CC BY
147
БИОЛОГИЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
УДК 616.995.12/-089.87-092.9
СПОСОБ ОБРАБОТКИ ПОЛОСТИ ЭХИНОКОККОВОЙ КИСТЫ
В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Ж. А. Шамсиев
Самаркандский государственный медицинский институт, г. Самарканд
Эхинококкоз — тяжелое паразитарное заболевание, поражающее жизненно важные органы,— представляет серьезную медицинскую проблему. Несмотря на достижения в лечении эхинококкоза, частота его рецидивов составляет 3—54% [1, 3]. Ответственными за послеоперационные рецидивы являются зародышевые элементы эхинококкоза. В связи с этим с целью предупреждения повторных инвазий важное значение играет надежное обезвреживание зародышевых элементов эхинококкоза. Однако многочисленные химические и физические методы обеззараживания зародышевых элементов, предлагавшиеся в различных работах, получили неоднозначную оценку в связи с различной активностью и токсичностью для организма [2, 4].
Нами проведено 96 исследований влияния различных препаратов на жизнеспособность зародышевых элементов эхинококкоза in vitro, при этом учитывались концентрация препарата, его температура и длительность воздействия. Так же выполнена серия опытов in vivo в количестве 120.
Для проведения эксперимента in vivo были использованы крысы породы «Vistar» в возрасте до 3 месяцев в количестве 120 особей; последние были разделены на четыре 102
группы: 1-я группа (30 крыс) — внутрибрю-шинное введение дочерних пузырей; 2-я группа (30 крыс) — внутрибрюшинное введение гидатидозного песка; 3-я группа (30 крыс) — введение зародышевых элементов в подкожную клетчатку; 4-я группа (30 крыс) — контроль.
Нами проведено морфологическое изучение с помощью СЭМ изменений зародышевых элементов эхинококкоза, хитиновой оболочки и фиброзной капсулы под действием глицерина комнатной температуры, 80%-ного глицерина, подогретого до 60°С.
Материалы, полученные интраопераци-онно, подвергались морфологическому исследованию у 286 больных эхинококко-зом печени и легких в возрасте от 1 года до 16 лет.
Цитологические и морфологические методы исследования. В работе применялся электронный микроскоп «Hitachi H-600» (Япония).
Цитологическому исследованию подлежали содержимое кисты, ее стенки, мокрота (при эхинококкозе легких), промывные воды при лаваже бронхов в случаях вскрытия кисты в бронх, желчь, содержимое брюшной полости, плевры (при вскрытии кист в полость). Материал для морфологического исследова-
ния получали на операции, при бронхоскопии, плевральной пункции, дуоденальном зондировании.
Содержимое кисты, мокроту, желчь и др. собирали в стерильную пробирку для посева на стерильность, выделения флоры и определения ее чувствительности к антибиотикам. Остальную часть материала собирали в центрифужную пробирку и центрифугировали. Из осадка приготовляли нативные и окрашенные мазки. Для окраски мазков использовали краску Романовского — Гимза, азур-эозин. Нативные и окрашенные мазки просматривали под микроскопом при малом и большом увеличении. При исследовании можно выявить эхинококковые крючья, обрывки хитиновой оболочки. Иногда при вскрытии кисты в бронх или брюшную полость выделяются фрагменты кутикулярной оболочки — это плотноэластическая ткань белого или желто-белого цвета. Некротически измененная оболочка теряет свою структуру.
Гистологическое исследование оболочек кисты. Кусочки стенки кисты или только кутикулярной оболочки размером 1x1 см фиксировали в нейтральном формалине, жидкости Кануа. Материал для электронно-гистологического исследования фиксировали в глютаровом альдегиде с дофикса-цией четырехокисью осьмия. Материал для гистологического исследования заливали в парафин; срезы толщиной 4—6 мкм окрашивали гематоксилин-эозином, пикрофукси-ном по Ван-Гизону, азур-эозином, реактивом Шифа на нуклеиновые кислоты по методу Браше и Фельгена. Материал для электронно-гистологического исследования заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы после контрастирования просматривали на электронном микроскопе.
