CC BY
102
ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
____________91
2012. Вып. 4
УДК 616-097.3:543.544(045)
А.С. Терентьев, А.Ю. Сидоров, Л.В. Бедулева, ЕЮ. Столярова, И.В. Меньшиков
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧИСТЫХ FC-ФРАГМЕНТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНА G КРЫСЫ
Ранее нами была разработана вакцина для лечения ревматоидного артрита человека, содержащая в качестве действующего начала Fc-фрагменты гомологичного IgG. Мы показали ее эффективность в подавлении аутоиммунных реакций против коллагена и редукции симптомов артрита в модели коллаген-индуцированного артрита крыс. Было обнаружено, что эффективность вакцины зависит от чистоты Fc-фрагментов IgG, отсутствия примесей Fab-фрагментов, которые нивелируют эффекты подавления аутоиммунных реакций в модели коллаген-индуцированного крыс, вызываемые Fc-фрагментами. Целью работы явилась разработка методов эффективной очистки Fc-фрагментов IgG крыс от примесей Fab-фрагментов. Для этого был проведен сравнительный анализ эффективности методов катионообменной, анионообменной и аффинной хроматографии на протеин G сефарозе для получения чистых Fc-фрагментов IgG крыс.
Fc-фрагменты IgG крыс, полученные методом папаинового протеолиза, сорбируются как на ДЭАЭ-, так и на КМ-целлюлозе. Fab-фрагменты IgG крыс - гетерогенны, часть из них не взаимодействует ни с КМ-целлюлозой, ни ДЭАЭ-целлюлозой, другая часть сорбируется как на КМ-, так и ДЭАЭ - целлюлозе. Использование градиента ионной силы при ионообменной хроматографии позволяет изменить соотношение Fc-и Fab-фрагментов IgG крыс в образцах, элюируемых с сорбента, но добиться полного разделения Fab- и Fc-фрагментов и получить чистые Fc-фрагменты, свободные от примесей Fab-фрагментов не удается. Обнаружено, что Fc-фрагменты IgG крыс, полученные методом папаинового гидролиза, не взаимодействуют с протеином G, тогда как Fab-фрагменты связываются с ним. Аффинная хроматография на протеин G-сефарозе является эффективным методом разделения папаиновых Fc- и Fab-фрагментов IgG крыс и получения чистых Fc-фрагментов IgG крыс.
Ключевые слова: Fc-фрагменты крыс, способ очистки, иммуноглобулин G крыс, протеин G, ионообменная хроматография.
Фрагменты антител обладают биологической активностью и привлекают внимание в связи с потенциалом использования в качестве профилактических и терапевтических агентов [1-3]. Ранее нами была разработана вакцина для лечения ревматоидного артрита человека, содержащая в качестве действующего начала Fc-фрагменты гомологичного IgG [4]. Мы показали ее эффективность в подавлении аутоиммунных реакций против коллагена и редукции симптомов артрита в модели коллаген-индуцированного артрита крыс (Там же). Было обнаружено, что эффективность вакцины зависит от чистоты Fc-фрагментов IgG, отсутствия примесей Fab-фрагментов. Примеси Fab-фрагментов IgG, содержащиеся в препарате Fc-фрагментов, нивелируют эффекты подавления аутоиммунных реакций в модели коллаген-индуцированного крыс, вызываемые Fc-фрагментами. Мы столкнулись с проблемой воспроизводимости использованного нами метода ионообменной хроматографии для получения чистых Fc-фрагментов IgG крыс, не содержащих примеси Fab-фрагментов. Анализ литературы показал, что способы и условия разделения папаиновых фрагментов видоспецифичны [5; 6], методы эффективного разделения папаиновых фрагментов IgG крыс не разработаны. Некоторые универсальные методы, например, кристаллизация, позволяют получить чистые фрагменты, но не сохраняют конформацию молекул Fc-фрагментов, необходимую для проявления ими фармакологической активности [7; 8]. Поэтому целью работы явилась разработка методов эффективной очистки Fc-фрагментов IgG крыс от примесей Fab-фрагментов. Для этого был проведен сравнительный анализ эффективности методов катионообменной, анионообменной и аффинной хроматографии на протеин G сефарозе для получения чистых Fc-фрагментов IgG крыс.
Материалы и методика исследований
Иммуноглобулин G крыс был получен из плазмы крыс путем осаждения сульфатом аммония и очищен методом аффинной хроматографии на протеин G-сефарозе. В препарате IgG крыс методом электрофореза в ПААГ в восстанавливающих условиях выявляется две полосы, так же как в коммерческом препарате IgG крыс (Sigma). IgG крыс расщепляли папином 2 % w/w в 0,15 М растворе NaCl, содержащем 0,02 М натрий фосфатный буфер, pH 7,4, 0,02 моль /л трилона Б, в течение 2 часов при 37 °С, в присутствии 10 ммоль/л меркаптоэтанола. Смесь фрагментов отделяли от нерасщепленного IgG c помощью эксклюзионной хроматографии на сорбенте Superdex 200. Продукты папаинового гидролиза разделяли тремя методами.
