CC BY
36
УДК 615.272.4:616-001.18]612-092.9
СРАВНЕНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПРОЗЕРИНА ПРИ КРАТКОВРЕМЕННОЙ ХОЛОДОВОЙ НАГРУЗКЕ IN VIVO И IN VITRO
В.ИТиханов1, Н.А.Лосев2, В.А.Дороиск'их', Д-ПРешодько1,
ИВ.Тиханов3, Р. А. Анохина1, Е.Г.Роговченко4
КАмурская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения РФ, 675000, г. Благовещенск, ул. Горького, 95 2HIIII экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАКШ,
197376, г. Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12 3Медико-санитарная часть №78 Федеральной службы исполнения наказаний России,
191014, г. Санкт-Петербург, набережная реки Фонтанки, 36А 4Амурская областная клиническая больница, 675028, г. Благовещенск, ул. Воронкова, 26
РЕЗЮМЕ
Центральные и периферические холинергиче-ские механизмы участвуют в регуляции уровня общих липидов, свободных жирных кислот в сосудистом русле, влияют на потребление молекулярного кислорода экспериментальными животными при длительной ХОЛОДОВОЙ нагрузке (ХОЛОДОВОЙ адаптации). В связи с этим были проведены исследования по определению содержания диеновых конъюгатов, гидроперекисей липидов и малонового диальдегида в ткани печени крыс при введении непрямого мускаринчувствительного и никотинчув-ствительного миметика прозерина, обладающего антихолинэстеразными механизмами накопления эндогенного ацетилхолина в период кратковременной холодовой нагрузки (3 часа), создаваемой у экспериментальных животных. Кратковременная холодовая нагрузка способствоала увеличению содержания диеновых конъюгатов на фоне снижения гидроперекисей в общих липидах печени, малонового диальдегида в гомогенате печени. Было отмечено, что введение непрямого мускаринчувствительного и никотинчувствитель-ного миметика прозерина (0,2 мг/кг) на фоне кратковременной холодовой нагрузки (холодового окислительного стресса) увеличивает содержание малонового диальдегида в гомогенате печени, снижая при этом уровень первичных продуктов перок-сидации - диеновых конъюгатов и гидроперекисей в общих липидах печени. Прозерин в NADF*H- зависимом (ферментативном) механизме индуцирования перекисного окисления липидов in vitro в мольной концентрации 10 4 М вызывает проокси-дантный эффект. Полученные в эксперименте данные по активации перекисного окисления липидов в условиях in vivo сопоставляются со способностью непрямого мускаринчувствительного и никотин-чувствительного миметика прозерина окислять липиды при индуцировании перекисного окисления липидов in vitro.
Ключевые слова: прозерин, холодовой стресс, пере-кисное окисление липидов биологических мембран, продукты пероксидации (гидроперекиси липидов, диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид).
SUMMARY
COMPARISON OF PROSERIN OXIDATIVE ACTIVITY AT SHORT COLD STRESS IN VIVO AND IN VITRO
V.I.Tikhanov', N.A.Losev2, V.A.Dorovskikh', D.P.Reshod'ko1, LV.Tikhanov3, R.A.Anokhina', E.G.Rogovchenko4
1Алпиг State Medical Academy, 95 Gor'kogo Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation 2Research Institute of Experimental Medicine of Northwest Branch RAKIS, 12 akad. Pavlova Str.,
St. Petersburg, 197376, Russian Federation 3Kledical Care Unit №78 of the Federal Penitentiary Sen’ice of Russia, 36A Fontanka River Emb.,
St. Petersburg, 191014, Russian Federation 4Amur Regional Clinical Hospital, 26 Voronkova Str., Blagoveshchensk, 675028, Russian Federation
Central and peripheral cholinergic mechanisms participate in the regulation of general lipids level and free fatty acids in the bloodstream and have an influence on the use of molecular oxygen by experimental animals during long cold stress (cold adaptation). The investigations were done to determine the content of diene conjugate, of lipid hydroperoxides and malonic dialdehyde in the liver tissue of rats during the introduction of indirect mimetic proserin sensitive to muscarine and nicotine and having anticholine mechanisms of uptake of endogenous acetylcholine during short cold stress (3 hours) in experimental animals. Momentary cold stress contributed to the increase of diene conjugates content against the decrease of hydroperoxide in the common lipids of the liver and of malonic dialdehyde in homogenate of the liver. It was found out that the introduction of indirect mimetic proserin sensitive to muscarine and nicotine (0,2 mg/kg) against momentary cold stress (cold oxidative stress) increases the content of malonic dialdehyde in the homogenate of the liver decreasing the level of primary peroxidation products - diene conjugates and hydroperoxides in the common lipids of the liver. Proserin in NADF*H-dependent (enzymatic) mechanisms of induction of POL ги vitro in mole concentration 104 M causes a prooxidant effect. The data about activation of lipid peroxidation in the conditions in vivo received during the experiment are compared with the ability of indirect mimetic proserin
sensitive to muscarine and nicotine to oxidize lipids during induction of lipid peroxidation in vitro.