Окраски гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону необходимы для изучения струк-
туры тканей паразита. Гистохимические реакции применяли для оценки жизнеспособности возбудителя.
Определение жизнеспособности протосколексов. Определяли процент живых протосколексов от общего числа исследованных, используемых для последующего заражения или других целей. Жизнеспособность протосколексов изучали несколькими методами:
а) протосколексы помещали в 0,1%-ный водный раствор генцианвиолета или толуи-динового синего на 1—2 минуты, затем промывали водой и просматривали под микроскопом. Мертвые протосколексы окрашивались в слабый фиолетовый или синий цвет, а живые не окрашивались;
б) взвесь протосколексов помещали на предметное стекло на нагревательном столике микроскопа при температуре не менее 39°С. Живые протосколексы через 2—3 минуты начинали активно сокращаться;
в) взвесь протосколексов помещали на предметное стекло и вносили в нее 1—2 капли 5—10%-ной желчи животных. Через 2—3 минуты жизнеспособные протосколек-сы выворачивали хоботок и начинали активно двигаться;
г) взвесь протосколексов помещали на предметное стекло, накрывали покровным стеклом, постепенно надавливая на стекло препаровальной иглой и рассматривали под микроскопом при увеличении 10x20. При внимательном рассматривании в области, окружающей корону крючьев инвагиниро-ванных протосколексов, наблюдалось мерцание протонефридиальных (плазменевидных или мерцательных) клеток. Необходимо внимательно просмотреть не менее 50 прото-сколексов. Метод дает самые достоверные результаты выявления жизнеспособности протосколексов и его можно использовать как вспомогательный для определения инва-зионности протосколексов.
Исследования влияния некоторых химико-физических средств на жизнеспособность зародышевых элементов эхинококкоза in vitro. Жизнеспособность зародышевых элементов определяли при микроскопическом исследовании. Признаками гибели протосколексов являлись: набухание, расслоение и нарушение целостности тегумента; выход жидкого содержимого из паренхимы наружу через дефекты тегумента; сглаженность структуры паренхимы; деформация или отпадение (у вывернутых форм) короны крючьев, а признаками гибели аце-фалоцист: снижение тургора кист (вплоть до полного спадения) и нарушение целостности их слоистой оболочки.
В таблице 1 показаны результаты 96 опытов воздействия различных гермицидных препаратов на зародышевые элементы в зависимости от концентрации и времени экспозиции.
Как видно из приведенной таблицы, наиболее сильным гермицидным воздействием обладает глицерин, подогретый до 60°С, а ацефалоцисты эхинококка более устойчивы к губительному воздействию различных препаратов, чем протосколексы паразита. Результаты опытов показали, что во всех испытанных концентрациях глицерин вызвал гибель как протосколексов, так и ацефалоцист
эхинококка. Выраженность деструктивных изменений протосколексов зависела от продолжительности экспозиции с глицерином и срока после окончания его воздействия и не зависела существенно от концентрации глицерина. Так, при воздействии глицерина в 80%-ной концентрации, подогретого до 60°С, в течение 0,5 минуты деструктивные изменения протосколексов, свидетельствовавшие об их гибели, были хорошо различимы при малом увеличении микроскопа уже к моменту окончания обработки глицерином, для ацефалоцист — 2—4 минуты.
Если, как показали опыты, подогревать используемые растворы свыше 60°С, то это приводит к денатурации белков паренхимы печени и оказывает выраженные патологические изменения в тканях.
Анализируя собственные результаты, мы пришли к выводу о том, что, во-первых, глицерин как более густая среда обладает более стойкой термостатичностью, остывает медленнее, обеспечивая должную экспозицию времени обработки. Во-вторых, как соединение с большей молекулярной массой он не способен проникать сквозь толщу фиброзной капсулы и переносить токсические вещества в глубь тканей и в организм. Основываясь на этих выводах, мы отдали предпочтение использованию именно 80%-ного глице-
Таблица 1
Результаты гермицидного действия различных препаратов на зародышевые элементы в зависимости от концентрации и времени экспозиции
Испытуемый агент Концентрация, % Число опытов Экспозиция, губительная для зародышевых элементов, мин.
