CC BY
34
Кобзев Г.И.
Оренбургский государственный университет
СПИНОВЫЕ ЭФФЕКТЫ В ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЯХ ОКИСЛЕНИЯ
СУБСТРАТОВ КИСЛОРОДОМ
На основе неэмпирических и полуэмпирических расчетов обсуждаются изменения электронных и спиновых характеристик в модельных комплексах кислород - субстрат, кислород - флавиновый кофермент. Показано, что при сближении кислорода с партнером возникают стационарные точки, в которых увеличена вероятность образования синглетного кислорода. При этом происходит изменение геометрических параметров систем и миграция локальных спиновых плотностей между атомами в молекулах, что может обеспечивать специфичность реакции и частичную активацию молекулярного кислорода.
Изучение ферментативной реакции предполагает выяснение отдельных стадий реакции, идентификацию аминокислот, участвующих в связывании субстрата и в реакциях образования или разрыва связей, определение относительного пространственного расположения этих аминокислот, разработку гипотетического механизма реакции, позволяющего объяснить порядок скорости реакции [1].
Изучение механизма реакции требует выяснения структуры переходного состояния, природы промежуточных продуктов и построения сечения ППЭ. Важно отметить, что структура переходного состояния ферментативной реакции зависит не только от геометрии молекулы субстрата, но и - трехмерной конформации фермента, поскольку несколько функциональных групп, расположенных в разных частях фермента, могут определять специфичность и высокую эффективность каталитического процесса [2]. Большие размеры ферментов и сложность каталитических процессов не позволяют в настоящее время полностью решить перечисленные задачи и зачастую - построить структуру переходного состояния.
Молекулы субстрата, участвующие в большинстве ферментативных реакций, имеют малые размеры по сравнению с молекулами фермента. Считают, что при образовании фермент-субстрат-ного комплекса можно выделить активный центр фермента, включающий в себя некоторые боковые цепи и пептидные связи, находящиеся в непосредственном контакте с молекулой субстрата (возможно, при посредстве молекул воды), а также боковые цепи и пептидные связи, не имеющие прямого контакта с субстратом, но тем не менее принимающие непосредственное участие в каталитическом акте. Остальная часть полипептидной цепи обеспечивает жесткое взаимное расположение отдельных компонентов активного центра в пространстве, которое необходимо для осуществления специфической каталитической реакции [3]. Изменения структурной основы, например кон-
формационные изменения белковой части фермента под влиянием денатурирующих факторов (тепло, мочевина, органические растворители), очень часто приводят к резкому изменению каталитической активности. Допускается также, что какая-то часть молекулы фермента не принимает участия в каталитическом процессе.
Многочисленные исследования в данной области позволяют полагать, что специфичность фермента и его способность катализировать реакции разрыва и образования связей зависит от разных, но группирующихся около субстрата аминокислотных остатков. Однако даже выявление аминокислот, принимающих участие в каталитическом процессе, не может объяснить, почему в некоторых случаях ферментативные реакции приводят к инактивации фермента - блокируются ли реакционные центры групп активного центра или конформация группы аминокислотного остатка полипептидной цепи в каком-то другом месте каркаса белковой молекулы приводит к потере каталитических свойств фермента.
Ни для одного из ферментов не удалось пока выяснить пространственного расположения аминокислот, входящих в активный центр. Неизвестно даже, специфична ли трехмерная конформация аминокислот активного центра в отсутствие субстрата и соответствует ли данная конформация каталитической активности [3].
Гипотеза «ключа и замка» Фишера не находится в противовесе с «теорией индуцированного соответствия» Кошланда [3], согласно постулатам которой:
а) присоединение субстрата к активному центру вызывает значительные изменения в геометрии белка;
б) для действия фермента необходима точная ориентация каталитических групп;
в) субстрат индуцирует эту требуемую ориентацию, изменяя геометрию белка.
Единство обеих теорий обеспечивается тем, что при связывании субстрата межмолекуляр-
ные обменные взаимодействия вызывают нужную переориентацию фрагментов белковой части, обеспечивая жесткую конформацию, обладающую каталитической активностью, изменение которой может привести к потере каталитических свойств фермента.
Небольшую небелковую простетическую группу, более или менее прочно связанную с белковой частью двух или более ферментов, необходимую для более эффективного каталитического действия и благодаря которой может происходить перенос групп, обычно называют коферментом. В ферментативных реакциях различия между субстратом и коферментом не всегда ясны, поскольку кофермент в процессе связывания может претерпевать структурные изменения, как и субстрат, но в ходе дальнейших реакций восстанавливает свою структуру. Кроме того, во многих кофермент-зависимых реакциях субстрат-ферментативному взаимодействию обязательно предшествует связывание кофермента с ферментом [3]. Большинство ко-ферментов играют роль промежуточных переносчиков в реакциях переноса групп. Из пиридиновых нуклеотидов, выполняющих роль ко-ферментов, можно отметить такие, как никоти-намидадениндинуклеотид (НАД) (старое название Ко1), никотинамидадениндинуклеотидфос-фат (НАДФ) (старое название Ко11).