1. Катионообменная хроматография на КМ-целлюлозе. Смесь фрагментов наносили на колонку в 0,01 М Ка-ацетатном буфере, рН 5,5. Элюцию проводили градиентом 0,01-0,15 М Ка-ацетатного буфера рН 5,5. Состав каждой фракции определяли методом электрофореза в ПААГ.
2. Анионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе. Смесь фрагментов наносили на колонку в 0,015 М Ка-фосфатном буфере, рН 7,5. Элюцию проводили градиентом 0-1,0 М КаС1 в 0,015 Ка-фосфатном буфере, рН 7,5. Состав пиков определяли методом электрофореза в ПААГ.
3. Аффинная хроматография на протеин G сефарозе. Смесь фрагментов наносили на колонку в
0,02 М Ка-фосфатном буфере, рН 7,0. Элюцию проводили 0,1 М глицин НС1 буфером, рН 2,7. Электрофорез образцов, получаемых при хроматографическом разделении, проводили в 10%-м разделяющем ПААГ в диссоциирующих и восстанавливающих условиях.
Результаты и их обсуждение
Эксклюзионная хроматография IgG крысы, расщепленного папаином. При разделении IgG крысы, расщепленного папаином, методом эксклюзионной хроматографии получено два пика (рис. 1).
Рис. 1. А - хроматографический профиль эксклюзионной хроматографии IgG, обработанного папином. Б - электрофореграмма пиков, полученных в результате разделения папаиновых фрагментов IgG методом эксклюзионной хроматографии. Условные обозначения: 1, 2(в), 2(н) - хроматографические пики; в - восходящая ветвь пика 2; н - нисходящая ветвь пика 2; Н - тяжелая цепь ^, L - легкая цепь IgG
На хроматограмме видно, что разрешение пиков не достаточно высокое. Электрофоретический анализ первого пика показал, что он содержит смесь нерасщепленного IgG и его Fab- и Fc-фрагментов. Восходящая и нисходящая ветви 2-го пика были собраны отдельно. Восходящая ветвь
2-го пика также содержит фрагменты IgG и нерасщепленный IgG. Нисходящая ветвь не содержит целых молекул IgG и представлена только его фрагментами. Поэтому далее для исследования эффективности методов разделения Fab- и Fc-фрагментов IgG была использована фракция, соответствующая нисходящей части пика 2, не содержащая нерасщепленных молекул IgG.
Разделение Fc- и Fab- фрагментов IgG крыс на КМ-целлюлозе. Хроматографический профиль и состав пиков, полученных при разделении смеси Fab- и Fc-фрагментов IgG на КМ-целлюлозе, представлен на рис. 2. На хроматограмме присутствуют два пика - транзитный и десорбируемый. Транзитный пик был разделен на три фракции. Десорбируемый пик сильно растянут, и был разделен на пять фракций.
На электрофореграмме (рис. 2б) видно, что Fab- фрагменты IgG крыс вариативны по физикохимическим свойствам. Часть Fab-фрагментов не связывается с сорбентом и выходит в составе 1-й, 2-й,
3-й фракций транзитного пика. Другая часть Fab-фрагментов сорбируется на КМ-целлюлозе, так же как Fc -фрагменты IgG крыс и выходит в составе десорбируемого пика. По мере увеличения молярности элюента происходит снижение доли Fab-фрагментов и увеличение доли Fc-фрагментов в образцах, снимаемых с колонки. Последние порции элюента (фракции 10, 11, 12) содержат Fc-фрагменты с небольшой примесью Fab-фрагментов.
Рис. 2. А - хроматографический профиль катионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе.
Пунктирной линией указан градиент элюирующего буфера. Б - электрофореграмма пиков
Таким образом, разрешающая способность КМ целлюлозы для разделения Fc- и Fab фрагментов IgG крыс низка. Использование градиента ионной силы позволяет не только изменить соотношение Fc-и Fab-фрагментов IgG крыс в получаемых образцах, но и добиться полного их разделения и получить чистые Fc-фрагменты, свободные от примесей Fab-фрагментов, на КМ целлюлозе не удается.
Разделение Fc- и Fab- фрагментов IgG крыс на ДЭАЭ -целлюлозе. Хроматографический профиль и состав пиков, полученных при разделении смеси Fab- и Fc-фрагментов IgG на ДЭАЭ-целлюлозе, представлен на рис. 3.