протосколексы ацефалоцисты
Глицерин, подогретый до 60°С 25 50 80 13 14 14 1 0,5 0,5 6-8 4-5 2-4
Глицерин комнатной температуры 25 50 80 13 14 14 3 3 2 8-10 5-7 4-5
Формалин 2 14 10-15 20-30
рина, подогретого до 60°С в клинической практике.
Характеристика экспериментов in vivo. Для более объективного тестирования губительного действия гермицидных препаратов на зародышевые элементы эхинококка и в особенности на ацефалоцисты была поставлена биологическая проба, основанная на внутрибрюшинной и подкожной имплантации обработанных гермицидными препаратами протосколексов и ацефалоцист молодым крысам обоего пола в возрасте 1—3 мес. Крысе соответствующей опытной группы были имплантированы по 1—5 тыс. протосколексов и выводковые капсулы и от 2 до 5 мелких дочерних пузырей размером 0,3—1,0 см.
Для получения протосколексов жидкость из пузырей и соскоб герминативной оболочки после микроскопических исследований на наличие зрелых протосколексов помещали в цилиндр с коническим дном, и образовавшийся после отстаивания осадок промывали физиологическим раствором хлорида натрия с антибиотиками (500 ЕД/мл пенициллина и 100 ЕД/мл стрептомицина или ка-намицина) до полной прозрачности надоса-дочной жидкости. В приготовленном таким образом инокуляте с известным объемом определяли концентрацию живых протоско-лексов эхинококка. Для этого инокулят равномерно перемешивают на магнитной мешалке со скоростью 100 об/мин, забирают из него 1 мл в шприц с иглой диаметром 0,3 мм. Из шприца сразу же наносят на предметное стекло 3—10 капель инокулята и при малом увеличении микроскопа подсчитывают в каждой капле число живых протосколексов.
Определив среднее число зрелых про-тосколексов в 1 капле инокулята и среднее число капель в 1 мл инокулята, вычисляется среднее количество протосколексов в 1 мл инокулята. Затем при равномерном перемешивании инокулята забирается из него тем
же шприцем по 0,5—1 мл и вводится в брюшную полость или под кожу животным реципиентам, соблюдая условия асептики.
Методика заражения крыс пункци-онным способом. При внутрибрюшинном заражении животное фиксируют в области шеи и хвоста положением головой вниз, чтобы кишечник переместился к диафрагме. В левой нижней трети живота обрабатывают инъекционное поле 70%-ным этиловым спиртом и с помощью шприца с иглой диаметром 0,8 мм делают прокол кожи, держа иглу под острым углом, затем переводят шприц в положение, перпендикулярное брюшной стенке. Толчкообразным движением прокалывают брюшину и вводят содержимое шприца — жидкость эхинококка с гида-тидозным песком, содержащим зародышевые элементы.
Методика имплантирования мелких дочерних пузырей. Крыса фиксируется на операционном столике животом вверх, с передней брюшной стенки сбривается шерсть. Операционное поле обрабатывается йодом со спиртом дважды, затем крысе дается эфирный наркоз, после общей анестезии производится разрез кожи передней брюшной стенки длиной до 1—2 см, рана вскрывается до брюшной стенки. По вскрытии брюшной полости последней вводится инвазивный материал (мелкие дочерние пузыри). В брюшную полость также добавляются антибиотики — пенициллин (500 ЕД), рана послойно ушивается. Туалет раны с обработкой 3%-ным йодом.
Результаты внутрибрюшинного заражения крыс породы «Vistar» зародышевыми элементами эхинококкоза.
Как известно из обширной литературы, существует вероятность заражения эхинокок-козом при контактном переносе некоторых элементов эхинококкового паразита на соседние участки во время операции. В этой связи нами предпринято изучение вероят-
ности заражения эхинококкозом контактным способом в зависимости от вида элементов паразита.
Для проведения эксперимента были использованы крысы породы «Vistar» в возрасте до 3 месяцев в количестве 120 особей; последние были разделены на четыре группы: 1-я группа (30 крыс) — внутрибрюшин-ное введение дочерних пузырей; 2-я группа (30 крыс) — внутрибрюшинное введение ги-датидозного песка; 3-я группа (30 крыс) — введение зародышевых элементов в подкожную клетчатку; 4-я группа (30 крыс) — контроль.