Key words: proserin, cold stress, biological membranes lipid peroxidation, products of peroxidation (lipid hydroperoxides, diene conjugates, та Ionic di aldehyde).
Считается, что накопление в тканях продуктов пе-рекисного (свободнорадикального) окисления липидов (ПОЛ) сопровождается нарушениями функций белковых структур мембраны клеток, в том числе и рецепторных белков плазматической мембраны [1, 9]. Присоединение к аминогруппам белковых образований липидов клеточных мембран альдегидных компонентов [(4-HNE)-4-hydroxynonenal], образующихся в результате ПОЛ, ведёт к изменению свойств белков в липидах мембран [5]. Кроме этого установлено, что малоновый диальдегид (МДА) способен реагировать с ДНК клетки, образуя ДНК-адщукты, сшивающие двойные спирали нуклеиновых кислот. Липидные гидропероксиды и продукты их деградации вызывают отрицательное влияние на малые пептиды клеточных мембран и нуклеозиды клетки [2].
Согласно литературным данным, при длительной холодовой нагрузке отмечается увеличение содержания продуктов ПОЛ [3, 4, 6, 7, 10]. Однако результаты проведенных нами ранее исследований показали, что центральные и периферические холинергические механизмы участвуют в регуляции уровня общих липидов, свободных жирных кислот в сосудистом русле, влияют на потребление молекулярного кислорода при холодовой адаптации. В связи с этим, нами были проведены исследования по определению продуктов ПОЛ в ткани печени в период кратковременной холодовой нагрузки на фоне введения непрямого мускаринчув-ствительного и никотинчувствительного миметика прозерина, обладающего антихолинэстеразным механизмом накопления эндогенного ацетилхолина.
Цель исследования - изучение влияния прозерина на накопление продуктов ПОЛ при кратковременной холодовой нагрузке в условиях in vivo и окислительной активности in vitro.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на кафедре фармакологии Амурской государственной медицинской академии. Эксперимент проводили на 40 белых беспородных крысах-самцах массой 150-200 г.
Протокол экспериментальной части исследования на этапах содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта соответствовал принципам биологической этики, изложенным в Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985), Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986), Приказе М3 СССР №755 от 12.08.1977 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных». Приказе М3 РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабо-
раторной практики».
При завершении исследований выведение животных из опыта проводили путем декапитации с соблюдением требований гуманности согласно Приложению №4 «О порядке проведения эвтаназии умерщвления животного» к Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к Приказу М3 СССР №755 от 12.08.1977). Исследование одобрено этическим комитетом Амурской государственной медицинской академии.
Охлаждение животных осуществляли ежедневно в течение 3 часов в условиях климатокамеры, создавая температурный режим -12°С с соблюдением адекватных условий влажности и вентиляции [3]. Животные были разделены на 3 группы, в каждой по 6 крыс: 1 группа - интактные животные, которых содержали в стандартных условиях вивария; 2 группа - контрольная, где крысы подвергались воздействию холода по 3 часа ежедневно; 3 группа - подопытная, где животным перед охлаждением (время экспозиции - 3 часа) вводили прозерин в дозе 0,2 мг/кг. Интенсивность процессов ПОЛ оценивали, исследуя содержание гидроперекисей липидов (ГП), диеновых конъюгатов (ДК), МДА в гомогенате печени животных по методикам, изложенным в ранее опубликованной нами работе [6].
