CC BY
26
DOI: 10.23868/202110011
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНЫХ ПРОДУКТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ЖИРОВОЙ ТКАНИ ПРИ ПОМОЩИ РАЗЛИЧНЫХ СИСТЕМ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЙ
Поступила: 26.05.2021 Принята к печати: 02.09.2021 Опубликована on-line: 05.09.2021
И.Р. Гильмутдинова1, Е.Ю. Костромина1, А.В. Веремеев2, М.В. Путова3, П.А. Марков1, И.С. Кудряшова1, П.С. Еремин1
1 Национальный медицинский исследовательский центр реабилитации и курортологии, Москва, Россия
2 Национальный исследовательский центр эпидемиологиии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи, Москва, Россия
3 Московский клинический научный центр им. А.С. Логинова, Москва, Россия
COMPARATIVE CHARACTERIZATION OF CELL PRODUCTS DERIVED FROM ADIPOSE TISSUE USING DIFFERENT SYSTEMS FOR THE ISOLATION OF CELLULAR FRACTIONS
I.R. Gilmutdinova1, E. Kostromina1, A.V. Veremeev2, M.V. Putova3, P.A. Markov1, I.S. Kudryashova1, P.S. Eremin1
1 National Medical Research Center for Rehabilitation and Balneology, Moscow, Russia
2 N.F. Gamaleya National Research Center for Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia
3 A.S. LoginovMoscow Clinical Scientific Center, Moscow, Russia
e-mail: ereminps@gmail.com
Использование аутогенных клеточных продуктов на основе жировой ткани с целью восстановления морфологии и функции органов и тканей, пораженных заболеванием, получило широкое распространение в регенеративной медицине. Для применения клеточных продуктов в клинической практике большое значение имеет разработка и внедрение устройств автоматизации и стандартизации процедуры выделения клеточных фракций.
Цель работы заключалась в сравнительной оценке клеточных продуктов, полученных из жировой ткани условно здоровых пациентов при использовании двух разных зарегистрированных в Российской Федерации систем, основанных на применении ферментативного и механического методов выделения клеточных фракций из жировой ткани.
В качестве клинического материала были использованы образцы жировой ткани в форме липоаспирата, полученные от условно здоровых пациентов при проведении плановых операций по липосакции в клинике пластической хирургии. Клеточные продукты выделяли в соответствии с инструкциями по применению систем для выделения клеточных фракций.
Сравнительный анализ эффективности применения двух систем для выделения клеточных фракций проводили путем оценки полученных с их помощью клеточных продуктов по ряду параметров: количеству ядросодержащих клеток в препарате, их жизнеспособности и пролиферативному потенциалу муль-типотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, входящих в состав клеточного продукта. Клеточный продукт, полученный ферментативным способом, характеризовался большим выходом ядросодержащих клеток, а также высоким пролиферативным потенциалом мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из жировой ткани. В клеточном продукте, полученным из жировой ткани с помощью механического метода, было обнаружено небольшое количество ядросодержащих клеток, большой объем остаточного масла, соединительная ткань была разрушена. В работе показано, что способ обработки жировой ткани (ферментативный или механический) оказывает значительное влияние на характеристики получаемых продуктов.
Ключевые слова: жировая ткань, клеточные технологии, регенеративная медицина, стромально-васкулярная фракция.
The use of autologous adipose tissue-derived cell products to restore the morphology and function of organs and tissues affected by the disease have become widespread in regenerative medicine. For the wide application of cell-based products in clinical practice, it is important to develop and implement new devices to automate and standardize the isolation of stromal vascular fraction cells. This work aimed to compare cell products obtained from human adipose tissue using two systems, both registered in the Russian Federation and based on enzymatic and mechanical methods of cell fractions isolation.
As clinical material, we used samples of adipose tissue in the form of lipoaspirate obtained from healthy patients. The isolation of cell products was performed according to the instructions for the use of these systems.
