Способ определения гексозаминов в слюне Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

© Е. Г. Романенко, И. А. Кленина*

УДК 616-008. 843. 1- 093:547. 454 Е. Г. Романенко, И. А. Кленина*

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕКСОЗАМИНОВ В СЛЮНЕ

ГУ «Днепропетровская медицинская академия МЗ Украины» (г. Днепропетровск) *ГУ« Институт гастроэнтерологии НАМН Украины» (г. Днепропетровск)

Изучение влияния белково-углеводных комплексов смешанной слюны и их компонентов на состояние тканей пародонта у детей проводится согласно плану научно-исследовательской работы кафедры детской стоматологии ГУ «Днепропетровская медицинская академия МЗ Украины» «Разработка и усовершенствование методов диагностики, профилактики и комплексного лечения стоматологических заболеваний у детей», № государственной регистрации 011U002790.

Вступление. Гексозамин (ГА) (Hexosamine) -аминопроизводное сахара гексозы. Существует два наиболее важных вида гексозаминов: это глю-козамин и галактозамин. Аминосахара являются компонентами гликозаминогликанов(ГАГ), гликопротеинов (ГП) и других биологически активных полимеров, входящих в состав различных тканей, крови, молока, слюны и т. д. [1].

ГП - это белково-углеводные комплексы с ковалентно присоединенными углеводными цепями. ГП в полости рта выполняют роль смазочного материала, служат транспортными молекулами для витаминов, липидов, микроэлементов, представляют неспецифическую и специфическую иммунную защиту. За биологическую специфичность ГП (например, иммуноглобулинов) ответственна в основном белковая компонента молекулы, а углеводные цепи участвуют главным образом в формировании и поддержании необходимой конформации молекулы [5].

ГА - «корпусные» моносахара, обеспечивающие присоединение олигосахаридной цепочки к по-липептидному корпусу. Количество ГА определяет зрелость ГП слюны, т. е. способность полноценно защищать слизистую оболочку полости рта от агрессивных факторов, в том числе, адгезии микроорганизмов. В доступной нам литературе мы не встретили метода количественного определения ГА в слюне.

Цель исследования - разработать и апробировать эффективный, точный и простой в исполнении, метод оценки защитных свойств слюны с помощью определения уровня ГА в ней.

За основу предлагаемого нами метода взят известный аналитический метод Morgan и Elson (1933) определения ГА в гидролизатах тканей и сыворотке крови [2].

Принцип метода. Под действием ацетилацетона в щелочной среде ГА превращаются в производные

пиррола, которые дают с п - диметиламинобен-зальдегидом интенсивное красное окрашивание. Субстрат гидролизуют кислотой, ГА ацетилируют ацетилацетоном, обрабатывают щелочью для получения циклического оксазола или пиррола, который связывают с п-диметиламинобензальдегидом для получения окрашенного субстрата, интенсивность окраски которого измеряют. Реактивы: 8 н HCl, 3 н NaOH, ацетилацетоновый реактив (готовится перед употреблением смешиванием 0,2 мл свежеперег-нанного ацетилацетона с 10 мл 0,5 н. Na2C03), реактив Эрлиха - 0,8 г п-диметиламинобензальдегида растворяют в смеси 30 мл 96% етанола и 30 мл концентрированной HCl, 96% этанол.

Ход определения: 1 мл слюны приливают к 2 мл 96% этанола, центрифугируют 10-15 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость сливают. К осадку добавляют 1 мл 8 н HCl. Пробирку закрывают воздушным холодильником (пробкой со вставленной в неё стеклянной трубочкой). Пробирку ставят в штатив и помещают для гидролиза в кипящую баню на 4 часа, после чего гидролизат переносят в мерную пробирку, нейтрализуют 3 н NaOH до слабощелочной реакции на лакмус и доводят дистиллированной водой до 5 мл. К 1 мл нейтрализованного гидролизата (с этого момента вводится контрольная проба, в которую берется соответственно 1 мл дистиллированной воды) добавляют 1 мл ацетилацетонового реактива и прикрытые пробками пробирки ставят на 15 минут в кипящую баню. После охлаждения в пробирки добавляют 2 мл 96%-ного этанола и 0,5 мл реактива Эрлиха, перемешивают, через 30 мин замеряют экстинцию на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр), в кювете с шириной рабочего слоя 1 мм против контроля. Результаты рассчитываются по калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору d-глюкозаминагидрохлорида.

Расчёт производится по формуле (1):

\Ех462,4(мкг/мл), (1)

гдеАЕ- разница между экстинциями опытной и контрольной пробы, найденных при колориметри-ровании; 462,4 - коэффициент пересчета.