Рис. 3. А - хроматографический профиль анионообменной хроматографии на ДЭАЭ -целлюлозе.
Пунктирной линией указан градиент элюирующего буфера. Б - электрофореграмма пиков
На хроматограмме присутствует 3 пика: 1 транзитный и 2 десорбируемых. На электрофоре-грамме видно, что часть Fab-фрагментов IgG крыс не сорбируется на ДЭАЭ-целлюлозе и выходит в составе транзитного пика. Другая часть Fab-фрагментов, так же как Fc-фрагменты сорбируется на ДЭАЭ-целлюлозе. Использование градиента ионной силы не позволяет разделить сорбированные на ДЭАЭ-целлюлозе Fab-и Fc-фрагменты IgG крыс.
Разделение Fc- и Fab-фрагментов IgG крыс с помощью аффинной хроматографии на протеин G сефарозе. Профиль аффинной хроматографии смеси Fc- и Fab-фрагментов IgG на протеин^ сефарозе представлен на рис. 4А, состав каждого пика - на рис. 4Б. Получено 2 пика - транзитный и десорбируемый. Транзитный пик был разделен на 2 фракции.
mAU
1----------------1----------------1----------------1---------------Г
0 5 10 15 20 мл
Рис. 4. Очистка Fc-фрагментов методом аффинной хроматографии на протеин G сефарозе.
А - профиль аффинной хроматографии на протеин-G сефарозе. Пунктирной линией указана подача элюирующего буфера. Б - электрофореграмма содержимого пиков, полученных при разделении смеси фрагментов IgG крыс на протеин-G сефарозе. Условные обозначения: М - восстанавливающие условия, S - диссоциирующие условия, H - тяжелые цепи, L -легкие цепи IgG крысы
В 1-й фракции транзитного пика обнаружены Fc-фрагменты IgG крыс, во 2-й фракции транзитного пика присутствует примесь Fab-фрагментов (рис. 4). В десорбируемом пике обнаружены чистые Fab-фрагменты. Присутствие Fab-фрагментов в транзитном пике свидетельствует о том, что небольшая часть Fab-фрагментов не обладает достаточным сродством к протеину G. Несмотря на это, Fc-фрагменты во фракции 1 имеют чистоту 85%. Известно, что протеин G имеет широкую связывающую способность с молекулами IgG разного видового происхождения, при этом способен связываться как с Fab-, так и с Fc-областью IgG [6]. Однако физико-химические свойства и видовые особенности папаиновых фрагментов IgG влияют на их способность связываться с протеином G [5; 6]. Выявленное нами поведение папаиновых фрагментов IgG крыс в отношении протеина G похоже на поведение фрагментов IgG мыши. Показано, что протеин G связывает Fab-фрагменты и низкомолекулярные Fc-фрагменты IgG мыши, но не связывает высокомолекулярные Fc-фрагменты IgG мыши [5]. Таким образом, Fc-фрагменты IgG крыс не сорбируются на протеин G сефарозе, тогда как основная часть Fab-фрагментов связывается с протеином G. Аффинная хроматография на протеин G-сефарозе является эффективным методом разделения папаиновых Fc- и Fab-фрагментов IgG крыс и получения чистых Fc-фрагментов IgG крыс.
Выводы
Fc-фрагменты IgG крыс, полученные методом папаинового протеолиза, сорбируются как на ДЭАЭ-, так и на КМ-целлюлозе. Fab-фрагменты IgG крыс гетерогенны, часть из них не взаимодействует ни с КМ-целлюлозой, ни ДЭАЭ-целлюлозой, другая часть сорбируется как на КМ-, так и ДЭАЭ - целлюлозе. Использование градиента ионной силы при ионообменной хроматографии позволяет изменить соотношение Fc-и Fab-фрагментов IgG крыс в образцах, элюируемых с сорбента, но добиться полного разделения Fab- и Fc-фрагментов и получить чистые Fc-фрагменты, свободные от примесей Fab-фрагментов, не удается. Обнаружено, что Fc-фрагменты IgG крыс, полученные методом папаинового гидролиза, не взаимодействуют с протеином G, тогда как Fab-фрагменты связываются с ним. Аффинная хроматография на протеин G-сефарозе является эффективным методом разделения папаиновых Fc- и Fab-фрагментов IgG крыс и получения чистых Fc-фрагментов IgG крыс.
Работа поддержана грантом ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» «Разработка технологии получения антигенных детерминант на фрагментах иммуноглобулина G для индукции регуляторных антител, подавляющих аутоиммунные реакции», 2012-2013.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Lin H.H., Wang M.X., Spies J.M., Pollard J.D. Effective treatment of experimental autoimmune neuritis with Fc fragment of human immunoglobulin // J. Neuroimmunol. 2007. Vol. 186. P. 133-140.