НАД и НАДФ в качестве коферментов участвуют во многих окислительно-восстановительных реакциях, катализируемых дегидрогеназами. Восстановление НАД+ в НАД^Н сопровождается заметным изменением спектральных характеристик кофермента (поглощение 260 нм значительно уменьшается, появляется новый максимум при 320 нм, характерный для дигид-роникотинамида). В реакциях окисления - восстановления принимает участие никотинамид-ный фрагмент этих коферментов. Установлено, что восстановление происходит в определенное положение [4]. Эксперименты по восстановлению НАД в присутствии ферментов АДГ (ал-когольдегидрогеназа) и ЛДГ (лактатдегидроге-наза) показали, что между субстратом и коферментом происходит прямой перенос водорода, при этом затрагивается один и тот же участок молекулы НАД (А-форма).
К флавиновым коферментам относят рибофлавин, который представляет собой замещенный изоаллоксазин, связанный с Б-риби-толом. В 1938 г. Варбургом было обнаружено, что фермент, катализирующий окисление
D-аминокислот молекулярным кислородом (оксидаза D-аминокислот), является флавопро-теидом и содержит в качестве простетической группы новый кофермент, названный флави-надениндинуклеотид (ФАД). Число известных флавопротеидов, использующих в качестве кофермента ФАД, достаточно велико, и такие ферменты широко распространены в природе. Флавопротеиды катализируют реакции дегидрирования. Типичными субстратами для них служат пиридиновые нуклеотиды, а-оксикис-лоты, альдегиды, а также соединения, содержащие насыщенные углерод-углеродные связи (эти соединения превращаются в олефины). Каждый флавопротеид принимает электроны от окисляемого субстрата и переносит электроны к другому субстрату - окислителю. В процессе окисления изоаллоксазиновая циклическая система соответствующего кофермен-та ФАД претерпевает восстановление, а субстрат из восстановленной формы переходит в окисленную. Восстановленные формы флавоп-ротеидов сами в свою очередь становятся субстратами в реакциях с другими акцепторами электронов (такими, как метиленовый синий, индофенол, феназин, молекулярный кислород), благодаря чему окисленная форма кофер-мента регенерирует [5].
Окисление углеводородов, белков, липидов является экзотермическим, но запрещающим по спину процессом и сопровождается отщеплением атомов водорода или электронов от пищевых субстратов [6].
Сложнейший ферментативный процесс включает в себя множество стадий, в которых участвуют различные по своим электронным и спиновым свойствам вещества. Акцепторами электронов и протонов могут выступать ци-тохромы, коферменты, кислород, которые работают сопряженно с другими ферментами дегидрогеназ, включающими NADF и NAD в качестве кофермента. FAD представляет собой сложное соединение, включающее длинную цепь НСОН групп, а также объемные фосфатные группы, занимающие достаточно много места в белковой оболочке фермента (рис. 1).
Стерические напряжения при взаимодействии с окружающими аминокислотами и молекулами воды не могут повлиять на пространственную структуру этих цепей, что проверено модельными расчетами [7], поэтому кофермент можно моделировать наиболее значимой частью активного центра - люмифлавином, включающим изо-
аллоксазиновое кольцо флавина, а фермент - белковой частью протонированного И18516+.
Оксидазы являются самыми простыми из флавопротеидов; в них полностью восстановленная форма ФАДН2 окисляется кислородом с образованием Н2О2 (см. реакцию (1)). Механизм действия глюкозооксидазы рассмотрен недавно в работах [8, 9]. В флавиновом ферменте молекула О2 после присоединения электрона (как правило, от молекулы ФАДН2) превращается в супероксид-ион О2- и тем самым активируется [8-10]:
ФАДН + О2® [ФАДН2 - О2]® ®[ФАДН2+.. ,О2-]® ФАДН2+ + О2- (4)
Известно, что (4) представляет собой медленную стадию, за которой обычно следуют процессы переноса протонов и второго электрона с участием белка и полуокисленного радикала ФАДН2+- [2,11,12]:
07 + Н+® Н02, (5)
НО2 +Н+ + е ® Н2О2
(6)
Полагают [2, 11], что спиновый запрет для ферментативных реакций с участием триплетного молекулярного кислорода (4)-(6) снимается за счет последовательного добавления одиночных электронов. При этом предполагают, что преодоление запрета по спину в реакциях (4)-(6) происходит за счет появления первых радикалов (4) по аналогии с радикально-цепным окислением, где спиновый запрет может быть снят в дублетном канале.
