CC BY
39
РЕПРОДУКТИВНАЯ БИОЛОГИЯ, ЦИТОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА
УДК 581 331 I •*■ 575.224.234:
СПЕЦИФИКА СТРУКТУРНЫХ АНОМАЛИЙ ЗАРОДЫШЕВЫХ МЕШКОВ У Г АПЛОИДОВ И МКЖВИДОВЫХ ГИБРИДОВ ГАВАКА
Н.Х. Кналеева
CapammcKuu государственный университет им. //. IЧернышевского
Один из подходов к исследовании) закономерностей, лежащих в основе генетической регуляции развития женского гаметофита у растений заключается в исследовании гамстофитных мутантов - форм с наследственными изменениями в проявлении признаков микро- и/или мегагаметофита Известны три группы мутаций - генные, хромосомные и геномные (Гершензон. 1983, 1991), каждая из которых характеризуется специфическим спектром нарушении в структурно-функциональной организации мегагаметофита (Еналеева, Тырнов, 2000)."
К группе геномных мугаций относятся генетические изменения, выражающиеся в кратном умножении или уменьшении целых хромосомных наборов. В последнем случае речь идет о гаплоидах - особях растений с редуцированным гаметичсским числом хромосом. Наличие одинарного набора хромосом вследствие отсутствия конъюгации на стадии профазы I мейоза веде! к значительным нарушениям на последующих мейотических стадиях и формированию спор с недостающими хромосомами. Как правило, такие мегаспоры не способны к дальнейшему развитию, однако иногда из них формируются ЗМ аномального строения. В связи с этим i диплоидные растения представляют собой уникальный материал, позволяющий выявлять специфику мегагаметогене-та при нехватке генетической информации.
Сходные нарушения мейоза наблюдаются у межвидовых гибридов - ал-лодиплоидов (Гуляев, Мальчеико, 1983 ). Вследствие негомологичности хромосом родительских форм и отсутствия по мой причине конъюгации на стадии профазы I формируются споры с несбалансированным хромосомным набором, неспособные к нормальному гаметофитогенезу. Учитывая это, аллодиплоиды, так же как и гаплоиды, могут быть использованы в качест ве объектов для исследования закономерностей мегагаметофитогенеза при хромосомном дисбалансе в инициальной клетке ЗМ.
Имеющиеся к настоящему времени литературные данные по эмбриологии гаплоидов (Webber, 1933; Звержанская, 1974; Звержанская, Шишкинская, 1974; Кналеева, Душаева. 1975) и межвидовых гибридов (Лиферова, 1978, 1984; Пахомова, 1973. 1978; Горбунснко, 1991; Молхова, 1972 и др.) основаны на анализе единичных ЗМ, поэтому сделать заключение о диапазоне варьирования мегагаметогенезз и существовании тенденции (либо ее отсутствии) к
формированию ЗМ определенного типа у этих групп растений не представляется возможным.
Использование экспресс-метода, основанного на приготовлении клеточной суспензии, позволяет проводить массовый анализ ЗМ у видов с тенуину-целлятными семяпочками, что открывает перспективы для получения на обширном материале новой информации об особенностях мегагметофитогенеза у гаплоидов и межвидовых гибридов.
В настоящей работе представлены результаты исследования гаплоидов Nicottana tabacum I., полученных разными способами из генетически неоднородного материала, и гибридов N. tabacum i х Л', sylvestris Speg et Comes.
Материал и методы
В качестве материала использовали:
- МГ-32 - матроклинный гаплоид член двойни, выявленной при проращивании семян линии Ы-32;
- АГ-145 - андроклиниый гаплоид, полученный в культуре изолированных пыльников растения сорта Дюбек 44 a.v.; пыльники в стерильных условиях изолировали на стадии микроспоры и культивировали па среде MC с добавлением агар-агара, 2% сахарозы, ИУК (0.1 мг/л) и кинетина (0,2 мг/л);
- АГ2-141 - гаплоид второго андроклинного цикла, полученный в результате культивирования пыльников реституционного диплоида, который в свою очередь был получен на основе культуры изолированных пыльников линии БГ-141; условия культивирования те же, что и в предыдущем варианте.
