CC BY
1312021, т. 11, № 2
УДК: 578.834.1:616-092 DOI: 10.37279/2224-6444-2021-11-2-88-105
СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ В ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ВИРУСОМ SARS-COV-2
Хайтович А. Б., Ткач В. В., Ткач А. В.
Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии, Медицинская академия имени С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского», 295051, бульвар Ленина 5/7, Симферополь, Россия
Для корреспонденции: Хайтович Александр Борисович, доктор медицинских наук, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Медицинской академии имени С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского», e-mail: [email protected]
For correspondence: Khaitovich Alexander Borisovich, MD, Professor of the Department of Microbiology, Virusology and Immunology, Medical Academy named after S.I. Georgievsky of Vernadsky CFU, e-mail: [email protected]
Information about authors:
Khaitovich A. B., http://orcid.org/0000-0001-9126-1182 Tkach V. V., http: // orcid.org/0000-0002-3455-8809 Ikach А.^, http://orcid.org/0000-0002-9234-3021
РЕЗЮМЕ
В статье представлен обзор современных методов лабораторной диагностики заболеваний, вызванных вирусом SARS-COV-2. Представлена сравнительная характеристика методов, применяемых для выявления вирусов SARS-COV-2 и специфических антител. Описаны показания для их использования, преимущества, недостатки, эффективность в зависимости от поставленных медицинских и эпидемиологических задач. Указаны варианты интерпретации полученных результатов лабораторных исследований с учетом временных изменений относительно начала проявления симптомов заболевания.
Ключевые слова: SARS-COV-2, COVID-19, методы амплификации, ОТ-ПЦР RT-LAMP, серологические методы, ИФА, ИХА, метод CRISPR
SPECIFIC LABORATORY METHODS IN DIAGNOSTICS OF INFECTION CAUSED BY THE SARS-COV-2 VIRUS
Khaitovich A. B., Tkach V. V, Тkach А/V.
Medical Academy named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia
SUMMARY
The article provides an overview of modern methods of laboratory diagnosis of diseases caused by the SARS-COV-2 virus. A comparative description of the methods used to detect SARS-COV-2 viruses and specific antibodies is presented. The indications for their use, advantages, disadvantages, efficacy, depending on the medical and epidemiological tasks, are described. The options for the interpretation of the results of laboratory studies, taking into account the time changes relative to the onset of the manifestation of the symptoms of the disease, are indicated.
Key words: SARS-COV-2, COVID-19, amplification methods, RT-LAMP, RT-PCR, serological methods, ELISA, IHA, CRISPR method
В настоящее время одна из мировых проблем - новая коронавирусная инфекция СОУГО-19, распространение которой приняла масштабы пандемии и продолжается больше года. Из-за отсутствия этиотропных методов лечения СОУГО-19 и в начальной стадии пандемии вакцин, самыми действенными мерами для снижения распространения 8ЛЯ8-СоУ-2 были раннее выявление и изоляция зараженных пациентов, что возможно только при эффективной и своевременной диагностике СОУГО-19. Несмотря на появления вакцин в настоящее время и до периода появления коллективного иммунитета в различных регионах, одной из актуальных задач в борьбе с пандемией является проведе-
ние специфической лабораторной диагностики 8ЛЯ8-СоУ-2 как ключевого аспекта установления этиологии патологического процесса и бессимптомного носительства, контроля эпидемического распространения инфекции, проведения противоэпидемических мероприятий, разработки стратегий защиты жизни и здоровья населения.
Первые случаи пневмонии не установленной этиологии были обнаружены в декабре 2019 г. в г. Ухань, Китай [1]. 7 января 2020 г. китайским ученым удалось выявить ранее неизвестный коронавирус [2]. 11 февраля 2020 года исследовательская группа по коронавирусу Международного Комитета объявила официальное на-
звание нового вируса SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome Coronavirus 2) [3; 4; 5; 6]. Заболевание, вызываемое SARS-CoV-2, получило название COVID-19 (COrona Virus Disease 2019, коронавирусное заболевание 2019) [7]. С середины января 2020 г. в базе данных ГенБанка были представлены последовательности генома Wuhan seafood market pneumonia virus (www. ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Открытие возбудителя и его молекулярно-генетическая структура явились научной основой создания различных диагностических тест-систем, которые определили современную систему лабораторной диагностики вируса SARS-CoV-2, возбудителя нового заболевания известного в настоящее время как COVID-19.