Минаев Б.Ф. [7] отметил глубокую разницу между радикальными реакциями (4)-(6) в окси-дазах и радикальными цепными процессами окисления (горения). По мнению автора, в последнем случае радикалы уходят в объем раствора (или в объем плазмы пламени) и теряют «спиновую память» о своих предшественниках. В
ферментативных реакциях (4)-(б) в оксидазах кислород и переносчики зарядов (ФАД и ФАДН2) прочно связаны с белками внутри активного центра фермента. При переносе кислорода гемоглобином молекула O2 поступает через клеточные мембраны в определенные позиции, определяемые электростатическими потенциалами молекул воды, белковых фрагментов и изоаллоксазиновой частью фермента ФАД. Передавая электроны и протоны во время протекания реакций (4)-(б), реагенты только колеблются [7-9] относительно закрепленных позиций внутри активного центра. (Сюда же относится и заторможенное внутреннее вращение O2- в полости белков.) Таким образом, при переносе электронов от FAD Н 2 к O2 радикалы не уходят в объем клетки и спины электрона остаются коррелированными, т. е. комплекс, в котором сформировался O2-, также остается триплетным, что можно схематично изобразить в виде [7]
тТ4
\TTreg
IFADH2'1'.. + O2rng ]3 FaDH2' ...O2
т+Т /-4-Tpg
COB
adh+t ....+O-i
(7)
Экспериментальные исследования Клин-ман показали, что лимитирующей стадией процессов (4)-(6) является перенос не тяжелой частицы - протона, а легкой частицы - электрона [11]. Объяснение парадокса предложено Минаевым, который указал на необходимость переворота спина в супероксиде для формирования синглетного состояния бимолекулярного комплекса 1 [раэн+т.... + о-^] за счет сильного спин-орбитального взаимодействия. Величина рассчитанного матричного элемента СОВ равна <3РП |Ы8о|1РП> = 0,01эВ [7-9]. После медленного процесса - переворота спина в супероксид-анионе реакция будет разрешена по спину, и пероксид водорода (см. реакцию (6)) покинет активный центр оксидазы, а дальнейшее его восстановление до воды является разрешенным по спину процессом.
Следует заметить, что механизм снятия спинового запрета при каталитическом окислении (4)-(6) может быть объяснен не только переворотом спина в супероксид-анионе, но и возникновением специфических спиновых состояний молекулы кислорода при ее определенных позициях относительно фермента и субстрата [13].
В работах [14, 15] показано, что под влиянием окружения переход а (1Д8)® х(3 £ g), ответственный за дезактивацию кислорода, усиливается и заимствует свою интенсивность из инду-
3
цированного в процессе столкновения электро-дипольного перехода ь (1Е+)® а(1 Дg). Следовательно, молекулы, окружающие кислород, могут распределяться в такие позиции, когда не только дезактивация, но и активация кислорода будет облегчена [16]. В работах [17-21] проанализирована зависимость М(Ь-а) от набора возбужденных конфигураций, учитываемых методом конфигурационного взаимодействия (КВ) в кислороде, сенсибилизаторе и молекуле растворителя для би- и тримолекулярных кислородных комплексов. Важным результатом для тройных комплексов столкновения О2+М+Э (Э - этилен, М = Н2, К2, КН3, СО2, Н2О, СН3ОН, СС14) является значительная зависимость величин М(Ь-а) и М(а-Х) от эффектов обменной электронной корреляции в кислороде. Возбуждения только в кислороде для двойных и тройных комплексов приводят к возрастанию М(Ь-а). Дополнительный учет возбужденных состояний в этилене, в молекуле растворителя (расширение КВ) компенсирует это увеличение и даже уменьшает величину М(Ь-а), полученную на основе расчета методом самосогласованного поля (ССП) без учета электронной корреляции (МЬассп). Таким образом, возрастание величины М(Ь-а) при учете обменных взаимодействий и электронной корреляции (в полимолекулярных кислородных комплексах для заданных фиксированных меж-молекулярных расстояний) может обеспечиваться только расширением КВ в молекуле кислорода [22]. Кроме того, возбуждения в кислороде, в процессе сближения этилена и молекулы, приводят к индуцированию не только М(Ь - а), но и к излучению в темновую компоненту состояния а’, то есть к индуцированию электродипольно-го перехода М(Ь-а’) и, следовательно, к индуцированию темновой компоненты синглет-трип-летного перехода (а’-Х). Возбуждения же в этилене при сближении С2Н4 и М полностью гасят М(Ь-а’) темновую компоненту (а’-Х) и стабилизируют значения М(Ь - а). Отсюда со всей очевидностью следует, что максимальное значение М(Ь-а) будет возникать в определенных межмо-лекулярных позициях, для которых обменнокорреляционный потенциал минимален для системы, но максимален для кислорода, что равносильно большому КВ в кислороде [23]. В расчетах больших кислородсодержащих систем (например, при моделировании ферментативных реакций, включающих кислород) это будет проявляться в стационарных точках, соответствую-
щих специфическому расположению фрагментов, в которых обменно-корреляционный потенциал будет максимален и связан с О2(Х31Л), в то время как на отдельных фрагментах его величина останется небольшой. В таких точках величина М(Ь-а) будет максимальной из всех возможных и генерация а(1Ав) в процессе перехода Х(3Ев'1)?а(1 Дв) будет облегчена. Что же это за стационарные точки и какова в них полная электронная энергия? При изменении координации молекулы кислорода относительно фрагментов разные возбужденные конфигурации обеспечивают вклад в полную энергию системы. Поэтому вновь возникнет стационарная точка (новые фиксированные межмолекулярные расстояния) в которой обменно-корреляционный потенциал будет максимален и связан с О2(Х31Л). Из всех возможных координаций кислорода (с соответствующими этому случаю фиксированными межмолекулярными расстояниями до фрагментов) только одна точка будет соответствовать минимуму полной энергии системы. Таким образом, в точке минимума энергии системы величина М(Ь-а) будет максимальной из всех возможных и генерация а(1Ав) в процессе перехода х(3 £ -0]® а(1 Дg) будет облегчена.