Данные, приведенные в таблице 2, крыс 1-й группы показывают, что в контрольной группе 8 из 10 экспериментальных животных заражаются от внутрибрюшинного введения дочерних пузырей. Даже обработка неподо-гретым глицерином приводит к заражению в 3 случаях из 10. А при обработке формали-
ном заражение произошло в половине случаев. Из этого следует, что при попадании дочерних пузырей в брюшную полость во время эхинококкэктомии при недостаточном соблюдении изоляции операционного поля возможна контактная имплантация эхинококкового паразита.
В сообщениях различных авторов прослеживается неоднозначность мнений в отношении контагиозности гидатидозного песка при выполнении эхинококкэктомии. Данные 2-й группы крыс демонстрируют способность гидатидозного песка вызывать контактный эхинококкоз брюшной полости.
Судя по данным таблицы, необработанные элементы гидатидозного песка, содержащие зародышевые элементы, способны внедриться в брюшную полость и вызвать развитие эхинококкоза брюшной полости. Это обстоятельство доказывает опасность излития пескосодержащей гидатидозной
Группы экспериментов Гермицидные средства
80%-ный глицерин комнатной температуры (П=30) 80%-ный глицерин, подогретый до 60°С (П=30) формалин 2% (П=30) контрольные крысы без обработки (П=30)
число зараженных крыс число заболевших крыс число зараженных крыс число заболевших крыс число зараженных крыс число заболевших крыс число зараженных крыс число заболевших крыс
Внутрибрюшин-ное введение дочерних пузырей 10 3 (30%) 10 0 10 5 10 8 (80%)
Внутрибрюшин-ное введение гидатидозного песка 10 3 (30%) 10 0 10 5 (50%) 10 8 (80%)
Введение зародышевых элементов в подкожную клетчатку 10 2 (20%) 10 0 10 5 (50%) 10 7 (70%)
Всего 30 8 (26,67%) 30 0 30 15 (50%) 30 23 (76,67%)
Таблица 2
Результаты заражаемости крыс породы «Vistar» при внутрибрюшинном введении дочерних пузырей, гидатидозного песка, а также подкожной имплантации зародышевых элементов
эхинококка
жидкости из полости паразита в брюшную полость.
Такие же данные получены при введении экспериментальным животным гидатидозно-го песка в подкожную клетчатку (крысы 3-й группы). Эти данные подтверждают способность зародышевых элементов внедряться в любые ткани при несоблюдении должных правил обкладывания операционного поля при эхинококкэктомии.
Таким образом, на основании проведенных опытов нами доказано, что внедрение зародышевых элементов в любые ткани контактным способом может произойти при несоблюдении должных предосторожностей во время выполнения эхинококкэктомии. Это относится как к дочерним пузырям, так и к гидатидозному песку, содержащему зародышевые элементы.
Обработка остаточной полости паразита оптимальна при использовании 80%-ного глицерина, подогретого до 60°С.
Нами проведено морфологическое изучение с помощью СЭМ изменений зародышевых элементов эхинококкоза, хитиновой оболочки и фиброзной капсулы под действием глицерина комнатной температуры, 80%-ного глицерина, подогретого до 60°С.
Материалы, полученные интраопера-ционно, подвергались морфологическому исследованию у 286 больных в возрасте от 1 года до 16 лет.
Светооптические исследования степени изменений ларвоцисты и прилежащих к фиброзной капсуле тканей показали, что после воздействия глицерином комнатной температуры на полость ларвоцисты печени имело место разрушение хитиновой оболочки c лизисом герминативного слоя (рис. 1).
При обработке 80%-ным глицерином комнатной температуры полости ларвоцис-ты при эхинококкозе легкого также отмеча-
лось расслоение хитиновой оболочки и частичное расслоение фиброзной оболочки, при этом герминативный слой хитиновой оболочки подвергался деструкции и в ряде случаев не определялся, что говорит о его частичном лизисе.