За небольшой промежуток времени (несколько месяцев) в разных странах мира были решены и продолжают совершенствоваться в настоящее время теоретические и практические вопросы лабораторной диагностики коронавирусной инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2. Все специфические лабораторные исследования, применяемые на современном этапе для диагностики COVID-19, можно разделить на две большие группы: прямые - обнаружение возбудителя и непрямые - обнаружение иммунного ответа человека на контакт с возбудителем.
На настоящий момент лабораторная диагностика включает: вирусоскопический метод (изучение вируса в электронно-микроскопическом исследовании); вирусологический метод (индикация и идентификация вируса); молекулярно-генетический метод (группа методов, позволяющая обнаружить в исследуемом материале РНК вирусов, мутации генов); иммунохимические методы для обнаружения антигенов (выявление в секретах и другом материале белков вируса); серологический метод (определение антител в сыворотках крови). В разработке находится аллергологический метод (диагностика, проводимая для определения индивидуальной переносимости организмов химических веществ -аллергенов).
Материалом для лабораторных исследований являются: респираторный материал (мазок из носо- и ротоглотки, мокрота, эндотрахеаль-ный аспират или бронхоальвеолярный лаваж), фекалии, моча, конъюнктивальные секреты - для методов амплификации нуклеиновых кислот (исследование осуществляют в 1-й, 3-й и 11-й дни); сыворотка крови - для серологических методов (на 1-й и 14-й день). Для выявления антигенов вируса чаще используют образцы материала из верхних дыхательных путей. Отмечено, что образцы из нижних дыхательных путей более информативны для исследования,
поскольку содержат более высокое количество нуклеиновых кислот вируса, что обусловлено с преимущественным поражением при СОУГО-19 альвеолярных клеток II типа. Комбинированное тестирование, включающее образцы отделяемого из дыхательных путей, фекалий, крови и др. повышает чувствительность диагностики у пациентов с подозрением на новую коронави-русную инфекцию [8; 9]. Для забора материала необходимо использовать соответствующие средства индивидуальной защиты, вирусные зонд-тампоны (стерильный Дакрон или тампон из вискозы, но не из хлопка) и транспортную среду для вирусного материала, содержащую противогрибковые и антибиотические добавки [10].
Вирусоскопический метод. 8ЛЯ8-СоУ-2 относится к семейству Betacoronavirus и представляет собой одноцепочечный РНК-содержащий вирус. Под электронным микроскопом имеет круглую или эллиптическую, часто плеоморф-ную форму с шиповидными отростками длиной 9 - 12 нм, образующими вокруг вирусной частицы «корону». Диаметр вирусной частицы варьирует от 60 до 140 нм (рис.1) [11].
Рис. 1. Первое электронно-микроскопическое изображение коронавируса SARS-CoV 2, полученное учеными Китайского центра по контролю и профилактике заболеваний (Chinese Center for Disease Control and Prevention, CCDC) [11].
Вирусологический метод. Для выделения SARS-CoV-2 использовались образцы секрета дыхательных путей от больных COVID-19, которые инокулировали в культуре клеток Vero E6 - линия перевиваемых клеток (клон Vero 76), применяющейся в качестве клеток-хозяев для
выращивания вируса. Цитопатические эффекты проявлялись через 3 суток (рис.2) [12; 13; 14] в виде образования везикул, окруженных двойной мембраной [15]. Эти везикулы, по-видимому, являются аутофагосомами, которые не сливаются с лизосомами [16]. Индукция апоптоза в SARS-CoV-2 инфицированных клетках линии Vero E6 была подтверждена морфологическими и биохимическими анализами [17]. Известно, что в индукции апоптоза участвуют неструктурные белки SARS-CoV-2, обеспечивающие репликацию вируса [18, 19]. Структурные белки SARS-CoV-2 N (nucleocapsid), E (envelope), M (membrane) и S (spike) также обладают способностью вызывать апоптоз in vitro [20]. Посев культуры вируса осуществляется в лаборатории с уровнем биобезопасности 3 (BSL-3), что соответствует 2 группе патогенности по российской классификации. Идентификация вируса проводится с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), полного секвенирования генома и электронной микроскопии.