A comparative analysis of the effectiveness of these systems for the isolation of cell fractions was carried out by evaluating several parameters determined for obtained cell products. The cell product obtained by the enzymatic method is characterized by a high yield of nucleated cells, as well as a high proliferative potential of stem cells isolated from adipose tissue. The cellular product obtained from adipose tissue using the mechanical method is characterized by a low yield of nucleated cells, the presence of a large volume of residual oil, and destroyed connective tissue in the final product. The work shows that the method of adipose tissue processing (enzymatic or mechanical) has a significant effect on the characteristics of the products obtained.
Keywords: adipose tissue, cell technologies, regenerative medicine, stromal vascular fraction
Введение
Благодаря проведению прорывных научных исследований в области биотехнологии, молекулярной и клеточной биологии, а также регенеративной медицины формируются новые подходы к терапии целого ряда заболеваний [1, 2]. В последнее время широкое распространение получило применение аутогенных клеточных продуктов на основе жировой ткани (ЖТ), в частности, стромально-васкулярной
фракции (СВФ) [3, 4]. Одним из преимуществ использования Жт в качестве источника клеточного материала по сравнению с костным мозгом является малая инвазив-ность процедуры получения биоматериала, проводимой под местной анестезией, с минимальным болевым синдромом и риском для пациента [5]. Область применения клеточных продуктов из ЖТ в клинике достаточно обширна. Их использование направлено на ремоделирование, замещение или
восстановление функционирования поврежденных тканей [6]. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани (ММСК ЖТ) вырабатывают большое количество паракринных факторов, предотвращающих апоптоз клеток, а также стимулирующих неоангиогенез и оказывающих иммуномодулирующий эффект. Данные клетки продуцируют множество факторов роста и цитоки-нов, включая HGF, TGF-ß, VEGF, IL-6, IL-8, IL-17 [7].
В течение долгого времени СВФ из жировой ткани выделяли с помощью энзиматического «ручного способа» по методу P.A. Zuk с соавт. (2001, 2013) [8, 9]. Несмотря на широкое распространение, все ручные методы характеризуются большими временными затратами, а также возможным влиянием на результат «человеческого фактора», что является существенной проблемой для внедрения стандартов GMP (Good manufacturing practice) и GTP (Good tissue practice). Благодаря использованию инкубаторов, автоматических шейкеров, клеточных фильтров, а также других устройств удается получить более чистую фракцию клеток с минимальным количеством остаточных ферментов, при сохранении самого принципа выделения СВФ [10, 11].
В связи с этим, технологии получения клеточных продуктов из ЖТ эволюционируют в направлении автоматизации процесса и стандартизации протоколов выделения для повышения качества и чистоты конечного продукта. Это достигается за счет внедрения автоматических, полуавтоматических и(или) закрытых систем выделения [12]. Помимо получения клеточных продуктов с помощью ферментов, также применяют технологии, основанные на механической обработке ЖТ [13]. Однако использование разных методов обработки ЖТ может приводить к вариабельному выходу клеток в конечном продукте [14].
Цель работы заключалась в сравнительной оценке клеточных продуктов, полученных из жировой ткани пациентов с использованием двух разных систем, предназначенных для выделения клеточных фракций с помощью ферментативного и механического методов.
Материал и методы
Дизайн эксперимента
Объектом исследования стали медицинские изделия, зарегистрированные на территории Российской Федерации. Были протестированы две системы для получения клеточных продуктов из ЖТ человека, основанные на применении разных методов выделения клеточных фракций — механического и ферментативного. Выделение клеточных продуктов проводили в соответствии с инструкциями фирм-производителей. В качестве материала для тестирования систем выделения клеток из ЖТ были использованы образцы ЖТ в форме липоаспирата, полученные от условно здоровых пациентов при проведении плановых операций по липосакции в клинике пластической хирургии при наличии информированного добровольного согласия пациентов. Для сравнительного анализа эффективности применения двух систем выделения клеточных фракций клеточные продукты оценивали по ряду параметров: количеству ядросодержащих клеток в препарате, их жизнеспособности и пролиферативному потенциалу ММСК ЖТ, входящих в состав клеточного продукта.