Рис. 1. Нарушение целостности хитиновой оболочки вблизи герминативного слоя. Ларвоциста печени. Обработка глицерином комнатной температуры.
Г-Э 10x10
Помимо влияния на хитиновую оболочку, глицерин комнатной температуры вызывал выраженные изменения формы большинства зародышевых элементов, что выражалось в появлении на их поверхности углублений, эрозий, вплоть до полного разрушения фрагментов выводковых капсул.
Влияние глицерина комнатной температуры на фиброзную капсулу было минимальным и выражалось в расслоении прилежащих к хитиновой оболочке слоев капсулы.
Проведенные нами с помощью СЭМ ультраструктурные исследования показали, что под воздействием глицерина комнатной температуры происходили выраженные изменения большинства протосколексов, как расположенных на остатках герминативной оболочки, так и плавающих свободно в гидати-дозной жидкости. Характер этих изменений указывает на их необратимость и свидетельствует о гибели большинства зародышевых
элементов. Фиброзная капсула подвергалась незначительным изменениям, причем характер изменений при использовании данного способа обработки полости ларвоцисты, как при эхинококкозе печени, так и легкого, стереотипен.
Обработка полости ларвоцисты при эхи-нококкозе печени 80%-ным глицерином, подогретым до 60°С, вызывала более существенные повреждения хитиновой оболочки с ее расслоением и полным разрушением герминативного слоя (рис. 2).
Рис. 2. Лизис герминативного слоя, деструкция хитиновой оболочки ларвоцисты при обработке ее полости глицерином, подогретым до 60°С. Г-Э 10x10
Обработка полости ларвоцисты глицерином, подогретым до 60°С, при эхинококкозе легкого вызывала такие же изменения как в хитиновой оболочке, так и в печени.
На сохранившихся фрагментах герминативного слоя хитиновой оболочки определялись зародышевые элементы и эритроциты, причем многие из них представляли собой патологические формы (рис. 3).
Обработка глицерином, подогретым до 60°С, вызывала более выраженные структурные изменения зародышевых элементов в сравнении с обработкой глицерином комнатной температуры. На поверхности выводковых капсул, изредка встречающихся на фрагментах хитиновой оболочки, определя-
лись многочисленные углубления, эрозии и другие изменения, вызывающие нарушения ее целостности и характерной формы.
Гь
Рис 3. Лизис хитиновой оболочки зародышевой капсулы и патологические формы эритроцитов при обработке полости ларвоцисты глицерином, подогретым до 60°С.
СЭМх1000
Фиброзная капсула как при эхинококко-зе печени, так и легких после обработки полости ларвоцисты глицерином, подогретым до 60°С, подвергалась расслоению, но без выраженных изменений деструктивного характера. Между расслоившимися структурами располагались эритроциты и клетки соединительной ткани.
Таким образом, нами доказано, что при обработке глицерином, подогретым до 60°С, отмечаются более выраженные деструктивные изменения хитиновой оболочки и особенно ее зародышевого слоя, чем при обработке глицерином комнатной температуры. Часто зародышевый слой не определяется, а на поверхности хитиновой оболочки располагаются многочисленные эритроциты, большинство из которых представляют собой патологические формы.
Обработка глицерином, подогретым до 60°С, также вызывает более выраженные структурные изменения зародышевых элементов как ларвоцисты печени, так и легких. Фиброзная капсула также подвергается не-
значительно выраженному расслоению, но при этом не определяются деструктивные повреждения.
Воздействие глицерином, подогретым до 60°С, на полость ларвоцисты не вызывало существенных деструктивных изменений прилежащей к фиброзной капсуле ткани печени.
На внутренней поверхности полости ларвоцисты определяются остатки хитиновой оболочки и разрушенные фрагменты зародышевых элементов.
Эти изменения одинаковы как при эхи-нококкозе печени, так и легких.
Обработка полости ларвоцисты глицерином приводит к нарушению целостности вплоть до полного разрушения герминативного слоя.
Таким образом, проведенные морфологические исследования позволяют полагать, что воздействие глицерином приводит к структурным нарушениям зародышевых элементов эхинококка, что свидетельствует о их гибели на организменном уровне.
