CC BY
16
УДК 597-12:576.85
Ключевые слова: линии клеток, цитопатический эффект, IHNV Key words: cell lines, cytopathic effect, IHNY
Бочкова Е. В.
СРАВНЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЧЕТЫРЕХ ПОСТОЯННЫХ ЛИНИЙ КЛЕТОК РЫБ К ИЗОЛЯТАМ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ, ВЫДЕЛЕННЫМ У НЕРКИ ONCORHYNCHUS NERKA (WALBAUM)
НА КАМЧАТКЕ
comparative sensitivity of four fish cell lines to stocks of infectious hematopoietic necrosis virus, isolated from sockeye salmon oncorhynchus nerka (walbaum) from reservoirs of kamchatka
ФГУП Камчатский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии (КамчатНИРО), г. Петропавловск-Камчатский Адрес: 683000, г. Петропавловск-Камчатский, Набережная, 18
Kamchatka Research Institute of Fisheries and oceanography, Fetropavlovsk-Kamchatsky Address: 683000, Russia, Fetropavlovsk-Kamchatsky, Naberezhnaya, 18
Бочкова Елена Валентиновна, научный сотрудник / Botchkova Elena V., Scientific Employee
Аннотация. В течение 2007-2009 гг. провели серию опытов по определению чувствительности четырех постоянных клеточных линий рыб: эмбриона чавычи (CHSE-214), хвостового стебля синежаберного солнечника (BF-2), сердца кеты (CHH-1) и эпидермальных новообразований больного оспой карпа (EPC) к изолятам вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV), выделенным летом-осенью 2006-2008 гг. у половозрелой нерки из водоемов Камчатки. В опытах использовали как свежие изоляты, так и после разных сроков хранения. Наиболее чувствительными к изолятам IHNV оказались линии EPC, CHH-1, CHSE-214. По результатам эксперимента можно рекомендовать три вышеупомянутые линии для выделения и лабораторных исследований IHNV. BF-2 лучше использовать для работ со свежевыделенными вирусными изолятами IHNV, т. к. ее чувствительность к восстановленным после хранения сильно снижается. Чувствительность всех четырех линий клеток к свежевы-деленным изолятам IHNV была несколько выше, чем к восстановленным, но продолжительность хранения последних - от 3 до 17 месяцев - не оказывала заметного влияния на снижение значений титров вируса. Summary. Four cell lines of fishes - CHSE-214, BF-2, CHH-1 and EPC have been tested on sensitivity to isolates of virus infectious hematopoietic necrosis. In experiences used fresh stocks of IHNV, and after different periods of storage, isolated from adult sockeye salmon from reservoirs of Kamchatka in 2006-2008. The most sensitivity was seen to isolates of IHNV in lines EPC and CHH-1. Line CHSE-214 has shown good ability to produce cytopathic effect. By results of experiment it is possible to recommend three above mentioned lines for isolation and laboratory researches stocks of IHNV. BF-2 is possible to use only for works with fresh virus isolates IHNV, as its sensitivity is strongly reduced to restored after storage. Sensitivity of all four cell lines to fresh isolates IHNV was a little bit higher, than to restored, but duration of storage of the last - from 3 till 17 months - did not render appreciable influence on reduction in values of viral titres.
Введение
В конце 1950 - начале 1960 гг. для выделения вирусных патогенов исследователи начали разрабатывать методы культивирования тканей рыб in vitro [6]. В настоящее время в повседневной работе вирусологические лаборатории всего мира используют технику изолирования вирусных патогенов рыб на клеточных линиях для диагностики заболевания и тестирования патогена. К основным требованиям, применяемым к постоянным линиям клеток для изоляции вирусных агентов, относят: возможность легко и быстро
восстанавливаться и размножаться, сохраняя свои свойства; чувствительность к вирусным патогенам прямо из первичных полевых образцов; способность вскоре после заражения показывать цитопатический эффект (ЦПЭ) и высокий титр; чувствительность к нескольким вирусам [3]. В основном при исследовании вирусных заболеваний рыб используют немногим более 60 распространенных и доступных клеточных линий [7]. Только некоторые вирусы реплицируются на специфических линиях клеток. По литературным данным, в лабораторной практике для выде-
ления и идентификации вирусов лососевых, в том числе вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани, вызывающего остро протекающее одноименное заболевание у молоди лососей, широко используют отвечающие вышеупомянутым требованиям линии клеток ЕРС, СШЕ-214, BF-2, FHM (хвостовой стебель черного толстоголова) и RTG-2 (гонады радужной форели) [3, 4, 7].