Определение окислительной активности фармакологического агента, используемого в эксперименте, производили в условиях in vitro, оценивали по способности уменьшать или увеличивать аскорбатзависимое (неферментативное) и NADF»H- зависимое (ферментативное) ПОЛ в инкубационной среде с суспензией мик-росом печени и выражалось в процентах [7]. Перерасчёт содержания МДА после индуцирования ПОЛ in vitro делали на 1 мг белка микросом. ДЕмдд рассчитывали по разнице Емда после окисления микросом и Емда до окисления микросом. Пробы с содержанием фармакологического агента сравнивали с пробами, где окислялись только липиды микросом. Молярная концентрация прозерина в инкубационной среде создавалась согласно дозе лекарственного препарата, проявляющей фармакологическую активность в условиях in vivo (мольная концентрация прозерина в инкубационной среде в 10 4 М соответствует дозе 0,2 мг/кг массы животного).
Статистическую обработку результатов проводили методом непараметрического дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса, с применением парного критерия Манна-Уитни. Количественные значения представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного интервала (Qj и Q3), где Q, — 5 перцентиль, Q3 - 95 перцентиль.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты проведенного эксперимента свидетельствуют, что кратковременное воздействие холода способствует увеличению ДК на 17,7% и уменьшению ГП на 22,3% в гомогенате печени контрольных крыс (табл. 1). Введение животным прозерина на фоне холодового воздействия вызывало снижение ДК в 1,22 раза, ГП -в 1,36 раза. При оценке величины МДА (вторичного
продукта ПОЛ) было констатировано, что кратковременная холодовая нагрузка приводит к снижению МДА на 34,8%, в свою очередь введение прозерина увеличивает содержание МДА в 1,5 раза. Таким образом, однократное трехчасовое охлаждение животных увеличивает выраженность ДК, снижая уровень ГП в общих липидах печени и содержание МДА в ткани
Содержание продуктов ПОЛ в ткани печени
печени. Введение на фоне кратковременной Холодовой нагрузки непрямого мускаринчувствительного и нико-тинчувствительного миметика прозерина увеличивает выраженность накопления МДА в печени экспериментальных животных на фоне снижения содержания ДК и ГП в общих липидах печени.
Таблица 1
экспериментальных животных (Ме [О ; 03])
Показатели 1 группа 2 группа 3 группа
ДК, нмоль/мг липида 143,9 [118,2; 158,3] 169,4 [159,5; 181,7] р,_=0,0283 134,2 [110,2; 156,9] р, ,=0,00353
ГП, нмоль/мг липида 7,415 [6,97; 8,1] 6,06 [5,12; 6,81] р,_=0,00216 4,480 [3,18; 5,0] р, ,=0,00216
МДА, нмоль/мл 1,428 [1,28; 1,62] 0,907 [0,71; 1,2] р,_=0,0283 1,485 [1,29; 1,92] р, ,=0,00353
Согласно литературным данным, лекарственные вещества, имея особенности химического строения молекулы, вызывают как прооксидантный, так и антиоксидантный эффекты в тканях [5]. В структуру прозерина входят (рис. 1) диметилкарбомоильная структура, оксифенольная группа и триметиламмоний-ная составляющая [8].
диметилкарбомоильная структура
составляющая молекулы прозерина
Рис. 1. Структура молекулы прозерина.
Считается, что фенольное кольцо оксифенольной группы в молекуле прозерина может выполнять роль ловушки свободных радикалов, тем самым вызывая замедление окисления липидов ткани печени, предрасполагая к возникновению антиоксидантного эффекта. Кислород оксифенольной, диметилкарбомоильной структур, имеющий свойства би-радикала, может вы-
полнять роль донатора электронов, провоцируя движение электронов в тканях и, тем самым, предполагая появление прооксидантных свойств прозерина. Мы предполагаем, что химическое строение составляющих структур молекулы прозерина может оказывать влияние на процесс одноэлектронного восстановления и окисления липидов в ткани печени с дальнейшим развитием механизмов ПОЛ. Анализируя результаты проведенных нами экспериментов, складывается впечатление, что прозерин, вводимый подопытным животным, способен ускорять окисление липидов печени, в связи с чем нами была высказана рабочая гипотеза -ускоренный переход продуктов ПОЛ является результатом накопления эндогенного ацетилхолина в ткани печени, который, в свою очередь, способен влиять на окисление липидов.
Для подтверждения способности прозерина вызывать в липидах прооксидантные или антиоксидантные эффекты, нами были проведены эксперименты в условиях in vitro. Окисление липидов с присутствием в инкубационной среде прозерина в мольной концентрации 10 4 М показало, что окисление липидов микросом ас-корбатзависимыми (неферментативными) механизмами приводит к уменьшению окисления липидов, равнозначному в +5% (табл. 2).