Для получения межвидовых гибридов предварительно кастрированные цветки растения линии БГ-6 вручную опыляли пыльцой растения /V. sylvestris. Из завязавшихся семян на следующий год выращены растения, три из которых использованы для анализа.
Растения произрастали в открытом фунте на экспериментальном участке. Завязи фиксировали ацетоалкоголем (1:3) на 3-4 сутки после распускания цветков.
Препараты для изучения ЗМ готовились с применением метода ферментативной мацерации семяпочек до клеточной суспензии (Еналсева и др., 1972). Количественный учет семяпочек с ЗМ проводились на препаратах просветленных семяпочек iHerr, 1971) с помощью микроскопа Zetopan с фазово-контрасгным устройством. Морфологический анализ ЗМ проводился методом светлого поля в проходящем свете при увеличении 10x63. Рисунки выполнены с использованием рисовального аппарата РА-4.
При анализе результатов и изготовлении графических иллюстраций использовали программу Ехсс. для Windows.
Результаты
Подсчет семяпочек, в которых произошло развитие ЗМ, показал, что частота этих событий для гаплоидов МГ-32, АГ-145 и АГ2-141 составляет 12%, 5% и 13%. В большинстве семяпочек обнаружены дегенерирующие остатки ме-
гаспор. Частоты развивающихся ЗМ в семяпочках трех межвидовых гибридов составили 78%, 80% и 82%.
Спектры аномальных ЗМ гаплоидов У грех гаплоидов идентифицировано 104, 61 и 63 структур, из них большинство - 66, 43 и 49 оказались ЗМ аномального строения. Согласно ранее принятой классификации (Еналеева. 2001), в основу которой положено число ядер и наличие либо отсутствие цитокинеза, аномальные ЗМ распределились на 6 основных групп: (1) с числом ядер <8 це-ноцитные; (2) с числом ядер <8 клеточные; (3) с числом ядер =8 ценоцитные; (4) с числом ядер -8 клеточные; (5) с числом ядер >8 ценоцитные; (6) с числом ядер >8 клеточные. Наряду с ЗМ у всех трех гаплоидов обнаружены «клеточные комплексы» - образования из нескольких клеток. Количественные соотношения структур каждой группы у исследованных растений представлены н таблице 1.
Значительную часть аномальных ЗМ составили ценоцитные образования — 66,7. 61,1 и 66.7%. Ядра одного и того же ЗМ могли быть одинаковыми, либо шачительно варьирующими по размеру, форме и числу ядрышек (Рис. 1 с, ц). В некоторых ЗМ ядра сформированы в результате нескольких аномальных митозов, о чем свидетельствует их неправильная форма, множество ядрышек и видимые фрагменты ядерных оболочек (Рис 1 в-д. т). Согласно приведенным в таблице 2 данным, наиболее многочисленную группу составили двуядерные ЗМ.
Клеточные ЗМ встречались с частотами 26,4, 20,4 и 15,0%; за небольшим исключением, это были ЗМ с уменьшенным, по сравнению с нормой, числом ядер и клеток (Табл. 1.). Двукле точные ЗМ содержали небольшую одноядерную клетку, расположенную у одного из полюсов и крупную «центральную» клетку с одним, двумя или тремя ядрами. Условно эти типы обозначены как 1(1 )0 (Рис. 2 г); 1(2)0 (Рис. 2 б) и 1(3)0*). Трсхклеточныс ЗМ представлены типами 2(1)0 и 2(2)0 (Рис. 2 г), четырехклеточиые ЗМ были биполярными типа 2( 1)1 (Рис. 2 и) или монополярными типа 3(1)0 (Рис. 2 ж). 5-7-яерные ЗМ варьировали по числу, морфологии клеток и их локализации (Рис. 2 д, з, к, м) В одном случае ЗМ содержал 11 ядер (Рис. 2 и). Частоты встречаемости клеточных ЗМ разной структурной организации представлены в таблице 4.
«Клеточные комплексы» состояли из нескольких клеток увеличенного (по сравнению с обычными нуцеллярными клетками) размера, при этом число клеток могло достигать 7 (Рис. 3 е). Клетки были одноядерными или с разным числом ядер, одинакового или разного размера (Рис. 3).