2. Kayhan B., Aybay C. Fc-dependent monoclonal IgG1-mediated suppression of antibody response // Immunol. Invest. 2004. Vol. 33. P. 367-383.
3. Sedlacek H.H., Ring J., Weinmann E., Guthohrlein G., Kanzy E.J., Gronski P., Seiler F.R. Fc fragments of human IgG may influence allergic reactions // Int. J. Immunopharmacol. 1987. Vol. 9. P. 635-650.
4. Меньшиков И.В., Бедулева Л.В. Применение Fc-фрагментов иммуноглобулина класса G в качестве антигена для лечения ревматоидного артрита, средство и способ лечения. Патент на изобретение № 2385164. 2010.
5. Aybay C. Differential binding characteristics of protein G and protein A for Fc fragments of papain-digested mouse IgG // Immunol Lett. 2003. Vol. 85. P. 231-235.
6. Kato K., Lian L.Y., Barsukov I.L., Derrick J.P., Kim H., Tanaka R., Yoshino A., Shiraishi M., Shimada I., Arata Y. et al. Model for the complex between protein G and an antibody Fc fragment in solution // Structure. 1995. Vol. 3. P. 79-85.
7. Spiegelberg H. L., Weigle W.O. The catabolism of homologous and heterologous 7s gamma globulin fragments // J. Exp Med. 1965. Vol. 121. P. 323-338.
8. Fast J.L, Cordes А.А., Carpenter J.F., Randolph T.W. Physical instability of a therapeutic Fc fusion protein: domain contributions to conformational and colloidal stability // Biochemistry. 2009. Vol. 48. P. 11724-11736.
Поступила в редакцию 01.10.12
A.S. Terentiev, A. Yu. Sidorov, L. V. Beduleva, E. Yu. Stolyarova, I. V. Menshikov Method for obtainig pure rat IgG Fc fragments
Previously, we devised a vaccine for treating patients suffering from rheumatoid arthritis, the active principle of said vaccine was Fc fragments of homologous IgG. We showed the efficiency of said vaccine in the suppression of collagen-directed autoimmune reactions and in the reduction of the arthritis symptoms in the model of collagen-induced arthritis in rats. We discovered that the efficiency of said vaccine depended on the purity of Fc fragments of IgG, which is on the absence of Fab-fragment impurities levelling the effects of the suppression of collagen-directed autoimmune reactions caused by Fc fragments. The intention of the work was to develop methods of effective purification for rat IgG Fc fragments from Fab-fragment impurities. To this effect the comparative analysis on the efficiency between the methods of cation-exchange, anion-exchange and affine chromatographies using protein-G-sepharose was carried out for the purpose to obtain pure rat IgG Fc fragments. Rat IgG Fc fragments obtained by the method of papain proteolysis have been absorbed on both DEAE-cellulose and CM-cellulose. Rat IgG Fc fragments are heterogenous. One part of them interact neither with DEAE-cellulose nor with CM-cellulose, the other part is absorbed both on DEAE-cellulose and on CM-cellulose, The application of ionic strength gradient at ion-exchange chromatography allows to change the ratio of rat IgG Fc/Fab fragments in the samples eluated from the sorbate but we have failed to completely separate Fc and Fab fragments and obtain pure Fc fragments freed from Fab-fragment impurities. We have discovered that rat IgG Fc fragments obtained by the method of papain hydrolysis do not interact with protein G as opposed to Fab fragments which combine with it. Affine chromatography using protein G sepharose is an effective method for the separation of papain Fc- and Fab fragments and obtaining of pure rat IgG Fc fragments.
Keywords: Fc fragments, rat IgG, purification process, protein G, ion-exchange chromatography.
Терентьев Алексей Семенович, инженер E-mail: alts4m@yandex.ru
Сидоров Александр Юрьевич, студент E-mail: aneck4@rambler.ru
Бедулева Любовь Викторовна, доктор биологических наук, профессор E-mail: blv76@mail.ru
Столярова Елена Юрьевна, аспирантка E-mail: shima 12@yandex.ru
Меньшиков Игорь Викторович, доктор биологических наук, профессор E-mail: miv140560@yandex.ru
ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет» 426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)
Terentiev A.S., engineer E-mail: alts4m@yandex.ru
Sidorov A.Yu, student E-mail: aneck4@rambler.ru
Beduleva L.V., doctor of biology, professor E-mail: blv76@mail.ru
Stolyarova E.Yu., postgraduate student E-mail: shima 12@yandex.ru
Menshikov I.V., doctor of biology, professor E-mail: miv140560@yandex.ru
Udmurt State University
426034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1