Следовательно, наряду с механизмом Минаева возможен механизм изменения спинового состояния триплетного кислорода (частичное снятие спинового запрета), в котором М(Ь-а) и хТ £ g 0)® а(1 Дg) играют исключительную роль. О незначительной величине обменно-корреляционного потенциала на фрагментах можно судить по индуцированию спиновой плотности на атомах, которая суммарно будет компенсироваться. С другой стороны, обменнокорреляционный потенциал всей суперсистемы можно рассчитать. В процессе межмолекуляр-ного сближения фрагментов уже на значительных расстояниях будет происходить индуцирование взаимокомпенсируемой спиновой плотности на атомах молекул фрагментов, перераспределение спиновой плотности на атомах кислорода молекулы О2 и, возможно, ее просачивание на атомы соседних молекул. Этот результат будет свидетельствовать об эффекте активации молекулярного кислорода и индуцировании локальных магнитных областей ферромагнитного порядка на партнерах. Роль электронного спина в биохимических реакциях известна с 1937 года, когда Полинг обнаружил, что увеличение рН раствора уменьшает магнит-
ный момент гемопротеинов. Эффект был объяснен переворотом спина иона железа за счет небольших изменений в координации лигандов. Важно отметить, что причиной изменения спиновой плотности на локальных частях суперсистемы является изменение обменных взаимодействий внутри систем под влиянием партнеров (в частности, кислорода) при различном расположении фрагментов относительно друг друга. Теория распаривания спина в молекулах в процессе радикальных химических реакций освещается в работах Бучаченко А.Л. [24, 25]. O перераспределении спиновой плотности в синглетных кислородных комплексах говорится в работах Шека [25].
Для подтверждения выдвинутых предположений методами квантовой химии проведены полуэмпирические и неэмпирические расчеты электронных, энергетических и магнитных характеристик окисленной и восстановленной формы люмифлавина, выступающего в качестве модели FAD как активного центра глюкозооксидазы ^O), протонированного гистидина His51^ и исследованы механизмы активации кислорода в бимолекулярных комплексах ;![His+ - Ю2]+ и З[Люмифлавин - O2]. Pас-четы электронных, спиновых характеристик для выбранных межмолекулярных расстояний R1 и R2 проведены в приближении CNDO, INDO, PМ3, а также методом функционала плотности DFT и Ab initio с использованием базиса STO - 3G.
1. Расчеты электронных и спиновых
характеристик окисленного
и восстановленного люмифлавина
Геометрические и электронные характеристики в восстановленном и окисленном лю-мифлавине изображены на рисунках 2-5.
Сравнительные характеристики электронной энергии приведены в таблице 1. Величины полной электронной энергии, полученные полуэмпи-рическими методами CNDO, INDO PM3 и Ab initio в базисе STO^G, а также методом функционала плотности (DFT) с обменно-корреляционным потенциалом ВЗ-LYP, значительно различаются.
Учет корреляционной энергии в неэмпирических расчетах по Moller-Plesseta ^P2) приводит к еще большим различиям. Oднако синг-лет-триплетное (S-T) расщепление в расчетах аb initio и DFT с учетом МP2 практически совпадают и равны -26.82 ккал/моль и -25.58 ккал/ моль соответственно (табл. 1).
восстановленного люмифлавина, рассчитанные методом PМ3 в рамках неограниченного метода Xартри-Фока (HXФ)
люмифлавина, рассчитанные методом PМ3 в рамках HXФ /н
/1.03
о
Рисунок 4. Длины связей в изоаллоксазиновом ядре окисленного люмифлавина, рассчитанные методом РМ3 в рамках НХФ
0,07
Рисунок 5. Заряды на атоме, единица заряда электрона в окисленном люмифлавине, рассчитанные методом РМ3 в рамках НХФ
Pаcчеты PM3, INDO, DFT без учета MP2 дают близкие значения S-T расщепления, равные -57.7i; -56.26; -53.49 ккал/моль соответственно.
Согласно расчетам PM3 и аb initio спиновая плотность на атомах окисленного люмиф-лавина в триплетном состоянии делокализо-вана на атомах углерода изоаллоксазиново-го кольца, при этом на атомах азота Ni и N5 наблюдается большая по модулю спиновая плотность. Mетoдoм аb initio получены следующие значения спиновой плотности: p(N5) = 1,17; p(Ni) = i,073. На остальных атомах спиновая плотность взаимно компенсируется вследствие возникновения индуктивного спинового эффекта в ароматическом кольце люмифлавина.
Спиновая плотность на атомах кислорода о11, Oi2 изоаллоксазинового кольца остается положительна и примерно равна О.б за счет спин-поляризации с соседними атомами углерода С2 и С4 соответственно.
Заряды на этих атомах кислорода, рассчитанные методами DFT и аb initio, совпадают q(Oii) = q (Oi2)= - 0.2e.
Pаcчеты, проведенные нами, подтверждают ранее предложенный Гамильтоном механизм гидрирования FAD [26], основанный на присоединении гидридиона Н в положение N5. При этом протон должен присоединяться в положение N1. Заряды на атомах N5 и N1 в молекуле FAD равны: в окисленной форме q(N5) = 0.12, q(Ni) = - 0.24; в восстановленной форме q(N5) =0.i74, q(Ni) =0.114, что совпадает с расчетными значениями, приведенными в работе [7].