Объект и методы исследования. Для апробации метода обследовано 64 ребёнка обоего пола в возрасте от 12 до 17 лет с хроническим генерализованным катаральным гингивитом (ХГКГ) (29 соматически здоровых детей и 35 детей с сопутствующим хроническим гастритом и дуоденитом (ХГД)). Контрольную группу составили 17 соматически здоровых детей со здоровыми тканями пародонта. Слюну собирали утром, натощак, путём сплёвывания в одноразовую пластиковую ёмкость в количестве 2-2,5 мл. ГП из смешанной слюны выделяли 20% раствором сульфосалициловой кислоты и определяли предложенным нами методом. Уровень общих ГП (муцинов) в ротовой жидкости определяли спектрофотометрическим методом с реактивом Фолина [3].

Статистическая обработка данных лабораторных исследований проводилась с использованием лицензионной программы $ТАТ1$Т1СА 6. 1. Определяли среднюю арифметическую величину (М), величину ошибки среднего (т), критерий значимости (1:) Стьюдента, степень достоверности различий (р).

Результаты исследований и их обсуждение. Результаты исследования показали, что среднее содержание ГА в смешанной слюне детей контрольной группы составило 0,55±0,07 ммоль/л, у соматически здоровых детей с ХГКГ 0,45±0,07 ммоль/л, у детей с ХГКГ и фоновой гастродуоденальной патологией - 0,27±0,05 ммоль/л. Снижение уровня ГА - «корпусных» моносахаров, обеспечивающих присоединение олигосахаридной цепочки к поли-пептидному корпусу, свидетельствует о синтезе «незрелых» ГП, так как углеводные цепи участвуют главным образом в формировании и поддержании необходимой конформации молекулы и делают её устойчивой к атакам ферментов микроорганизмов. Уменьшение длины и количества олигосахарид-ных цепочек в молекуле ГП, способствует быстрому разрушению защитного слизистого слоя на поверхности эпителия и адгезии микроорганизмов к поверхности эпителиоцитов [8,9]. Метод позволил выявить у 5 детей с клинически здоровым пародон-том достоверное изменение уровня ГА в смешанной слюне. Предполагаем, что применение биохимического метода определения ГА в смешанной слюне способствует выявлению группы риска среди детей при отсутствии у них клинических изменений в тканях пародонта.

Отмечены достоверно более выраженные изменения уровня ГА в группе детей с ХГКГ и ХГД по сравнению с контрольной группой (р<0,01), что является свидетельством истощения синтеза ГП смешанной слюны на фоне заболевания верхних отделов пищеварительного тракта.

В то же время содержание ГП в смешанной слюне находилось в соответствии с уровнем ГА. Это объясняется тем, что по содержанию одного из компонентов углеводной группы (в данном случае ГА), можно рассчитать количество ГП в смешанной слюне. Такой метод подсчёта имеет недостаточную точность, поэтому предложены новые способы определения ГП [3,4]. Среднее содержание ГП в смешанной слюне детей контрольной группы составило 0,13±0,03 мг/мл, у соматически здоровых детей с ХГКГ 0,07±0,01 мг/мл, (р<0,05) по сравнению с контрольной группой, у детей с ХГКГ и фоновой гастродуоденальной патологией - 0,04±0,00 мг/ мл, (р<0,01) по сравнению с контрольной группой. Очевидно, уменьшение уровня ГП свидетельствует об их ускоренном разрушении при хроническом катаральном гингивите у соматически здоровых детей и об истощении их синтеза у детей с гастродуоденальной патологией. Снижение количества ГА говорит о нарушениях сборки ГП в слюнных и слизистых железах, возникающих при структурных изменениях в клетках эпителия полости рта. Таким образом, уровень ГА является маркером хронической патологии слизистых оболочек полости рта. Учитывая, что иммунная защита полости рта (иммуноглобулины, комплемент, интерферон) представлена веществами гликопротеиновой природы [6,7], считаем, что для оценки барьерных свойств смешанной слюны достаточно проводить исследование уровня ГА, так как это позволяет дать качественную оценку устойчивости ГП к микроорганизмам полости рта.

Выводы. Предложенный нами метод может быть выполнен в условиях биохимической лаборатории. Способ требует малого количества исследуемого материала (1 мл слюны), безболезненный и безопасный для ребёнка. Предложенный способ позволяет прогнозировать возникновение и течение патологии пародонта, проводить контроль эффективности лечения заболеваний десен у детей, в т. ч. и на фоне гастродуоденальной патологии.

Литература

1. Губський Ю. Г. Біологічна хімія / Ю. Г. Губський. - Київ-Тернопіль : «Укрмедкнига», 2000. - С. 270-326.

2. Камышников В. С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике / В. С. Камышников. - «Мед-прессинформ», 2009. - 896 с.

3. Коробейникова Э. Н. Количественное определение содержания белка и муцина (гликопротеинов) в слюне / Э. Н. Ко-

робейникова, Е. И. Ильиных. // Клин. лаб. диагностика - 2001. - №8. - С. 34-35.

4. Романенко Е. Г. Способ определения общих гликопротеинов в слюне / Е. Г. Романенко, И. А. Кленина // Світ біології та

медицини. - 2012. - № 4. - С. 91-93.