Спектры аномальных ЗМ межвидовых гибридов. У трех гибридных растений идентифицировано 98, 93 и 94 структур, из них 89, 87 и 90 оказались ЗМ аномального строения. Основная их часть - 84,7, 85,9 и 86,2% представлена ценоцитными ЗМ, преимущественно с уменьшенным числом ядер (Табл. 1, 2).
первая цифра означает число клеток на одном из полюсов; вторая, заключенная в скобки, - число ядер в «центральной клетке; третья - число клеток на другом полюсе.
I аблица 1. Результаты анализа ЗМ гаплоидов " гибридов Nicotiana tabacum L.x N.sylveMris Speg el Comes.
Вариант Всего структур Всего ЗМ Аномальных ЗМ с числом ядер: Многоклеточных комплексов
аномальных нормальных <8 =8 >8
клеточн. ценоцитн. клеточн. ценоцитн. клеточн. ценоцитн.
Гаплоид 5.32 104 66 6 17 45 0 1 1 2 32
Гаплоид Д-44 61 43 11 10 33 0 0 0 0 7
Гаплоид БГ-5 64 49 11 8 39 1 0 0 1 4
N.t х N.s. ül 98 89 9 4 83 1 0 1 0 0
N.t. х N.s. 42 93 87 5 8 77 0 t t. 0 0 1
N.L x N.s. U3 94 90 4 9 80 0 1 0 0 0
Рис. 1. Аномальные зародышевые мешки ценоцитной структуры гаплоидов и межвидовых гибридов табака: а-т, ф, ц - с числом ядер <8; б-д, т с ядрами, образованными в результате аномальных митозов; х - с числом ядер=8; ч - 16-ядерный ЗМ; ш - с 14 ядрами; у - с 20 ядрами.
Рис. 2. Клеточные зародышевые мешки гаплоидов и межвидовых гибридов габака: а - нормального строения; б-м с числом ядер <8; н - 11 -ядерный.
Таблица 2. Распределение аномальных ценоцитных ЗМ по числу ядер > гаплоидов и межвидовых гибридов табака
Генотип Общее число (%) ценоцитных ЗМ Число ценоцитных ЗМ с числом ядер:
1 2 3 4 5 6 7 8 14 16 20
Гаплоид 5.32 48 (66,7) 6 21 1 9 6 0 2 1 1 1 0
Гаплоид Д-44 33(61,1) 11 13 6 2 1 0 0 0 0 0 0
Гаплоид БГ-5 40 (66,7) 13 14 5 4 0 2 1 0 0 0 1
МЛХЫ.Б.Я! 83 (84,7) 9 37 10 24 3 0 0 0 0 0 0
N.1. х N.8. #2 79 (85,9) 17 31 9 17 1 1 1 2 0 0 0
N.1. х \т.б. ИЗ 81 (86.2) 6 40 10 18 1 3 2 1 0 0 0
Таблица 3. Распределение аномальных клеточных ЗМ по числу ядер у гаплоидов и межвидовых гибридов табака
Генотип Общее число (%) клеточных ЗМ Число клеточных ЗМ с числом ядер:
о л. 3 4 5 6 7 8 10
Гаплоид 5.32 19(26,4) 5 2 5 2 3 1 0 1
Гаплоид Д-44 11(20,4) 3 2 4 1 1 0 0 0
Гаплоид БГ-5 9(15,0) 0 2 3 3 0 0 1 0
Ы.1хЫ.5. #1 6(6,1) 1 3 0 0 0 0 1 1
N.1. х Ы.э. #2 8 (8.7) 0 6 2 0 0 0 0 0
N.1. х N.8. #3 9(9,2) 2 «» 4 0 0 0 0 0
Рис. 3. «Клеточные комплексы», выделенные из семяпочек гаплоидов табака: а. и ж. ч. к - грехклеточные; б-г. л лвуклеточные; с семиклеточный; и шести клеточный.
Клеточные ЗМ встречались с частотами 6,1, 8,7 и 9,6%; в основном это были двуклеточные ЗМ гипа 1(1)0 или 1(2)0 (Табл. 4.). Один ЗМ оказался одиннадцатиядерным, и в одном случае обнаружен «клеточный комплекс».