Однако стали появляться данные о том, что чувствительность постоянных линий клеток к вирусам сильно варьирует. При культивировании клеточные линии могут изменять свои свойства как функциональные, так и по отношению к некоторым вирусам [5]. Получаемые максимальные вирусные титры часто различаются в популяциях одной и той же линии клеток и между различными клеточными линиями. Некоторая вариабельность свойств клеточных культур может быть обусловлена рядом факторов, включая происхождение маточной клеточной линии и количество ее пассажей, технику культивирования, состав сред и др. [7].
В результате небольшого количества исследований и публикаций на эту тему выбор нужной клеточной линии и выделение на ней вируса зачастую может быть затруднено не только в какой-либо специфической диагностической ситуации, но и при проведении рутинных вирусологических исследований и экспериментальных работ.
Целью работы является проверка чувствительности четырех постоянных клеточных линий рыб ЕРС, СШЕ-214, СНН-1 и BF-2 к изолятам ГНЫЛУ выделенным у половозрелой нерки из разных водоемов Камчатки в 2006-2008 гг.
Кроме того, в работе подробно описан ци-топатический эффект, проявляющийся при заражении ГНЫУ указанных линий клеток, приведены фотографии разрушения клеточного монослоя на разных стадиях, что, несомненно, будет интересно и поможет при диагностике вирусных заболеваний специалистам «молодых» ветеринарных вирусологических лабораторий, только начинающим свою деятельность.
Материалы и методы
При проведении экспериментов использовали четыре постоянные клеточные линии рыб: ЕРС, СШЕ-214, СНН-1 и BF-2. Культивирование линий клеток осуществляли по общепринятым методикам [2] при температуре в пределах 20±1 °С. Инокуляцию линий клеток разными изолятами вируса в каждом опыте проводили одновременно, во всех сериях опытов использовали одни и те же маточные культуры клеток.
Изоляты ГНЫУ были выделены в августе-октябре 2006-2008 гг. из внутренних органов (селезенка, почка) или овариальной жидкости половозрелой нерки, отловленной в водоемах, относящихся к бассейнам крупных рек Камчатки (таблица 1).
Одна серия опытов была поставлена с изолятами первого пассажа непосредственно после выделения вируса - РП08 (изо-лят из р. Плотникова), 0А08 (оз. Азабачье), 0К08 (оз. Курильское) и 0Д08 (оз. Дальнее), в дальнейшем мы называем их свеже-выделенными. Кроме этого, для трех серий опытов использовали вирусные изоляты 2-4 пассажа: РП06-08, 0А06-08, 0К06-08 и ОД06-08, которые хранились в нашем бан-
Таблица 1.
Изоляты ГНЖУ, использованные в эксперименте по определению чувствительности клеточных культур
Бассейн реки Географическое положение Название водоема Шифр* изолята ШЫУ
р. Большая юго-запад полуострова р. Плотникова РП08 и РП06-08
р. Камчатка северо-восток полуострова оз. Азабачье 0А08 и 0А06-08
р. Озерная юг полуострова оз. Курильское 0К08 и 0К06-08
р. Паратунка юго-восток полуострова оз. Дальнее 0Д08 и 0Д06-08
Примечание: * - первые две буквы обозначают название водоема, две цифры - год отбора проб
ке культур при -70 °С с добавлением 20 % сыворотки крови эмбрионов коров, в дальнейшем - восстановленные изоляты. Сроки хранения варьировали от трех до семнадцати месяцев. Первичное выделение, титрование и идентификацию ГНЫУ осуществляли на линии клеток ЕРС, считающейся одной из самых чувствительных к ГНЫУ линий, с использованием традиционных методов [2, 4]. Для определения значимости различий между полученными титрами изолятов вируса использовали стандартный критерий (сравнение десятичных логарифмов тканевых цитопатических доз - ^ ТЦД/мл, рассчитанных по методу Рида и Менча [1]): различия десятичных логарифмов меньше чем на 1 считались незначительными, от 1 до 1,6 -сомнительно значимыми и от 1,7 и больше -существенно значимыми [9].