Расчет энергии синглет-триилетного расщепления восстановленного люмифлавина показывает, что значения, полученные различными методами, колеблются от 30 до 127 ккал/моль (табл. 1). При этом значения, полученные методами DFT (-88.36 ккал/моль) и МР2 (-89.23 ккал/ моль) практически совпадают со значениями, полученными методом INDO, а значения энергии S-T перехода, полученные без учета МР2, близки к значениям электронных энергий S - T, рассчитанным методом аЬ initio без учета МР2.
Для всех методов энергии синглет-триплет-ных переходов восстановленного люмифлави-на больше величины AE(S - T) окисленного люмифлавина. В восстановленном люмифлави-не, так же, как и в окисленном, индуцированный индуктивный спиновый эффект в ароматическом кольце сохраняется, вследствие чего спиновая плотность на атомах взаимно компенсируется, что фиксируется методами РМ3 и INDO.
Можно отметить, что энергия корреляции, выявленная методом МР2 в аЬ initio расчетах для окисленного люмифлавина в синглетном и триплетном состоянии, различается, при этом в синглетном состоянии величина энергии МР2 больше, чем в триплетном состоянии (AE кор (ST) = -129.85 ккал/моль (5.63 эВ)), что составляет большую часть энергии (S-T) окисленного люмифлавина (-157.11 ккал/моль) (табл. 1).
Известно, что AE (S-T) = 2I, где I - обменный интеграл. Таким образом, величина обменного интеграла, согласно расчетам, в окисленном люмифлавине составляет 65 ккал/моль. Для
Таблица 1. Сравнительные характеристики электронных энергий S0 и T окисленного (C13H12O2N4) и восстановленного (C13H14O2N4) люмифлавина, выступающего в качестве модели FAD, рассчитанные в рамках неограниченного метода Хартри-Фока разными методами
Методы 1Cl3Hl202N4 3Cl3Hl202N4 1Cl3Hl402N4 3Cl3Hl402N4
PM3 Eполн. -68296,95 -68239,24 -69030,52 -69000,62
AH 0, -31,37 26,34 -57,78 -27,88
INDO Eполн. -111787,82 -111731,56 -112837,23 -112748,0
AH 0 -6652,27 -6596,02 -6795,86 -6706,63
CNDO Eполн. -116162,18 -116079,65 -117213,97 -117113,34
AH 0 -7145,35 -7062,81 -7291,32 -7190,68
Ab initio Eполн. -537081,01 -537054,18 -537821,40 -537753,43
MP2 -674,41 -544,56 -654,51 -595,36
E V J-' полная ^ MP2 -537755,85 -537598,74 -538475,91 -538348,78
DFT Eполн. -539931,69 -539878,19 -540683,5 -540617,63
MP2 -1122,59 -1150,51 -1084,00 -1060,50
E V полная ^ MP2 -541054,28 -541028,71 -541767,48 -541678,12
восстановленной формы (Red) люмифлавина ДБ ^р2 (S-T) = 59.15 ккал/моль, что значительно меньше, чем для окисленного люмифлавина. Из этого следует, что обменные взаимодействия в окисленной форме более существенны, чем в восстановленной форме люмифлавина.
Расчеты величины ДБ Мр2 (S-T) методом DFT и аЬ initio отличаются, поскольку обменно-корреляционный потенциал B3-LYP уже учитывает обменно-корреляционную энергию.
2. Расчеты электронных и спиновых
характеристик протонированного His516+
Электронные энергии S0 и Tj протонированного His516+, полученные разными методами, представлены в таблице 2. Значения ДБ (S-T) имеют значительный разброс. B триплетном состоянии гистидина спиновая плотность двух неспаренных электронов делокализована по атомам углерода.
Наибольшая спиновая плотность сосредоточена на атомах С16, С17; С19 гистидина и соответственно равна 0,545; 0,595; 0,681, что в сумме составляет 1.83. Остальная спиновая плотность локализована с малыми величинами на остальных атомах. Расчет РМ3 синглетного состояния показал, что на атомах пятичленного цикла наблюдается индуктивный зарядовый эффект. При этом на атомах азота прослеживается недостаток заряда (0,46е), а на атоме кислорода избыток электронной плотности (-0,33е). B триплет-ном состоянии распределение зарядов на атомах сохраняется по знаку, но имеет меньшие по модулю значения. Расчеты методами INDO и аЬ initio показывают, что спиновая плотность в триплетном состоянии (р = 2) может быть дело-
кализована либо на атомах углерода и азота пятичленного цикла (аЬ initio), либо локализована по одному спину на различных фрагментах, расположенных на значительном расстоянии друг от друга (INDO). Например, один из спинов локализован на атоме азота (p(N) = 1), а второй спин делокализован по атомам углерода пятичленного цикла со значительной спин поляризацией. Расчеты методом CNDO дают несогласованную картину: один из спинов локализован на атоме кислорода карбонильной группы (р(О) = 0,89), а второй спин делокализован по атомам азота и углерода пятичленного цикла, при этом спин-поляризация не наблюдается (разделение спиновой плотности на положительные и отрицательные значения на разных центрах).