Обсуждение
Результаты анализа ЗМ трех гаплоидов разного происхождения дают представление о фснотипическом эффекте в женской генеративной сфере ге-
Таблица 4. Частоты встречаемости клеточных ЗМ разных гинов структурной организации у гаплоидов и межвидовых гибридов габака
Всего Число клеточных ЗМ с числом ядер:
Вариант клеточ- 2 - 4 с распределением ядер:
ных ЗМ 1(1)0 1(1)1 1(3)0 2(1)0 2(1)1 3(1)0 5-7 К 10
1(2)0 1(2)1 2(2)0
1 аплоид 5.32 19 6 0 3 1 1 1 6 0 1
1 аплоидД-44 11 3 2 0 Л 0 I 2 0 0
Гаплоид БГ-5 9 1 1 0 0 2 5 0 0 0
N.1 х N..4. #1 6 4 0 0 0 0 0 0 1 1
!Ч.Г. х N.5. #2 8 5 л 1 0 0 0 0 0 0
N.1. х N.5. #3 9 5 1 0 I 0 1 1 0 0
ном ной мутации, проявляющейся в уменьшении вдвое числа хромосом в соматических клетках растений (п 24). Как известно, вследствие унивалентного состояния хромосом в профазе 1 мейоза, нарушается процесс их сегрегации и в результате формируются споры, а затем материнская клетка ЗМ с недостающими хромосомами. Таким образом, у гаплоидов на фоне геномной мутации в спорофите проявляются хромосомные мутации анеуплоидия на этапе мега-гаметофитогеиеза. Низкая частота семяпочек (5-13%), с развивающимися ЗМ свидетельствует о том, что программа мегагаметофитогенеза в большинстве случаев "не запускается". Это означает, что для се запуска в МКЗМ должна содержаться необходимая для этого информация, следовательно, данный процесс имеет гаметофитную регуляцию.
Если в силу случайных обстоятельств формируется инициальная клетка ЗМ с полным набором хромосом, такие факты известны из литературы (Звер-жанская, Шишкинская, 1974), это ведет к нормальному мегагамегофитогенезу и образованию типичного ЗМ. 13 случае неполной информации в геноме мате ринекой клетки ЗМ программа дальнейшего развития реализуется неполностью, и в итоге формируется ЗМ аномальной структуры.
Как можно видеть из рисунка 4, самыми многочисленными у всех трех гаплоидов являются 1-2-ядерные ЗМ. Следующей по частоте является группа 3-4-ядерных ЗМ, а ЗМ с большим числом ядер встречаются редко. Клеточные ЗМ у гаплоидов составляют менее 20%. Их распределение (данные по 3 гаплоидам суммированы) в зависимости от числа ядер представлено на рисунке 5. Очевидно, что в большинстве случаев - это 4-ядерные ЗМ. реже встречаются 2-, 3-и 5-ядерные (в равных количествах), ЗМ с большим числом ядер - единичны.
Одно из наиболее интересных цитологических явлений, зарегистрированных нами у гаплоидов, заключается в формировании с высокой частотой «клеточных комплексов». По всей вероятности, в основе этого феномена лежит
1 ап.юилы
♦ МГ-32 -т- АГ-145 —АГ2-141
Гибриды
Рис. 4. Распределение цсноцитных ЗМ К. tabacum и гибридов N. tabacum х N. sylvestris по числу ядер.
93 30 ё 20 я 10 * о
123456789 10 11 Число ядер
♦ Гаплоиды —I ибрниы
Рис. 5. Распределение клеточных ЗМ N. tabacum и гибридов N. tabacum х N. sylvestris по числу ядер.
разрастание нескольких клеток ну цел л уса, аналогично образованию многоклеточного археспория, не его развитие блокируется на ранних стадиях. То. что »ют реликтовый признак чаще проявляется именно у гаплоидов, возможно, объясняется гемизигот» ым состоянием генетических систем, контролирующих данный признак.
Поскольку в геноме аллодиплоида N. tabacum содержится геном N. sylvestris (Костов, 1930. цит. по: Лобашев, 1969). принципиальное отличие 36-хромосомных гибридов от 24-хромосомных гаплоидов заключается в наличии у гибридов 12 хромосом, обеспечивающих возможность конъюгации в мейозе (по крайней мере частичной) половины имеющихся хромосом. Это означает, что в унивалентном состоянии у этих форм преимущественно должны находиться лишь 12 хромосом N. tomentositormis. Следовательно, хромосомный дисбаланс в МКЗМ гибридов должен проявляться в основном в отношении л ой группы хромосом.