Титрование всех изолятов на линиях клеток ЕРС, СШЕ-214, СНН-1 и BF-2 проводили на 96-луночных микропанелях. Инокуляцию клеточных культур осуществляли одновременно с посевом клеток. Зараженные клетки инкубировали при температуре +15 °С в течение двух недель до полного прекращения цитопатического действия, ежедневно просматривая под световым микроскопом.
Результаты исследований
После инокуляции как свежевыделен-ными, так и восстановленными изоля-тами ШКУ линий клеток ЕРС, СНН-1 и СШЕ-214, начиная с 3-4 дня наблюдали хорошо различимый цитопатический эффект: сначала в виде отдельных скоплений округлых, мертвых клеток, затем на месте скоплений образовывалась дырочка в монослое, окруженная погибшими клетками, такие очаги увеличивались в размерах и, наконец, происходило полное разрушение всех клеток (рис. 1). Как правило, на линиях ЕРС и СНН-1 в лунках, где отмечали ЦПЭ, со временем происходило полное разрушение монослоя; в лунках без ЦПЭ и контроле сохранялся сформированный, без признаков дегенерации клеточный слой. Цитопатическое действие вируса на линии BF-2 проявлялось несколько позже - на 5-8 дни, затем в опыте со свежевыделенными изолятами наблюдали
изменения, подобные описанным выше. При заражении BF-2 восстановленными изоля-тами развитие ЦПЭ происходило медленнее и в большинстве лунок не превышало 5075 %. На СШЕ-214 и BF-2 в лунках, где не происходило полного разрушения клеток, ЦПЭ был хорошо заметен на протяжении первой недели проведения опыта, затем его было трудно отличить от стареющего монослоя. Тем не менее, на 14-й день (к концу опыта) погибшие в результате старения клетки легко отличали от разрушенных вирусом. Как правило, появление новых лунок с ЦПЭ на всех перевиваемых линиях клеток в опытах со свежевыделенными изолятами прекращалось на 9-10 дни, с восстановленными - на 7-9. Репликация свежевыделенных и восстановленных изолятов ИКУ представлена на рисунках 2 и 3.
Значения титров четырех свежевыделен-ных изолятов ИКУ, полученные на исследуемых линиях клеток, были значительно выше
К Б
ЕРС
А | г, - г • % -г;. ■ .' ' . ■ /щш г « • ^ ■ V*. •• . : ' шщж
СНН-1
д А щй • 'У' шшш-4 ш< ' швшл -' г ИЯВЯН ЭаэЕЙЗ! ? : -шх . - -щ v ' в
СН8Е-214
А Б а в
ВР-2
Рис. 1. Цитопатогенное действие ЩКУ на четырех клеточных перевиваемых линиях: А - норма; Б - на 3-6 дни после заражения; В - на 8-11 дни после заражения.
Рис. 2. Репликация свежевыделенных изолятов IHNV на линиях клеток: А - РП08 (изолят из р. Плотникова); Б -ОД08 (оз. Дальнее); В - ОК06-08 (оз. Курильское); Г - ОА08 (оз. Азабачье).
Рис. 3. Репликация восстановленных изолятов IHNV опытов): А - РП06-08 (изолят из р. Плотникова); Б -Г - 0А06-08 (оз. Азабачье).
эпизоотически значимого уровня 105ТЦД50/ мл [2] (исключение составляет линия BF-2, изолят РП08) и незначительно отличались друг от друга (минимум - 0,2 максимум -1,3 рис. 4А, табл. 2). Стоит отметить, что титры изолята из оз. Дальнее на линиях клеток СНН-1, СШЕ-214 и BF-2 на 1,0-1,2 ^ превышали значение, полученное на общепринятой для выделения 1Н№У линии ЕРС (табл. 2).
на линиях клеток (средние значения по трем сериям 0Д06-08 (оз. Дальнее); В - 0К06-08 (оз. Курильское);
У восстановленных изолятов 1Н№У наблюдали некоторое снижение значений титров по сравнению с исходными, т. е. полученными при выделении его из первичного материала (рис. 4Б, табл. 3). При этом не выявили существенной разницы между изолятами, которые хранились в банке культур три месяца, и теми, что находились там более полутора лет. Исходные титры, определенные на линии клеток ЕРС, во всех слу-
Рис. 4. Сравнение значений титров камчатских изолятов IHNV, полученных на разных линиях клеток: А - свеже-выделенные штаммы; Б - восстановленные после хранения (средние значения по трем сериям опытов).