Таблица 2. Сравнительные характеристики электронных энергий протонированного гистидина His 516+, рассчитанные разными методами в рамках НХФ в синглетном и триплетном состоянии
Метод расчета Энергия Исследуемый объект
‘His 516+ 3His 516+
PM3 Еполн. -44576,86 -44490,54
ДИ 0 82,07 168,39
INDO Еполн. -73521,47 -73387,69
ДИ 0 -3368,43 -3234,66
Ab initio Еполн. -338217,16 -338090,34
MP2 -377,79 -317,55
у ETotal У MP2 -338594,95 -338407,88
DFT Еполн. -339845,38 -339939,04
MP2 -600,42 -623,66
у ЕTotal У MP2 -340445,81 -340562,69
Таблица 3. Зависимость электронной энергии триплетного кислородного комплекса 3[Люмифлавин...О2]° восстановленного люмифлавина от межмолекулярного расстояния между кислородом и люмифлавином
R‘=2,6 А R‘=2,7 А R‘=2,80 А R‘=2,83 А R‘=3 А R‘=4 А Rj=5 А
PM3 Еполн, — — -82499,07 -82499,04 -82498,93 -82498,93 -82498,89
ДИ 0 — — -62,18 -62,15 -62,04 -62,05 -62,01
CNDO Еполн. -140305,03 -140304,95 -140304,89 -140304,88 -140304,81 -140304,55 -140304,61
ДИ/ -7569,79 -7569,72 -7569,66 -7569,65 -7569,58 -7569,31 -7569,37
Ab initio Еполн. -593836,31 -469125,35 -469232,48 -469259,46 -453496,44 -449296,97 -630459,41
MP2 -551,56 -104,58 -106,62 -107,14 -206,30 -218,56 -708,25
у Е Total у MP2 -594387,87 -469229,93 -469339,10 -469366,59 -453702,75 -449515,54 -631167,66
-V/T 1,914 1,712 1,713 1,713 1,698 1,691 2,01
DFT Еполн. -602952,39 -602963,53 -602973,51 -602975,93 -476345,26 -478123,49 -445537,39
MP2 -593,56 -579,99 -577,25 -576,78 -328,60 -325,93 -275,38
у Е Total у MP2 -603545,95 -60354352 -603550,76 -603552,71 -476673,86 -478449,42 -445812,77
-V/T 1,93 1,93 1,93 1,93 1,7350 1,7357 1,6828
3. Расчеты электронных и спиновых характеристик в бимолекулярном комплексе 3[Люмифлавин ...02]
Значения полной электронной энергии и энергии корреляции в зависимости от межмо-лекулярного расстояния R1 между О2 и люмиф-лавином приведены таблице 3. Полученные значения вириала (-Y/T) для каждой стационарной точки существенно отличаются по величине. Можно лишь на качественном уровне судить об изменении величины энергии для близких значений вириала. Из таблицы 3 видно, что согласно CNDO расчетам энергия триплетного комплекса 3[Люмифлавин - 3О2] практически не изменяется в интервале 2.6-5 Е (изменения составляют 1 ккал/моль).
Результаты CNDO расчетов вполне объяснимы, поскольку метод не параметризован для описания межмолекулярного взаимодействия.
Согласно аЬ initio расчетам без учета энергии корреляции методом МР2, в точке с R = 2.83 Е наблюдается минимум электронной энергии. Таким образом, из качественных соображений можно сделать выводы, что восстановленный люмиф-лавин может образовывать достаточно устойчивый комплекс с триплетным кислородом (энергии сравнивались при близких значениях вириа-ла). Энергия корреляции МР2 изменяется при сближении фрагментов. DFT расчеты подтверждают эту тенденцию (табл. 3). Обменно-корреляционная энергия может быть рассчитана как разность энергий DFT и CNDO в стационарных точках. B этом случае точка минимума полной энергии совпадает с минимумом кривой обменно-корреляционной энергии, что свидетельствует о значительном обменном взаимодействии на кислороде и индуцированном незначительном обменном взаимодействии на люмифлавине.
4. Расчеты электронных и спиновых характеристик в бимолекулярном комплексе 3[His++ 302]+
Характеристики комплекса рассчитаны неэмпирическим методом в базисе STO-3G, а также полуэмпирическими методами CNDO, РМ3 в рамках неограниченного Хартри-Фока с зарядом комплекса катиона плюс один.
Взаимное расположение атомов кислорода и гистидина после оптимизации в комплексе приведено на рисунке 6. За координату реакции принято расстояние между одним из атомов водорода связи N-H пятичленного цикла и атомом кислорода в молекуле О2.
Рисунок 6. Оптимизированная геометрия комплекса 3[His+ ... 3О2]+ с указанием номеров атомов в пятичленном цикле гистидина
Энергетические и спиновые характеристики комплекса для различных межмолекулярных расстояний, рассчитанные разными методами, приведены в таблицах 4-6.
Ab initio расчеты дают минимум полной электронной энергии в окрестности точки R2 = 4 Е, при этом обменно-корреляционная энергия в точке минимума полной электронной энергии имеет вновь наименьшее значение, а спиновая плотность на атомах О2 отлична от единицы и составляет на каждом атоме по 0.5 (табл. 3).