Характеристики систем для
выделения клеточных фракций
Система для выделения клеточного продукта механическим способом (СМС) (Arthrex GmbH, Германия)
представляет собой двойной шприц с объемом внешней камеры 15 мл и объемом внутренней камеры 6 мл. Внешний шприц предназначен для забора материала и снабжен накручивающимся на канюлю плоским колпачком для вертикальной установки шприца, внутренний шприц — для отбора фракций из внешнего шприца после центрифугирования. Внутренний шприц извлекают из внешнего для последующего использования. Для диспергирования ЖТ и получения клеточной фракции применяют 2 адаптера с диаметром ячеек сетки 2,4 и 1,4 мкм. Максимальный объем обрабатываемой ЖТ составляет 15 мл.
Система для выделения клеточного продукта ферментативным способом (СФС) (JoinTechCell LLC, Россия) состоит из сепаратора — герметичной прозрачной пластиковой цилиндрической емкости с двумя камерами, расположенными одна над другой и разделенными нейлоновым фильтром с размером ячеек сетки 100 мкм, и фермента коллагеназы NB 6 GMP Grade (100 U, 1 г; Nordmark Arzneimittel GmbH & Co. KG, Германия). На боковых стенках верхней камеры расположены шесть промаркированных изолированных каналов с коннекторами для ввода и вывода компонентов. Максимальный объем обрабатываемой за один раз ЖТ составляет 200 мл, минимальный объем — 50 мл.
Характеристика биоматериала
В качестве клинического материала были использованы образцы ЖТ, полученные от 1 4 пациенток (женщины в возрасте от 25 до 49 лет), согласно стандартным установленным в рамках проведения липосакции критериям включения и исключения пациентов.
Критерии включения: наличие локальных жировых отложений в области живота, боковых участков талии, спины, коленей с толщиной жировой складки в исследуемых областях не менее 2,5 см и не более 6 см.
Критерии исключения: ожирение (индекс массы тела >30), слишком плотная текстура жировой ткани, грыжи и(или) нарушение целостности кожных покровов в области воздействия, хронические заболевания в стадии обострения, заболевания сердечно-сосудистой системы, нарушения свертываемости крови (для инвазивных методик), сахарный диабет, злокачественные новообразования, острые инфекционные заболевания (в т. ч. ОРВИ), снижение иммунитета на фоне гормональной терапии, период беременности и грудного вскармливания.
Забор ЖТ проводили шприцевой липосакцией в области передней и боковой брюшной стенки. Полученный биоматериал транспортировали в стерильном термоконтейнере и обрабатывали в течение 4 ч. после окончания процедуры липосакции. Каждый из 14 образцов делили на 2 части: одну часть обрабатывали с использованием СФС, другую часть — с помощью СМС.
Выделение клеточного продукта
механическим способом (СМС)
Клеточный продукт получали в соответствии с инструкцией фирмы-производителя СМС: липоаспират в объеме 15 мл переносили в двухкамерный шприц при помощи адаптера, предназначенного для диспергирования жировой ткани, с диаметром ячеек сетки 2,4 мкм, центрифугировали в шприце в течение 4 мин. при 2500 об/мин. для разделения на водную фракцию (нижний слой), жировую ткань (средний слой) и масло (верхний слой), при помощи внутреннего шприца отбирали верхний слой (масло), водную фракцию удаляли через входное отверстие шприца.
Оставшуюся в шприце ЖТ подвергали механической обработке при помощи адаптера и шприца объемом 10 мл с креплением типа Luer Lock путем перекачивания суспензии из одного шприца в другой через металлическую сетку адаптера: сначала 5 раз через адаптер с диаметром ячеек сетки 2,4 мкм, затем 30 раз через адаптер с диаметром ячеек сетки 1,4 мкм. После механической обработки гомогенизированную Жт в шприце центрифугировали в течение 4 мин. при 2500 об/мин. При помощи внутреннего шприца отбирали верхнюю фракцию (остаточное масло), после чего во внешнем шприце оставалась клеточная фракция объемом 2 мл, которую использовали для последующего анализа.