Таблица 2.
Значения титров свежевыделенных изолятов IHNV на различных линиях клеток
Изоляты IHNV Титры изолятов IHNV, lg ТЦД50/мл
EPC CHH-1 CHSE-214 BF-2
РП08 8,6 8,8 7,6 4,7
ОД08 7,4 8,6 8,4 8,6
ОК08 8,2 8,3 8,5 7,8
ОА08 7,5 6,2 7,6 6,5
Таблица 3.
Значения титров восстановленных изолятов ШКУ на различных линиях клеток
(среднее по трем сериям опытов)
Изоляты IHNV Средний исходный титр изоля-та, lg ТЦД50/мл Средние титры восстановленных изолятов IHNV, lg ТЦД50/мл / снижение титров после хранения, lg
EPC CHH-1 CHSE-214 BF-2
РП06-08 8,8 7,4 / 1,4** 6,6 / 2,2 5,3 / 3,5 4,9 / 3,9
ОДО6-О8 8,2 7,0 / 1,2** 7,4 / 0,8* 6,3 / 1,9 4,7 / 3,5
0К06-08 8,1 7,6 / 0,5* 6,8 / 1,3** 6,9 / 1,2** 4,4 / 3,7
0A06-08 8,3 7,5 / 0,8* 7,5 / 0,8* 5,7 / 2,6 4,6 / 3,7
Примечание: * - незначительные различия; ** - сомнительно значимые различия; жирным шрифтом -существенно значимые различия.
чаях были высокими и колебались в пределах 0,4*107,4... 0,4*109,3. Средние их значения составили: 0,4*108,1 (изоляты из оз. Курильское), 0,4*108,2 (из оз. Дальнее), 0,4*108,3 (из оз. Азабачье) и 0,4*108,8 (р. Плотникова). На линиях клеток ЕРС и СНН-1, в среднем, значения титров по сравнению с исходными снизились незначительно или сомнительно значимо - на 1,1 и 1,3 соответственно; на СНБЕ-214 и на BF-2 существенно значимо -на 2,3 ^ и на 3,7 соответственно.
Выделенные у одного вида рыб, хранящиеся и восстановленные при одинаковых условиях изоляты ЩМУ вели себя по-разному
на разных линиях клеток. На ЕРС изоляты из озер Азабачье и Курильское незначительно снизили свою активность - на 0,5-0,8 а из оз. Дальнее и р. Плотникова - на 1,2 и 1,4 ^ (табл. 3). На клеточной линии СНН-1 незначительно снизили свою активность изоляты из озер Дальнее и Азабачье (0,8 тогда как из оз. Курильское и р. Плотникова - на 1,3 и 2,2 соответственно. При этом значения титров изолятов из озера Дальнее на СНН-1 оказались несколько выше, чем на ЕРС - именно на этой линии, как уже упоминалось выше, был определен исходный титр. На СНБЕ-214 вирулентность вируса
из оз. Курильское снизилась на 1,2, из озер Дальнее, Азабачье и р. Плотникова - на 1,9, 2,6 и 3,5 lg, соответственно. На линии BF-2 все средние значения титров восстановленных изолятов имели значительные различия с исходным титром - были меньше почти в два раза и ниже эпизоотически значимого уровня.
Обсуждение результатов
Как мы уже упоминали, в большинстве вирусологических лабораторий мира для диагностики и текущих лабораторных работ с IHNV используют линии клеток EPC, BF-2, CHSE-214, RTG-2 и FHM. Однако в наших исследованиях мы продемонстрировали, что линия BF-2 обладает слабой чувствительностью к восстановленным после хранения вирусным изолятам IHNV. По данным Фен-дрика с соавторами [3] к двум различным изолятам IHNV была нечувствительна линия RTG-2, а CHSE-214 оказалась чувствительной только к одному из них.