Результаты цитологического изучения гибридов N. tabacum х N. sylvestris показали, что развитие ЗМ у них происходило в 78-82% семяпочек, то есть, почти в 20 раз чаще 4ev. у г аплоидов, хотя уровень аномалий у формирующихся ЗМ юг же самый - 90,8-95,7% ( у гаплоидов - 82-94,2%). Спектры аномальных ЗМ у гибридов и гаплоидов в значительной степени совпадают. Отличие состоит в большей доле ценоцитных малоядерных ЗМ у гибридов. Распределение этих ЗМ по числу ядер сходно с таковым у гаплоидов. Самыми высокочастотными являются двуядерные ЗМ, затем в порядке убывания следуют: четырехъ-ядерные. одно- и трехъядерные (почти равновероятно). Пяти-восьмиядерные ЗМ встречаются в единичных случаях, а ЗМ с числом ядер более 8 отсутствуют. Клеточные ЗМ, так же как у гаплоидов - преимущественно с двумя и четырьмя ядрами. Образования типа «клеточных комплексов» для гибридов не характерны (зарегистрирован всего один случай), что свидетельствует в пользу высказанного предположение о роли гемизигот ности в индукции данного явления.
В целом, можно заключить, что у гаплоидов Nicotiana tabacum и гибридов N. tabacum х N.. sylvestris преимущественно формируются ценоцитные ЗМ с уменьшенным числом адер. '_)то означает, что осуществление начальных этапов - разрастание мегаспоры и деление ядра с образованием двуядериого ЗМ происходит сравнительно легко, но затем в большинстве случаев развитие блокируется. По-видимому, для осуществления нескольких митот ических циклов и цитокинеза требуется одновременное присутствие в геноме материнской клетки ЗМ генетических факторов из разных хромосом, а у i-аплоидов и аллодиплои-дов такое сочетание достигается в редких случаях.
Таким образом, представленные данные дают достаточно полное представление о диапазоне структурного разнообразия ЗМ у двух групп растений с геномными мутациями, вызывающими формирование инициальной клетки ЗМ с дефицитом генетической информации. Полученная картина позволяет констатировать существование у этих групп растений четко выраженной тенденции к образованию ЗМ определенных цитологических типов.
jlll 1I-.Р АТУ PA
Гершензон C'.M. Основы современной генетики. - Киев: Наукова думка.-
1983.- 558 с.
1 ершензон СМ Мутации. Киев: Hayкова думка. 1991.- 111с.
Горбуиснко О.Б. Развитие семяпочки и зародышевого мешка гибрида Juglans sieboldina х J regia // Borau, исслед., 1991.- №9.- С". 81 -87.
Гуляев Г.В., Мальченко В.В. Словарь терминов по генетике, цитологии, селекции, семеноводству и семеноведению. - М.: Россельхозиздат., 1983.- С. 9-10.
Еналсева Н.Х., Душаева H.A. Изучение женского гаметофита у андрок-линных гаплоидов табака. // Вопросы ботаники и генетики .- Саратов.- Изд-во ('арат, ун-та, 1975. - Вып. 3. - С. 42-43.
Еналсева Н.Х., Тырнов B.C. Гаметофитные мутации // Эмбриология цветковых растений. '. ерминология и концепции. Т. 3 / Под ред. Т. Б. Батыги-ной. СПб: Мир и семья, 2000.- С. 378-384.
Еналсева Н.Х., Тырнов B.C., Хохлов С.С. Выделение зародышевых мешков покрытосеменных растений путем мацерации тканей // Цитология и i снежка.-1972.- N5.-С. 430-441
Звержанская Л.С Мегаспорогепез и развитие зародышевого мешка у гаплоидов кукурузы линии ВГ-10.// Апомиксис и цитоэмбриология растений. Вып. 2. Изд-во Саратовского ун-та.- 1971. - С. 84-94.