Таблица 2
Аскорбатзависимое (неферментативное) окисление липидов микросом с содержанием прозерина
в инкубационной среде 104 М (Me [Q,; QJ)
МДА в пробах до окисления липидов МДА в пробах после окисления липидов Окислительная активность прозерина
1 группа проб (п=6) ДЕмда микросом, нмоль/мг белка 2 группа проб (п=6) АЕмда микросом +прозерин, нмоль/мг белка 3 группа проб (п=6) ДЕмда микросом, нмоль/мг белка 4 группа проб (п=6) ^МДА микросом +прозерин, нмоль/мг белка
0,304 [0,022; 0,041] 0,503 [0,041; 0,056] р, j=0,00648 19,091 [18,415; 19,674] р, 4=0,0001 р3 ,=0,0172 18,054 [17,719; 18,402] р4_=0,00225 р4 ,=0,00394 Р4-3=0'004 +5,5% [2,94; 7,35]
Примечание: здесь и в табл. 3 (+) - антиоксидантный, (-) - проксидантный эффекты прозерина.
79
Полученные данные свидетельствуют: присутствие прозерина в инкубационной среде, где аскорбатзависи-мыми механизмами создаётся поток электронов (гсс1о\-потенциал несёт отрицательный заряд), не усиливает окисление липидов.
Индуцирование МАШ^Н- зависимыми (ферментативными) механизмами окисления липидов микросом с присутствием в инкубационной среде прозерина в мольной концентрации 10 4 М приводит к усилению окисления липидов, равнозначному в -3,4 % (табл. 3).
Таблица 3
NADF^H-jaiiiicimoc (ферментативное) окисление липидов микросом с содержанием прозерина
в инкубационной среде 104 М (Me [Q ; Q ])
МДА в пробах до окисления липидов МДА в пробах после окисления липидов Окислительная активность прозерина
1 группа проб (п=6) ДЕмда микросом, нмоль/мг белка 2 группа проб (п=6) ДЕмда микросом +прозерин, нмоль/мг белка 3 группа проб (п=6) ДЕмда микросом, нмоль/мг белка 4 группа проб (п=6) ДЕмда микросом +прозерин, нмоль/мг белка
0,147 [0,116:0,248] 0,436 [0,193:0,772] р, 4=0,0163 2,378 [2,125:2,566] р, =0,0172 р, ,=0,00394 2,818 [2,428; 2,953] р41=0,000224 р4_,=0,004 Р„=0.0249 -3,4% [-0,1; -15,6]
Индуцирование потока протонов с присутствием прозерина в инкубационной среде показывает, что эффекты прозерина в этой модели окисления липидов близки эффектам прозерина в модели индуцирования ПОЛ в условиях in vivo.
Таким образом, окисление липидов in vitro с присутствием в инкубационной среде прозерина свидетельствует о том, что прозерин в мольной концентрации 10 4 М при индуцировании аскорбатза-висимого (неферментативного) механизма окисления липидов вызывает антиоксидантный эффект, активация NADF'H- зависимого (ферментативного) механизма окисления липидов вызывает усиление окисления липидов микросом.
Сопоставляя данные, полученные в эксперименте по индуцированию ПОЛ в моделях in vivo и in vitro, можно сделать заключение: прозерин в NADF'H-зави-симом (ферментативном) индуцировании ПОЛ in vitro вызывает эффект, схожий по направленности с эффектом прозерина в условиях in vivo.
Выводы
1. Кратковременная холодовая нагрузка, создаваемая животным в течение 3 часов, увеличивает содержание ДК на фоне снижения ГП в общих липидах печени и МДА в гомогенате печени.
2. Введение животным прозерина в дозе 0,2 мг/кг на фоне воздействия низких температур увеличивает уровень МДА, снижая содержание ДК и ГП в общих липидах печени.
3. Прозерин в NADF*H- зависимом (ферментативном) механизме индуцирования ПОЛ in vitro вызывает прооксидантный эффект, схожий по направленности с эффектом прозерина в условиях in vivo.
ЛИТЕРАТУРА
1. Владимиров Ю.А. Биологические мембраны и незапрограммированная смерть клетки // Сорос, обра-
зов. журн. 2000. Т.6, №9. С.2-9.
2. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах // Сорос, образов, журн. 2000. Т.6, №12. С.13-19.
3. Доровских В.А. Фармакологическая коррекция холодового воздействия в эксперименте: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Ленинград, 1987. 48 с.
4. Адаптогены и Холодовой стресс: вчера, сегодня, завтра... / В.А.Доровских [и др.]. Благовещенск: АГМА, 2006. 214 с.
5. Фенольные биоантиоксиданты / Н.К.Зенков [и др.]. Новосибирск: СО РАМН, 2003. 328 с.
6. Сравнительная характеристика влияния дигид-рокверцетина и витамина Е на продукты перекисного окисления липидов при холодовом воздействии / О.Г.Круглова [и др.] // Бюл. физиол. и патол. дыхания. 2011. Вып.40. С.71-73.
7. Ли О.Н. Антиоксидантные свойства арабинога-лактана в условиях холодового стресса: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Владивосток, 2011. 25 с.
8. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна, 2010. 1216 с.
9. Симонова Н.В., Доровских В.А., Штарберг М.А. Адаптогены в коррекции процессов перекисного окисления липидов биомембран, индуцированных воздействием холода и ультрафиолетовых лучей // Бюл. физиол. и патол. дыхания. 2011. Вып. 40. С.66-70.
10. Настой лекарственных растений и окислительный стресс в условиях холодового воздействия / Н.В.Симонова [и др.] //Бюл. физиол. и патол. дыхания. 2013. Вып.48. С.76-80.
REFERENCES
1. Vladimirov Yu. A. Sorosovskiy obrazovatel’nyv zhur-nal - Soros Educational Journal 2000; 6(9): 2-9.
2. Vladimirov Yu. A. Sorosovskiy obrazovatel’nyy zhur-nal - Soros Educational Journal 2000; 6(12): 13—19.
3. Dorovskikh V.A. Farmakologicheskava korrektsiya kholodovogo vozdeysh’iya v eksperimente: avtoreferat dis-sertatsii doktora meditsinskikh nauk [Pharmacological correction of cold exposure in the experiment: abstract of thesis... doctor of medical sciences]. Leningrad; 1987.
4. Dorovskikh V A., Korshunova N.V., Krasavina N.P., Simonova N. V., Tikhanov V.I., Simonova N.P. Adaptogenv i kholodovov stress: vchera, segodnva, zavtra... [Adapto-gens and cold stress: yesterday, today, tomorrow...]. Blagoveshchensk: AGMA; 2006.
5. Zenkov N.K., Kandalintseva N.V., Lankin V.Z., Men'shchikova E.B., Prosenko A.E. Fenol'nve bioantiok-sidantv [Phenolic Bioantioxidants]. Novosibirsk: SB RAMS; 2003.
6. Kruglova O.G., Dorovskikh V.A., Tikhanov V.I.,
Kruglova T.G., Bocharnikova I.A., Reshodko D.P Bul-leten'fiziologii ipatologii dyhaniya 2011; 40:71-73.
7. Li O.N. Antioksidantnve svoysh’a arabinogalaktana v uslovivakh kholodovogo stressa: avtoreferat dissertatsii kandidata meditsinskikh nauk [Antioxidant properties of arabinogalactan in conditions of cold stress: abstract of thesis... candidate of medical sciences]. Vladivostok; 2011.
8. Mashkovskiy M.D. I.ekarstvennye sredsh’a [Drugs]. Moscow: Novayavolna; 2010.
9. Simonova N.V, Dorovskikh V.A., Shtarberg M.A. Bulle ten' fiziologii i patologii dyhaniya 2011; 40:66-70.
10. Simonova N.V., Dorovskikh V.A., Li O.N., Shtarberg M.A., Simonova N.P. BüUeten'fiziologii i patologii dyhaniya 2013; 48:76-80.
Поступила 15.07.2013
Контактная ннформацня Виктор Иванович Тихонов, кандидат медицинских наук, доцент кафедры фармакологии, Амурская государственная медицинская академия, 675000, г. Благовещенск, ул. Горького, 95.
E-mail: agma(aiamur.ru Correspondence should be addressed to Viktor 1. Tikhanov,
MD, PhD, Associated professor of Department of Pharmacology,
Amur State Medical Academy, 95 Gor'kogo Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation.
E-mail: agma(aiamur.ru