Наши исследования показали, что обработка полости ларвоцисты глицерином приводит к существенным изменениям герминативной оболочки и зародышевых элементов, хитиновой оболочки и незначительным изменениям фиброзной капсулы.
Более выраженные изменения, которые отмечаются при обработке полости ларво-цисты глицерином, подогретым до 60°С, свидетельствуют о полной деструкции как хитиновой оболочки, так и ее зародышевых элементов, что говорит об утрате их фертиль-ности.
Изменения в фиброзной капсуле указывают на то, что глицерин, проникая в структуры фиброзной капсулы, оказывает антипаразитарное воздействие на зародышевые элементы.
Наши исследования показали, что при комплексной обработке полости ларвоцисты глицерином, подогретым до 60°С, полости
кисты вызывают структурные изменения всех элементов в наибольшей степени выраженности. Эти изменения заключаются в полной деструкции всех зародышевых элементов. Полному разрушению подвергается как сама герминативная оболочка, так и хитиновая оболочка в целом.
Существенные изменения отмечены и со стороны фиброзной капсулы. Она подвергается расслоению и фрагментации. Несмотря на наличие выраженных структурных изменений в фиброзной капсуле, при комплексном воздействии ее архитектоника в целом сохраняется. При этом среди волоконных компонентов фиброзной капсулы определяются эритроциты, что свидетельствует о повреждающем воздействии глицерина и ультразвука.
Проведенные нами гистоморфологиче-ские исследования показали, что при обработке полости ларвоцисты глицерином как комнатной температуры, так и подогретым до 60°С, деструктивных изменений тканей печени и легких, непосредственно прилежащих к фиброзной капсуле, не образуется.
Таким образом, проведенные нами экспериментальные и гистоморфологические исследования влияния различных химико-физических методов воздействия на ларвоцисту и ее элементы доказали, что наиболее эффективным и безопасным способом является обработка 80%-ным глицерином, подогретым до 60°С. Наши исследования дают основание рекомендовать использовать разработанный метод для широкого клинического применения.
Библиографический список
1. Абдримов Е. Г. Обезвреживание зародышевых элементов эхинококкоза ультразву-ком/Е. Г. Абдримов, С. А. Алмодин, У. И. Мука-шев//Эхинококкоз и очаговые поражения паренхиматозных органов человека: тез.
докл. науч.-практ. конф.—Шымкент, 1998.— С. 6—7.
2. Ахмедов И. Г. Отдаленные результаты хирургического лечения эхинококкоза печени: автореф. дис. ... канд. мед. наук/И. Г. Ахмедов.— Махачкала, 2000.— 23 с.
3. Кенжаев М. Г. Оптимизация диагностики, хирургического лечения эхинококкоза и меры профилактики его рецидива: авто-реф. дис. ... д-ра мед. наук/М Г. Кенжаев,— Бишкек, 2002.— 33 с.
4. Пулатов А. Т. Эхинококкоз в детском возрасте/А. Т. Пулатов.— М.: Медицина, 2004.— 221 с.
Zh. A. Shamsiev
METHOD OF ECHINOCOCCAL CYST CAVITY TREATMENT IN EXPERIMENT
Ninety six investigations of the effect of different preparations on viability of embryonal elements of echinococcosis in vitro were fulfilled. The concentration of preparation, its temperature and duration of effect
were taken into account. To perform the experiment in vivo, 120 «Wistar» rats were used. Morphological investigation of changes in embryonal elements of echinococcosis, chitinous membrane and fibrous capsule under the effect of glycerol of room temperature and glycerol heated to 60° C was carried out. The experimental and histomor-phological investigations studying the influence of different chemicophysical methods of effect on larvocyst and its elements confirmed that the most effective and safe method is treatment with 80% glycerol heated to 60° C.
Keywords: embryonal elements of echino-coccus, residual cavity.
Контактная информация: Шамсиев Жамшид Азаматович, кандидат мед. наук, зав. курсом детской хирургии факультета усовершенствования врачей Самаркандского медицинского университета, Узбекистан, 140100, г. Самарканд, ул. М. Улугбека, 70а, тел. 8 (366) 233-29-65
Материал поступил в редакцию 10.09.2008