Английские ученые [5] провели эксперимент по изучению влияния серийных пассажей на чувствительность к вирусам 5 клеточных линий. EPC и BF-2 показали стабильную вирусную чувствительность на протяжении всего периода пассирования, тогда как способность CHSE-214 продуцировать ЦПЭ в ответ на заражение вирусом инфекционного некроза поджелудочной железы (IPNV) начала резко падать после 290-го пассажа. Авторы предполагают, что это могло случиться из-за претерпеваемых клетками изменений в их характеристиках при высоких номерах пассажей, в результате которых произошла редукция их вирусной чувствительности. Маккалистер [8] отмечал, что создание одних и тех же культур клеток в различных лабораториях и условиях, может приводить к развитию субпопуляционных маточных линий, которые характеризуются фенотипической изменчивостью по их росту, морфологии, чувствительности к вирусам и т. д. Так, у одной из двенадцати маточных клеточных линий CHSE-214 разного происхождения была отмечена низкая чувствительность к IHNV.
Учитывая свои и литературные данные, можно сделать вывод, что лучшим резуль-
татом для изолирования и лабораторного изучения IHNV будет использование двух чувствительных клеточных линий. По времени появления первых признаков ЦПЭ, наглядности, т. е. легкости визуального наблюдения за разрушением клеточного монослоя, скорости репликации и высоким значениям конечных титров вирусных изолятов, наиболее чувствительными к IHNV, выделенному у половозрелой нерки из разных водоемов Камчатки, оказались линии EPC и CHH-1. Хочется подчеркнуть, что линия CHH-1, довольно редко используемая для диагностических работ с вирусом инфекционного некроза гемопоэтической ткани, в наших экспериментах показала очень хорошую и стабильную способность продуцировать цитопатический эффект. У линии CHSE-214 существенно снизилась чувствительность к восстановленным после хранения изолятам IHNV (таблица 3), тем не менее, в отличие от линии BF-2, все полученные на ней значения титров были выше эпизоотически значимого уровня. Таким образом, по результатам наших экспериментов для лабораторных работ с вирусом IHN мы рекомендуем эти три вышеупомянутые клеточные линии.
Различия в репликации свежевыделен-ного и восстановленного вируса на разных линиях клеток, обнаруженные в ходе наших экспериментов, могли быть обусловлены снижением вирулентности изолятов в результате их хранения, которое отразилось на всех линиях клеток, и/или некоторыми изменениями свойств самих клеточных культур в процессе их культивирования и увеличения количества их пассажей. Но эти предположения не объясняют, почему на разных исследуемых клеточных линиях значения титров одних и тех же штаммов довольно сильно отличались друг от друга, и, наоборот, на одной и той же линии клеток варьировали титры изолятов из разных водоемов при примерно одинаковых исходных, т. е. полученных при первичном выделении, значениях титра. Возможно, в данных случаях имеет место избирательная чувствительность клеточных линий к определенным, может быть, географически различающимся, штаммам IHNV. Это предположение требует дальнейших ис-
следований. Полученные нами данные показали, что линия СНБЕ-214 во всех сериях опытов стабильно показывала большую чувствительность к изолятам из озер Дальнее и Курильское, как свежим, так и восстановленным, СНН-1 - к изолятам из озера Дальнее, ЕРС - к изолятам из реки Плотникова и озера Курильское (таблицы 2 и 3). Линия BF-2 показала хорошую чувствительность к свежевыделенным изолятам ГНЫЛ, особенно из оз. Дальнее, но титр РП08 на этой линии был почти в два раза ниже по сравнению с полученными на других линиях титрами этого же изолята.
В 2003 г. нами совместно с американскими учеными было проведено филогенетическое типирование 7 камчатских изолятов вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани, выделенных у нерки из бассейна р. Большая, и сравнение их с изолятами, полученными из других мест его распространения. В результате этих исследований выявили четыре типа нуклеотид-ных последовательностей, из которых одна была идентична наиболее часто встречающемуся северо-американскому типу, распространенному на Аляске и в штате Вашингтон. Другая соответствовала второму по частоте встречаемости типу последовательностей, и оставшиеся были уникальны в своем роде, но отличались от двух первых только на один-два нуклеотида [10]. К сожалению, в число исследованных не вошли изоляты из бассейнов рек Озерная, Камчатка и Паратун-ка (в то время они еще не были выделены), работы в этом направлении продолжаются. На вопрос о том, играют ли какую-либо роль различия в нуклеотидных последовательностях вирусного изолята ГНЫЛ на его способность продуцировать ЦПЭ на различных линиях клеток, помогут ответить дальнейшие исследования.