5. Тарасенко Л. М. Биохимия органов полости рта : [учеб. пособ.] / Л. М. Тарасенко, К. С. Непорада. - Полтава, 2008. -71 с.

6. Hofman L. F. Human saliva as a diagnostic specimen. / L. F Hofman // J. Nutr. - 2001. - Vol. 131, № 5. - Р 1621 -1625.

7. Humphrey S. P. A review of saliva: Normal composition, flow and function / S. P. Humphrey, R. T. Williamson // J. Prosthet. Dent. - 2001. - Vol. 85, № 2. - P 162-169.

8. Kennedy M. J. Role of motility, chemotaxis, and adhesion in microbial ecology / M. J. Kennedy // Ann. N. Y Acad. Sci. -1987. - Vol. 506, № 8. -P 260-273.

9. Mese H. Salivary secretion, taste and hyposalivation / H. Mese, R. Matsuo // J. Oral Rehabil. - 2007. - Vol. 34, № 10. -P 711-723.

УДК 616-008. 843. 1-093:547. 454

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕКСОЗАМИНОВ В СЛЮНЕ

Романенко Е. Г., Кленина И. А.

Резюме. Представлен метод определения гексозаминов в смешанной слюне. Метод апробирован на 64 детях обоего пола в возрасте от 12 до 17 лет с хроническим генерализованным катаральным гингивитом (29 соматически здоровых детей и 35 детей с сопутствующим хроническим гастритом и дуоденитом). Контрольную группу составили 17 соматически здоровых детей с интактными тканями пародонта. Результаты исследования показали, что среднее содержание гексозаминов в смешанной слюне детей контрольной группы составило 0,55±0,07 ммоль/л, у соматически здоровых детей с хроническим генерализованным катаральным гингивитом 0,45±0,07 ммоль/л, у детей с хроническим генерализованным катаральным гингивитом и фоновой гастродуоденальной патологией - 0,27±0,05 ммоль/л, что свидетельствует о синтезе «незрелых» гликопротеинов , неустойчивых к воздействию микробных ферментов. Предложенный метод позволяет прогнозировать возникновение и течение патологии пародонта, проводить контроль эффективности лечения заболеваний десен у детей, в т. ч. и на фоне гастродуоденальной патологии.

Ключевые слова: гексозамины, гликопротеины, смешанная слюна.

УДК 616-008. 843. 1-093:547. 454

МЕТОД ВИЗНАЧЕННЯ ГЕКСОЗАМІНІВ В СЛИНІ

Романенко О. Г., Кленіна І. А.

Резюме. Представлений метод визначення гексозамінів в змішаній слині. Метод апробований на 64 дітях обох статей у віці від 12 до 17 років з хронічним генералізованим катаральним гінгівітом (29 соматично здорових дітей і 35 дітей із супутнім хронічним гастритом і дуоденітом). Контрольну групу склали 17 соматично здорових дітей з інтактними тканинами пародонта. Результати дослідження показали, що середній вміст гексозамінів в змішаній слині дітей контрольної групи склало 0,55 ± 0,07 ммоль / л, у соматично здорових дітей з хронічним генералізованим катаральним гінгівітом 0,45 ± 0,07 ммоль / л, у дітей з хронічним генералізованим катаральним гінгівітом і фоновой гастродуоденальною патологією - 0,27 ± 0,05 ммоль / л, що свідчить про синтез «незрілих» глікопротеїнів, нестійких до впливу мікробних ферментів. Запропонований метод дозволяє прогнозувати виникнення і перебіг патології пародонта, проводити контроль ефективності лікування захворювань ясен у дітей, в т. ч. й на тлі гастродуоденальної патології.

Ключові слова: гексозаміни, глікопротеїни, змішана слина.

UDC 616-008. 843. 1-093:547. 454

The Method for Determining Hexosamines in Saliva

Romanenko E. G., Klenina I. A.

Summary. A method for determination of hexosamines in mixed saliva. The method was tested on 64 children of both genders, aged from 12 to 17 years with chronic generalized catarrhal gingivitis (29 somatically healthy children and 35 children with concomitant chronic gastritis and duodenitis). The control group consisted of 17 healthy children with somatically intact periodontal tissues. The results showed that the average content hexosamines in mixed saliva of children from the control group was 0,55 ± 0,07 mmol/l, in somatically healthy children with chronic generalized catarrhal gingivitis 0,45 ± 0,07 mmol/l, in children with chronic generalized catarrhal gingivitis and gastroduodenal pathology background - 0,27 ± 0,05 mmol/l. Which vindicates synthesis of the “immature” glycoproteins, resistant to the effects of volatile microbial enzymes. Proposed method allows to predict the occurrence and progression of periodontal diseases, to conduct monitoring of the effectiveness of treatment for gum diseases in children, including those with and against the background of gastroduodenal pathology.

Key words: hexosamines, glycoproteins, mixed saliva.

Стаття надійшла 23. 02. 2013 р.

Рецензент - проф. Каськова Л. Ф.