Выделение клеточного продукта
ферментативным способом (СФС)
Клеточный продукт получали в соответствии с инструкцией фирмы-производителя СФС: для промывки липоаспирата его вносили в сепаратор через любые из каналов с маркировкой «1-4» в объеме 50-120 мл, раствором Хартмана (АО «Биохимик», Россия) объем жидкости в сепараторе доводили до 400 мл, центрифугировали в течение 8 мин. при 300 g для разделения содержимого на водную фракцию (нижний слой), Жт (средний слой) и масло (верхний слой) и аккуратно отбирали нижний слой через канал с маркировкой «SVF» так, чтобы в сепараторе оставалась только ЖТ. Процесс промывки липоаспирата осуществляли дважды. После завершения промывки к биоматериалу добавляли рабочий раствор коллагеназы в объемном соотношении 1:1.
Сепаратор помещали в шейкер-инкубатор, инкубировали липоаспират с ферментом в течение 30 мин. при температуре 37 °C и скорости перемешивания 100120 об/мин., после чего объем жидкости в сепараторе доводили до 400 мл раствором Хартмана и центрифугировали в течение 10 мин. при 300 g. Последовательно, начиная с самого короткого канала (маркировка «1 ») и заканчивая наиболее длинным каналом (маркировка «Clean»), отбирали надосадочную жидкость, дважды промывали раствором Хартмана, и отбирали суспензию клеток из нижней камеры сепаратора через канал с маркировкой «SVF». Объем полученной клеточной фракции составлял 5 мл во всех случаях ввиду особенностей конструкции нижней камеры сепаратора.
Цитологическое исследование
Тонкослойные цитологические препараты готовили из клеточного материала полученных клеточных продуктов, фиксированного с помощью PreservCyt Solution (Hologic Inc., США) для последующего анализа методом жидкостной цитологии ThinPrep (Hologic Inc., США) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Пробоподготовку образцов осуществляли по «жидкостной» методике, рекомендованной фирмой-производителем, на цитоцентрифуге Cyto-Tek® (Sakura, Япония). Препараты из фиксированного клеточного материала окрашивали по Папаниколау общепринятым методом. Препараты анализировали на микроскопе Leica DM1000 (Leica Microsystems, Германия).
Оценка жизнеспособности клеток
Количество жизнеспособных клеток подсчитывали общепринятым способом [15] с использованием гемо-цитометра (Hausser Scientific, Horshman, США) и 0,1% раствора трипанового синего (Life Technologies, Eugene,
OR, США). Жизнеспособность клеток так же оценивали с помощью проточного цитофлуориметра BD FACS CANTO II и красителя 7-аминоактиномицина-Д (7-AAD) (Becton Dickinson, США). Клеточный состав в получаемой СВФ определяли на проточном цитофлуориметре BD FACS CANTO II (Becton Dickinson, США).
Получение первичной культуры ММСК ЖТ
Клеточную суспензию, полученную из ЖТ с помощью системы СФС, высевали на культуральный флакон Т25 (Corning, США) из расчета 105 кл/см2 и культивировали в среде DMEM с низким содержанием глюкозы с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (все реактивы для культивирования фирмы STEMCELL Technologies Inc., США).
Оценка пролиферативной активности ММСК ЖТ
Пролиферативную активность ММСК ЖТ оценивали на культуре клеток 3 пассажа. Культуру клеток пассировали в 35 мм чашки Петри из расчета 104 кл/см2 и культивировали в стандартных условиях (37 °С, 5% С02) для верификации результатов. Рост клеток визуализировали каждые 24 ч. при помощи инвертированного микроскопа Leica DM IL LED (Leica Microsystems, Германия). Через 1, 3, 5 сут. культивирования клетки снимали раствором трипсина с 0,25% ЭДТА (STEMCELL Technologies Inc., США) с поверхности пластика, подсчитывали с оценкой жизнеспособности на автоматизированном счетчике Bio-Rad TC-20 (Bio-Rad, США) по методике фирмы-производителя. Среднее время удвоения популяции (TD) рассчитывали по формуле: TD=(log22)*t/[log2(Nt/N0)], где t — время культивирования (ч.), Nt — количество клеток через время t, N0 — исходное количество клеток.