Звержанская Л.С., Шишкинская H.A. Мсйоз и формирование мужского и женского гаметофитов у гаплоидов// Гаплоидия у покрытосеменных растений. ЧастьН. Саратов: Изд-во Саратовского ун-та - 1974.-С.7-42.
Лиферова В.В. Развитие женского гаметофита у смородинно-крыжовни-ковых гибридов первою и второго поколений// Проблемы гаметогенеза, опло-дотворения и эмбриогепезаю Гез. VII Всес. сими, по эмбриол. растений. Ч. 1. Киев: Наукова думка.- 1978.- С. 33-36.
Лиферова В.В. Отклонения в развитии женского гаметоита у смородин-но-крыжовникового гибрида первого поколения// Морфофункциональные аспекты развития женских генеративных структур семенных растений. Телави-
1984.-С. 34-35.
Лобашев M.F.. ГенетикаЛ.: Изд-во Ленинградского ун-та.-1969. - С. 516-
517.
Молхова К. 11роучване на мъжки и женски гаметофити при ншенично-ръжени хибриди// Отдалена хибридизация на растенията. София.- 1972.- С. 67-74.
Пахомова H.H. Особенности развития женского гаметофита у некоторых отдаленных гибридов в роде Ribes// Половой процесс и эмбриог енез растений.-М.- 1973.-С. 174-175.
Пахомова Н.П. Особенности развития женского гаметофита у межвидовых гибридов плодовых и ягодных культур// Проблемы гаметогенеза, оплодотворения и эмбриогенезаю Тез. VII Всес. симп. по эмбриол. растений. Ч. 3 Киев: Наукова думка - 1978.- С. 66-67.
Herr J. M., Jr. Л new clearing squash technique for the study of ovule development in angiosperme // Amer. J. Bot. 1971. Vol. 58, N8. P. 785-790.
Webber I.M. Cytological features of Nicotiana glutinosa haploids// Journ Agrie. Research.- 1933.- 47, N 11 - P. 845-867.
УДК 581.3 + 581.4:
ЭМБРИОЛОГ ИЧЕСКОЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФОРМ I АБАКА С РАННИМ ЗАЦВЕТАНИЕМ
А.10. Колесова, С.10. Белашов, Н.Х. Бналеева Саратовский государственный университет им. H /' Чернышевского
Табак является одним из наиболее удобных объектов для проведения экспериментальных исследований по эмбриологии и генетике растений. Наличие значительного количества семяпочек в завязи, обильное цветение и успешно применяемые методы экспресс-анализа, основанные на ферментативной мацерации и просветлении семяпочек, позволяют проводить массовый анализ зрелых зародышевых мешков (ЗМ) и наблюдать их развитие. Кроме того, для табака разработаны методы культивирования изолированных завязей и семяпочек в условиях in vitro, что даст возможность для проведения опытов по воздействию физических и химических факторов на развитие женского гаметофита.
У большинства сортов и линий Nicotiana tabacum L. жизненный цикл составляет 4-5 месяцев, н их массовое цветение обычно начинается через ?. месяца после высадки рассады в открытый ipyirr, что ограничивает время проведения экспериментов при выращивании растений в поле. В связи с этим представляют интерес формы табака с укороченным жизненным циклом, в частности, недавно выделенные в Исследовательском центре табака университета Северной Каролины (США) формы RF (rapid flowering). Согласно приведенному описанию (McDaniel, 1999), их жизненный цикл составляет около 11 недель, и цветение начинается в среднем через 53-55 дней после посева семян (при выращивании растений в оранжерее). Взрослые растения характеризуются небольшими размерами, что облегчает их содержание в оранжерее и расширяет возможности проведения экспериментальных работ с этой культурой.
Цель настоящей работы заключалась в изучении морфологических и ци-тоэмбриологических особенностей Rí-форм в условиях Саратова и оценки пер спектив их использования в качестве модельных объектов для эмбриогенети-ческих исследований.
Материал и методы
Объектом изучепия служили две формы табака RF1 и RF3, семена которых были любезно предоставлены профессором Verne Sisson университета Северной Каролины (США). Для сравнения была использована гомозиготная линия БГ-6, полученная в отделе генетики и цитологии Ботанического сада СГУ. Исследовалось по 5 растений каждого генотипа.
