., Geusens N., Hanssens M. et al. The use of Alamar Blue assay for quantitative analysis of viability, migration and invasion of choriocarcinoma cells. Hum. Reprod. 2007; 22(5):1304-9.
11. Schmidt J., Zyba V., Jung K. et al. Cytotoxic effects of octenidine mouth rinse on human fibroblasts and epithelial cells - an in vitro study. DrugChem. Toxicol. 2016; 39(3): 322-30.
12. Куевда Е.В., Губарева Е.А., Сотниченко А.С. и др. Опыт перфузионной рецеллюляризации биологического каркаса легких крысы. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2016; 18(1): 38-44.
13. Gubareva E.A., Sjöqvist S., Gilevichl. V. еt al. Orthotopic transplantation of a tissue engineered diaphragm in rats. Biomaterials 2016; 77: 320-35.
14.General method formeasuringcytotoxicity or proliferation using alamarBlue® [Electronic source]. URL https://www.bio-rad-antibodies. com/measuring-cytotoxicity-proliferation-spectrophotometry-fluorescence-alamarBlue.htm
Поступила: 26.10.2016