Заключение
По времени появления первых признаков цитопатического эффекта и конечным значениям титра наиболее чувствительными как к свежевыделенным, так и восстановленным изолятам ГНЫЛ оказались линии ЕРС и СНН-1. Хорошую чувствительность
показала линия CHSE-214. По результатам эксперимента можно рекомендовать три вышеупомянутые линии для выделения и лабораторных исследований изолятов IHNV.
Целесообразно одновременно проводить вирусное тестирование параллельно на двух чувствительных клеточных линиях, т. к. в ходе экспериментов отмечена довольно сильная вариабельность титров как одних и тех же изолятов на разных линиях клеток, так и изолятов из разных водоемов, тестируемых на одной линии клеток, при примерно одинаковых их исходных, т. е. полученных при первичном выделении, значениях титра.
Чувствительность всех четырех линий клеток к свежевыделенным изолятам IHNV была несколько выше, чем к восстановленным, но длительность хранения последних -от 3 до 17 месяцев - особого влияния на значения титров не оказывала.
Линию BF-2, при необходимости, лучше использовать для работ со свежевыделен-ными вирусными изолятами IHNV, т. к. к ее чувствительность к восстановленным после хранения сильно снижается.
Выражаю благодарность и признательность сотрудникам лаборатории болезней рыб и беспозвоночных ФГУП КамчатНИРО: зав. лабораторией Рудаковой С. Л. и Кольцовой Н. Н.
Список литературы
1. Лабораторный практикум по болезням рыб ; под ред. В. А. Мусселиус. - М. : Лег. и пищ. пром-сть, 1983. - 294 с.
2. Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб. - М. : АМБагро, 1998. - Ч. 1. - 310 c.
3. Fendric, J. L. Comparative sensitivity of five fish cell lines to wild type IHNV from two Oregon sources / J. L. Fendric, W. J. Groberg, J. C. Leong // J. Fish Dis. -5. - 1982. - P. 87-95.
4. Fish pathology section. Laboratory manual ; ed. T. R. Meyers. Special publication № 12, 2nd Edition. -Alaska : Alaska Department of Fish and Game, 2000. - 191 р.
5. Fourrier, M. C. S. Long term monitoring of the virus susceptibility of five established fish cell lines / M. C. S. Fourrier, E. S. Munro, R. J. Fryer, T. S. Hastings // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. - 27 (5). - 2007. -P. 192-199.
6. Fryer, J. L. The in vitro cultivation of tissue and cells of Pacific salmon and steelhead trout / J. L. Fryer, A. Yusha, K. S. Pilcher // Annals of the New York
Academy of Sciences. - Vol. 126. - Part 1. - 1965. -P. 566-586.
7. Lidgerding, B. C. Cell lines used for the production of viral fish disease agents / B. C. Lidgerding // International symposium on Fish biologics: Serodiagnostics and Vaccines, Leetown, U.S.A. Develop. Biol. Standard. 49. -1981. - 3. - P.233-241.
8. McAllister, P. E. Susceptibility of 12 lineages of Chinook salmon embryo cells (CHSE-214) to four viruses from salmonid fish: implications for clinical assay
sensitivity / P. E. McAllister // J. Aquat. Anim. Health. -№ 9. - 1997. - P. 291-294.
9. Rovozzo, G. G. A manual of basic virological techniques / G. G. Rovozzo, C. N. Burke // Prentice-Hall, Englewood Cliffs. - New Jersey, 1973. -P. 38-48.
10. Rudakova, S. L. Occurrence and Genetic Typing of Infectious Hematopoietic Necrosis Virus in Kamchatka Russia / S. L. Rudakova, G. Kurath, E. V. Bochkova // J. Dis. Aquat. Org. - Vol. 75. - 2007. - P. 1-11.
ф ВЕТЕРИНАР.™
Gee о ветеринарии длн врачей и владельцев животных
форум
последние новости подборка статей справочники
каталог лекарственных средств адреса ветклиник и зоомагазинов информация о выставках и конференциях анонсы ветеринарных журналов
Заходите на www.veterinar.ru, и Вы найдёте много интересной и полезной информации!
Приглашаем к сотрудничеству ветеринарных врачей и организации, e-mail: irwet(ai|nbox.ru [email protected] тел.: 8 (909) 6^6-76-43, 8 {916J181-95-58