Заключение
Расчет электронных и спиновых характеристик методами ab initio, DFT, CNDO, PM3 в рамках НХФ в комплексах 1,3[Люмифлавин ... О2] и 1,3[О2 .. .His516+ ]+ для различных расстояний R1 и R2 показал, что в присутствие кислорода на атомах люмифлавина и атомах протонирован-ного His516+ возникают индуцированные взаи-мокомпенсирующиеся спиновые плотности с различными схемами распаривания без изменения полного спина системы. Каждая схема распаривания характеризуется своей энергией.
Расчеты подтверждают ранее предложенный механизм гидрирования FAD, основанный на присоединении гидрид - иона Н? в положении N5. При этом протон присоединяется в положение N1 [26]. Заряды на атомах N5 и N1 в в окисленной форме молекулы FAD равны: 0.12 и -0.24е соответственно, а в восстановленной форме эти значения составляют 0.174 и 0.114е.
Неэмпирическими и полуэмпирическими расчетами показано, что в комплексах 1,3[Лю-мифлавин ... О2] и 1,3[О2 ...His516+ ]+ точка ми-
Таблица 4. Полная, корреляционная энергия и распределение спиновой плотности на атомах комплекса 3[His++ 302]+ при переменном значении R2, полученные методом ah initio в рамках неограниченного метода Хартри-Фока
Символ и номер атома Спиновые плотности
R2=1,5; А R2=2; А R2=3; А R2=4; А R2=5; А
O13 0 0,666 0 0,497 0,604
O14 -0,001 0,331 0 0,503 0,396
N15 -0,088 0 0 0,007 0,004
C16 0 0 0 0,003 0,524
C17 0 0 -0,002 0 0,549
N18 0 0 0 0 0,004
C19 -0,061 0 0 0 0
Еполн. -340103,31 -379536,28 -351594,66 -381413,53 -325322,75
MP2 -5,01 -59,06 -17,520 -67,26 -22,93
у ETotal м MP2 -340108,33 -379595,34 -351612,18 -381480,79 -325543,68
Таблица 5. Полная, корреляционная энергия и распределение спиновой лотности на атомах комплекса 3[Нм++ 302]+ при переменном значении Я2, рассчитанные методом РМ3 в рамках неограниченного метода Хартри-Фока
Символ и номер атома Спиновые плотности
R2=1,5; А R2=2; А R2=3;А R2=4; А R2=5; А
O 1,076 1,068 1,038 1,023 1,015
O14 0,909 0,930 0,962 0,977 0,985
N15 0,008 0,005 0 0 0,001
C16 0,015 -0,005 0 0 0
C17 -0,011 0,005 0 0 0
N18 0,006 -0,002 0,001 0,001 0
C19 0,001 -0,001 -0,001 -0,001 -0,001
cHis 0,019 0,002 0 0 0
Еполн, -58007,05 -58033,86 -58042,73 -58043,22 -58043,0
ды 0 116,03 89,23 80,35 79,86 79,82
Таблица 6. Распределение спиновой плотности на атомах комплекса 3[Нк++ 302]‘ и полная энергия при переменном
Символ и номер атома Спиновые плотности
R2=1,5; А R2=2; А R2=3;А R2=4; А R2=5; А
O13 0,993 1,018 1,022 1,013 1,009
O14 0,970 0,978 0,978 0,987 0,991
N15 0,038 0,005 0 0 0
C16 0,006 0 0 0 0
C17 0,001 0 0 0 0
N18 0,001 0 0 0 0
C19 0,005 0 0 0 0
с (His) 0,051 0,005 0 0 0
Еполн, -99540,57 -99539,5 -99534,18 -99534,02 -99533,99
нимума полной электронной энергии соответствует минимуму кривой обменно-корреляционной энергии, в которой М(Ъ-а) будет максимальным и, как следствие, генерация синг-летного кислорода будет облегчена. Расчеты со всей очевидностью свидетельствуют, что кислород стремится занять такое положение в комплексе, в котором он будет наиболее активирован.
Механизм снятия спинового запрета в химических реакциях окисления кислородом может быть основан на индуцировании максимальной величины момента перехода М(Ь-а) в кислороде, а также связан с изменением спиновой плотности на атомах триплетного молекулярного кислорода вследствие возникновения обменно-корреляционного потенциала в кислородных комплексах.
Список использованной литературы:
1. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии. Т. 1. - М.: Мир, 1981. - 532 с.
2. Мецлер. Биохимия. Т 2, с. 134. М.: Мир, 1980. - 560 с.
3. Малер Г., Кордес Ю. Основы биологической химии. М.: Мир, 1970. - 560 с.
4. Кретович В.Л. Биохимия растений: Учебник для биол. Факультетов ун-тов. М.: Высшая школа,1980. - 445 с.
5. Плешков Б.П. Биохимия сельскохозяйственных растений. - 5-е изд., доп. и перераб. - М.: Агропромиздат, 1987. - 494 с.
6. Мерзляк М.Н., Активированный кислород и жизнедеятельность растений, // Соросовский образовательный журнал. - 1999, №9, с 15.