Оценка способности к формированию колоний
Для оценки способности к формированию колоний первичную культуру ММСК ЖТ высевали с низкой плотностью — 1х104 клеток на чашку Петри диаметром 35 мм, культивировали в стандартных условиях в течение 1 4 сут. в ростовой среде с повышенным содержанием сыворотки (20% FBS), клетки фиксировали на пластике 1% раствором формальдегида, окрашивали по Романовскому-Гимзе, подсчитывали количество колоний (учитывались колонии, содержавшие не менее 50 клеток), определяли их тип и рассчитывали процентное соотношение колоний разного типа.
Статистический анализ
Данные представлены в виде M±SD, где М — среднее значение, SD — стандартное отклонение. Попарное сравнение данных для исследуемых групп проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Статистически достоверными считали различия при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Проведен сравнительный анализ 14 пар образцов клеточных продуктов, полученных из ЖТ пациентов при помощи двух разных систем, предназначенных для выделения клеточных фракций с использованием ферментативного и механического методов.
Исследование препаратов клеточных продуктов, полученных из ЖТ с использованием СФС и СМС, показало статистически значимые различия по количеству
Согласно данным проточной цитометрии, в клеточном продукте, выделенном из ЖТ c использованием СФС, присутствовали клетки зрелого эндотелия (CD146+, CD31+, CD73+low, CD90+, CD105-), ММСК ЖТ (CD146-, CD31-, CD90+, CD73+, CD105+), эндотелиальные клетки-предшественницы (CD146+, CD90+, CD73+low, CD105+, CD31+) и перициты (CD90-/+, CD146+, CD31-, CD105-). Содержание ММСК ЖТ в среднем составляло 33,6 ± 6,5% (n=10 — количество клеточных продуктов, исследованных с использованием проточной цитометрии).
В препаратах клеточных продуктов, полученных при помощи системы СМС, было обнаружено низкое содержание ЯСК и при длительном культивировании на пластике адгезионные клетки не идентифицировались. Из-за недостаточного количества клеток для получения достоверных результатов проточную цито-метрию не проводили, также было невозможно оценить пролиферативную активность ММСК ЖТ, выделенных с использованием системы СМС.
В препаратах клеточных продуктов, выделенных при помощи системы СФС, были идентифицированы ММСК ЖТ, морфология которых не отличалась от морфологии культивируемых ММСК ЖТ на 3 пассаже (рис. 3). Клетки имели правильную веретеновидную форму с четкими границами, 2-4 длинных отростка, цитоплазма была гомогенная, прозрачная без каких-либо включений, Ядра располагались в цитоплазме ближе к периферии (эксцентрично) с равномерным распределением хроматина. При культивировании ММСК ЖТ, входящих в состав
Рис. 2. Клеточные продукты, полученные при помощи СФС (А) и СМС (Б). Окраска по Папаниколау. Ув. х100
Таблица. Сравнительная характеристика клеточных продуктов, полученных из ЖТ доноров при помощи СФС и СМС
Наименование показателя СФС СМС
Общее количество остаточного масла, % 18,21 ± 7,10 25,42 ± 14,40
Общее количество ЯСК/мл жира (х106) 0,96 ± 0,45 0,21 ± 0,20 *
Жизнеспособность ЯсК, % 86,25 ± 4,15 35,50± 18,30 *
Общее количество ЯСК/мл липоаспирата (х106) 0,71 ± 0,32 0,13 ± 0,11 *
Среднее время удвоения популяции ММСК ЖТ (ТО), ч. 22,15 ± 1,83 —
Эффективность формирования колоний, % —
плотные 55,5 ± 3,5
смешанные 9,2 ± 3,8
диффузные 3,0 ± 2,7
Примечание: * (р <0,01)
выделенных клеток в расчете на единицу объема ЖТ (липоаспирата) (рис. 1). Также была установлена статистически достоверная разница по жизнеспособности ядросодержащих клеток (ЯСК). Результаты представлены в сводной таблице.