Рис. 2. Клетки Vero инфицированные SARS-CoV-2 под оптическим и электронным микроскопом [12]. Условные обозначения. А. Исходная культура клеток Vero. Б. Цитопатические эффекты клеток
Vero, вызванные SARS-CoV-2 (3-и сутки после инокуляции) В и Г. Электронные микрофотографии тонких срезов клеток Vero, инфицированных SARS-CoV-2. Белые стрелки указывают на агрегаты внутриклеточных вирионов.
В настоящее время ВОЗ не рекомендует культивирование вируса в качестве рутинной диагностической процедуры, поскольку данный метод требует много времени и ресурсов. Кроме того, манипуляции с живыми вирусными культурами сопровождаются риском распростране-
ния и циркуляции вирусов внутри лабораторных учреждениях. Однако выделение вирусов все же проводить необходимо для разработки некоторых тестов для диагностики 8ЛЯ8-СоУ-2, приготовления цельновирионных убитых вакцин и некоторых других типов, проверки эффективности лекарственных препаратов и вакцин при появлении мутаций и т.д.
Молекулярно-генетические методы включают: полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и ее виды, петлевую изометрическую амплификацию в виде технологии LAMP-реакции, секве-нирование, биологическое микрочипирование, технологию СЯКРЯ.
Полимеразная цепная реакция. Для выявления РНК вируса 8ЛЯЗ-СоУ-2 широко применяются методы амплификации, для проведения которых выпускаются как наборы, предназначенные для лабораторного использования, так и тест-системы, и устройства, позволяющие проводить диагностику инфицирования 8ЛЯ8-СоУ-2 вне лабораторий, на месте оказания помощи (Рот^о^Саге - РОС).
«Золотым стандартом» диагностики СОУГО-19 является ОТ-ПЦР, который применяется для рутинного подтверждения случаев заболевания. Выявление РНК 8ЛЯ8-СоУ-2 этим методом включает три этапа: экстракцию РНК из образцов исследуемого материала, реакцию обратной транскрипции и амплификацию участка кДНК данного коронавируса с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, которая производится непосредственно в ходе ПЦР. Для экстракции суммарной РНК вируса предпочтительно использовать метод фильтрующей колонки и метод магнитных шариков. Метод «кипящего раствора» относительно низок по эффективности выделения нуклеиновой кислоты, что может привести к неправильному обнаружению, поэтому его не рекомендуется использовать.
Реакция обратной транскрипции проводится с целью образования комплементарной ДНК (кДНК) на матрице РНК. Затем с полученными пробами кДНК проводится реакция амплификации участков при помощи специфичных к этим участкам кДНК праймеров и фермента Taq-полимеразы. В составе реакционной смеси присутствуют флуоресцентно меченые олиго-нуклеотидные зонды, которые гибридизуются с комплементарными участками амплифицируе-мых мишеней кДНК, в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции. Это позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала [21; 22; 23; 24].
В качестве целевых мишеней рекомендуется использовать несколько генов: нуклеокапсида мелкой мембраны (Е), «протеиновых шипов» и специфической РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRP). Поскольку происходят новые мутации в геноме вируса ЗЛЯЗ-СоУ-2, для
повышения надежности диагностики в качестве мишеней используют комбинацию 2-3 специфических генов. В разных странах мира для детекции РНК-вируса используются разные гены вирусов, которые кодируют разные белки (таблица 1). [9; 25 - 27].