7. Минаев Б.Ф., Минаева В. А., Лещенко В. Н. // Ж. Биополимеры и клетка (Украина), 2004. Т. 20, №3. С. 224-232.
8. Минаев Б. Ф. Электронные механизмы биоактивации молекулярного кислорода. // Украинский биохимический журнал. -2002. - V. 74. - №3. - С. 6-14.
9. Minaev B. Spin effects in reductive activation of O2 by oxidase enzymes. // RIKEN Rev. - 2002. - V. 44. - P. 147-149.
10. Prabhakar R., Siegbahn P., Minaev B.F., Egren H. Activation of triplet dioxigen by glucose oxidase. // J. Phys. Chem. В. - 2002. -V. 106. - P. 3742-3750.
11. Klinman J. P. Life as aerobes: are there simple rules for activation of Cavelier G., Amzel L.M. Mechanism of NAD(P)H:Quinone Reductase: Ab Initio Studies of Reduced Flavin. // PROTEINS: Structure, Function and Genetics. - 2001. - V. 43. - P. 420-432.
12. Meyer M. Density functional study of isoalloxazine and C4a-hydroperoxidihydroisoalloxazine. // J. Mol. Struct. - 1997. - V. 417. -P. 163-168.
13. Кутовая О.В., Кобзев Г.И.. Поляризация спиновой плотности на FAD и His516+ при активации кислородав каталитическом цикле. // Матер. Междун. конф. студ. и аспир. по фунд. наукам «Ломоносов-2004». Секция «Химия», т.2. М.,2004. с.128Т.
14. Minaev B.F., Lunell S., Kobzev G.I.. The influence of intermolecular interaction On the forbidden near-IR transitions in molecular Oxygen. // J. of Mol. Struct.(Theochem) 284. 1993 с. 1-9
15. Minaev B.F., Lunell S., Kobzev G.I.. Collision-induced intensity of the b (1S +)®a(1D ) transition in molecular oxygen: Model calculations for the collision complex O2+H2. // Int. J.Quant. Chem.V.50, 1994 с.8279-292.8
16. Кобзев Г.И. Зависимость моментов переходов (a-X) и (b-a) в кислороде от структуры и числа молекул в среде и их взаимной ориентации. // Труды VII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии Казань 19-24 сентября 2003 г т.1. с. 140.
17. Кобзев Г.И. Мулдахметов З.М.,Федулова И.В. Перенос энергии от сенсибилизатора и кислорода на растворитель в тримо-лекулярном комплексе O2.. .CH3OH.. ,C2H4. // Труды международной научной и научно-методической конференции «Наука и образование 1997», посвященной 1500-летию г. Туркестана и 60-летию института. - Шымкент, 1997. - с.337-338.
18. Кобзев Г.И. Минаев Б.Ф., Мулдахметов З.М., Мартынов С.И., Безносюк С.А., Мозговая Т.А. Механизм возрастания интенсивности a(1 D ) - b (1S +) перехода в молекуле кислорода под влиянием межмолекулярного взаимодействия. // Оптика и спектроскопия 1997. - ^83g №1, с. 64-68.
19. Минаев Б.В., Мулдахметов З.М., Федулова Е.И., Иванова Н.М., Кобзев Г.И. Кооперативное влияние молекул С^^ и Н2 на переходы b-a и a-X в молекуле О2 в тройном комплексе. // Журн. «прикладной спектроскопии.» (ЖПС). 2000. - №4, т.67, с.453-456.
20. Кобзев Г.И., Минаев Б.Ф., Мулдахметв З.М., Нуртаканова Ж.У. Исследование a(1 D ) ® Х(4е -) и b(1S +)®(1 D ) излучатель-ных переходов в тройном комплексе столкновений О2.. .^H... ,Н2О. // Труды международной научной конференции «Наука и образование - ведущий фактор стратегии «Казахстан - 2030». - Караганда, 2000. - с.381 -384
21. Minaev B.F., Kobzev G.I. Response calculations of electronic and vibrational transitions in molecular oxygen induced by interaction with noble gases // J. Spectrochimica Acta Part A 00 (2003) p.1-24.
22. Кобзев Г.И. Зависимость электродипольных моментов переходов М(а-Х) И Мф-a) в О2 от взаимного расположения молекул С2Н4 и N2 в тройном комплексе столкновений С2Н4 - О2 - N2. // Труды региональной школы-семинара квантово-химические расчеты: структура и реакционная способность органических и неорганических молекул. Иваново 12-15 апреля 2003г.с.8-12
23. Кобзев Г.И. Теоретическое исследование основного и первых возбужденных электронных состояний кислородных комплексов столкновений. // Автореф. дис. кандхим. наук: Караганда, 1996. 24 с.
24. Бучаченко А.А., Сагдеев Р.З., Салихов К.М. Магнитные и спиновые эффекты в химических реакциях. - Новосибирск: Наука, 1978. -366 с. Бучаченко А.Л., Бердинский В.Л.. // Кинетика и Катализ, 1996. 37, С. 615.
25. Шека Е.Ф. О природе химической активности фуллерена С60 // в печати.
26. Терней А. Современная органическая химия. Т2. - М.: Мир, 1981. - 651с.