A
0
ount 30 40 P3
C 0 CU i
10 0 1. Л
Б
102 10° 104 7AAD PerCP-Cy5-5-A
102 10s 104 7AAD PerCP-Cy5-5-A
Рис. 1. Жизнеспособность клеток в клеточных продуктах, полученных из жировой ткани при помощи систем для выделения клеточных фракций СФС (А) и СМС (Б). Проточная цитометрия
Результаты цитологического исследования показали наличие клеток фибробластического ряда разной степени дифференцировки, клетки эндотелия, единичные липофаги и жировые клетки во всех образцах клеточных продуктов, выделенных при помощи СФС и СМС (рис. 2). Однако в образцах клеточных продуктов, полученных с помощью СМС, были также обнаружены разрушенные клетки и частицы соединительной ткани (рис. 2).
Л> - ' Щ
•i' *» *
/
н
т
•к-
1
A Б
Рис. 3. ММСК ЖТ: А — в составе клеточного продукта, полученного при помощи системы СФС; Б — культивируемые клетки 3 пассажа. Окраска по Папаниколау. Ув. х1000
r З&н
у V X \ ,
1
" - tf -V- .. • - . •• ■ / - \ ;■ •
А Б
\ Ь
»ffi «3 Ж t ■ ' ~ ^ --^LJB / У<1\ ^ ^
/ 4-
N J v h
- \ i
В
X •••
Рис. 4. Внешний вид колоний через 14 сут. культивирования ММСК ЖТ: А — плотные колонии, Б — смешанные колонии, В — диффузные колонии. Окраска по Романовскому-Гимзе. Ув. х50
клеточного продукта, полученного с использованием СФС, был отмечен высокий пролиферативный потенциал клеточной культуры (табл.)
Исследование способности к формированию колоний ММСК ЖТ показало преобладание плотных колоний над долей смешанных и диффузных, что также свидетельствует о высоком пролиферативном потенциале данной культуры клеток (табл., рис. 4).
Необходимо отметить, что характеристики клеточных продуктов, выделенных из Жт пациентов с использованием СФС сравнимы с параметрами продуктов, полученных с помощью ручного энзиматического метода. В нашей предыдущей работе [16] ручным энзима-тическим методом была выделена СВФ из жировой ткани пациентов, жизнеспособность клеток в которой составляла 92% при общем количестве клеток, полученных из 1 мл ЖТ, более 0,4х106, что свидетельствует об эффективности использования СФС для выделения СВФ из ЖТ человека.
Во время выполнения экспериментов с использованием СМС были отмечены критические моменты: более чем в половине случаев возникала проблема с переносом ЖТ в двухкамерный шприц. После процедуры липо-сакции возможна агрегация жировой ткани в небольшие конгломераты, что затрудняло перенос липоаспирата в шприц в соответствии с протоколом производителя: ЖТ не проходила через адаптер с диаметром сетки 2,4 мкм и приходилось переносить жир в шприц через снятый поршень шприца без использования адаптера. Кроме того, во время процедуры механической обработки
разрушенная ЖТ в 70% случаев образовывала новые конгломераты, которые забивали сетку адаптера. В таких случаях, по рекомендации представителей компании производителя, предполагается разъединение шприца с адаптером и удаление конгломерата при помощи пинцета. Таким образом, данная система перестает быть закрытой и нарушается стерильность образца.
При работе с использованием СФС был выделен только один некритичный момент. В результате нескольких центрифугирований клетки адгезировались к дну нижней камеры. Для более точной оценки количества выделенных клеток приходилось несколько раз промывать камеру при финальном заборе клеточного продукта, чем объясняется различный объем выделенной фракции в исследуемых образцах.
Заключение
1. Способ обработки ЖТ (механический или ферментативный) оказывает значительное влияние на характеристики клеточного продукта.
2. При выделении механическим способом клеточный продукт характеризуется низким выходом ядросо-держащих клеток, наличием большого количества остаточного масла и разрушенной соединительной тканью в конечном продукте. При выделении ферментативным методом клеточный продукт характеризуется большим выходом ядросодержащих клеток, аналогичным выходу клеток при ручном ферментативном способе, и высоким пролиферативным потенциалом ММСК ЖТ.
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Sato M., Uchida K., Nakajima H. et al. Direct transplantation of mesenchymal stem cells into the knee joints of Hartley strain guinea pigs with spontaneous osteoarthritis. Arthritis Res. Ther. 2012; 14: R31.
2. Pak J., Lee J.H., Park K.S. et al. Current use of autologous adipose tissue-derived stromal vascular fraction cells for orthopedic applications. J. Biomed. Sci. 2017; 24(1): 9.
3. Yoshimura K., Suga H., Eto H. Adipose-derived stem progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation. Regenerative Medicine 2009; 4(2): 265-73.
4. Еремин И.И., Наделяева И.И., Васильев В.С. Статус стромально-васкулярной фракции жировой ткани как клеточного продукта в современных реалиях отечественного правового поля. Гены и Клетки 2019; 14(4-1): 88-9. [Eremin I.I., Nadelyaeva 1.1., Vasiliev V.S. Status of adipose-derived stromal vascular fraction as a cellular product in the modern realities of the domestic legal framework. Genes & Cells 2019; 14(4-1): 88-9].
5. Веремеев А.В., Болгарин Р.Н., Петкова М.А. и др. Стромально-васкулярная фракция жировой ткани как альтернативный источник клеточного материала для регенеративной медицины. Гены и Клетки 2016; 11(1): 35-42. [Veremeev A.V., Bolgarin R.N., Petkova M.A. et al. Adipose-derived stromal vascular fraction as an alternative source of cells for the regenerative medicine. Genes & Cells 2016; 11(1): 35-42].
6. Деев Р.В., Исаев А.А., Кочиш А.Ю. и др. Клеточные технологии в травматологии и ортопедии: пути развития. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2007; 2(4): 18-30. [Deev R.V., Isaev A.A., Kochiesh A.Yu. et al. Cellular Technologies in Traumatology and Orthopedics: Ways of Development. Cellular Transplantation and Tissue Engineering 2007; 2(4): 18-30].
7. Zhou B.R., Xu Y., Guo S.L. et al. The Effect of Conditioned Media of Adipose-Derived Stem Cells on Wound Healing after Ablative Fractional Carbon Dioxide Laser Resurfacing. Biomed. Res. Int. 2013; 2013: 519126.
8. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. et al. Multilineage Cels from Human Adipose Tissue: Implications for Cell-Based Therapies. Tissue Engineering 2001; 7(2): 211-28.
9. Zhu M., Heydarkhan-Hagvall S., Hedrick M. et al. Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates. J. Vis. Exp. 2013; 79: e50585.
10. Yu G., Floyd Z.E., Wu X. et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from lipoaspirates. Methods Mol. Biol. 2011; 702: 17-27.
11. Doi K., Kuno S., Kobayashi A. et al. Enrichment isolation of adipose-derived stem/stromal cells from the liquid portion of liposuction aspirates with the use of an adherent column. Cytotherapy 2014; 16(3): 381-91.
12. Doi K., Tanaka S., Iida H. et al. Stromal vascular fraction isolated from lipoaspirates using an automated processing system: bench and bed analysis. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2013; 7(11): 864-70.
13. Gir P., Oni G., Brown S.A. et al. Human adipose stem cells: current clinical applications. Plast. Reconstr. Surg. 2012; 129(6): 1277-90.
14. Winnier G.E., Valenzuela N., Peters-Hall J. et al. Isolation of adipose tissue derived regenerative cells from human subcutaneous tissue with or without the use of an enzymatic reagent. PLoS One 2019; 14(9): e0221457.
15. Freshney R.I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 6th ed. Hoboken [NJ]: Wiley; 2011.
16. Смышляев И.А., Гильфанов С.И., Копылов В.А. и др. Оценка безопасности и эффективности внутрисуставного введения стромально-васкулярной фракции жировой ткани для лечения гонартроза: промежуточные результаты клинического исследования. Травматология и ортопедия России 2017; 23(3): 17-31. [Smyshlyaev I.A., Gilfanov S.I., Kopylov V.A. et al. Safety and Effectiveness of Intraarticular Administration of Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction for Treatment of Knee Articular Cartilage Degenerative Damage: Preliminary Results of a Clinical Trial. Traumatology and Orthopedics of Russia 2017; 23(3):17-31].