Таблица 1
Определение генов-мишеней у SARS-CoV-2 в тест-системах ПЦР, используемых в некоторых странах ведущими производителями
Страна и организация Рекомендуемые гены-мишени
Китай, China CDC N (nucleocapsid phosphoprotein), ORFlab
Германия, Charite N, E (envelope protein), RdRP (ORFlab)
Гонконг, Гонконгский университет (HKU) N, ORF1b-nsp14
Япония, National Institute of Infectious Diseases S (surface glycoprotein), ORFla, ORFlO
США US CDC, Atlanta N (три варианта набора олигонуклеоитидов для выявления последовательности гена N)
Франция, Париж, Институт Пастера, Two targets in RdRP
Таиланд, Национальный Институт Здоровья N
Россия, ООО НПФ «Литех» RdRp, Е
Россия, ООО «ДНК-Технология ТС» N, E (1), Е (2)
Россия, ООО «Компания Алкор Био» ORFlab, ORF8, N
Россия, Компания «ИнтерЛабСервис» upE геном MERS-Cov и ген Pol SARS-Cov
Россия, Институт «Вектор» ORFla
В настоящее время известно в мире более тысячи тест-систем для ПЦР-диагностики, которые имеют разные гены мишени, только в Российской Федерации разные институты, фирмы производят около 400 тест-систем. По данным, которые приводятся в наставлениях, их чувствительность составляет от 103 до 105 копий на 1 мл. Праймеры зонда RdRp-SARSr (Charité) имеет несколько более низкую чувствительность [22]. Однако сравнительного и оценочного изучения различных тест-систем для ПЦР по генам-мишеням в исследуемом материале до настоящего времени вероятно не проводилось и отсутствуют результаты такого исследования в доступной научной литературе. Поэтому интерпретировать результаты ПЦР у пациентов, особенно при выполнении исследований в разных лабораториях в некоторых случаях достаточно сложно. Однако следует отметить, что принципиальных различий в использовании поиска специфических генов в разных странах нет.
В последние несколько месяцев предложен количественный тест ПЦР для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале, первый в России, который создали сотрудники научной группы разработки новых методов диагностики острых респираторных заболеваний
Центрального научно-исследовательского института (ЦНИИ) эпидемиологии Роспотребнад-зора. Количественное содержание РНК ЗЛЯЗ-СоУ-2 можно определять в любых биологических материалах человека: мазках из носо- и ротоглотки, мокроте, фекалиях, плазме крови и других образцах. Этот анализ важен не только для выявления заразившихся и их своевременной изоляции, но и для больных с признаками поражения легких [28].
Интерпретация ПЦР анализа. У большинства пациентов с СОУГО-19 вирусная РНК в мазке из носоглотки, измеренная с помощью порогового цикла (количества циклов репликации, необходимых для получения флуоресцентного сигнала), обнаруживается за три дня до появления симптомов и достигает пика в течение первой недели их появления. Чем ниже значения порогового цикла, тем выше нагрузки вирусной РНК. Значение порогового цикла менее 40 клинически регистрируется как ПЦР положительный результат. Эта позитивность начинает снижаться к третьей неделе и впоследствии становится незаметной. Однако, значения порогового цикла, полученные у тяжелобольных госпитализированных пациентов, ниже, чем значения при легких случаях тече-
ния болезни. Положительная ПЦР-активность может сохраняться и после 3-х недель с начала заболевания, когда большинство легких случаев уже дают отрицательный результат. Однако «положительный» результат ПЦР отражает только обнаружение вирусной РНК и не обязательно указывает на наличие жизнеспособного вируса. Преимуществами ПЦР являются высокая чувствительность и специфичность, по сравнению с другими методами и технологиями, тем не менее у метода ПЦР есть и существенные недостатки, такие как дорогостоящее оборудование для амплификации, довольно сложные методы обнаружения и анализа результатов, дорогостоящие наборы реагентов.
Существенную проблему специфической диагностики СОУГО-19 составляют ложнопо-ложительные и ложноотрицательные результаты исследований, которые могут быть связаны как с объективными факторами (изменчивостью вируса, развитием инфекционного процесса, чувствительностью и специфичностью наборов и тест-систем), так и с субъективными факторами (ошибками при выполнении операционных процедур на преаналитических и аналитических этапах исследований, неправильным выбором методов исследований).
К появлению ложноотрицательных результатов приводит ряд факторов: низкое качество образцов; образец был взят слишком рано или слишком поздно в течение заболевания; при обращении с образцом или в ходе его транспортировки не были соблюдены необходимые требования; технические факторы, связанные с выполнением теста, например, мутация вируса или ингибирование ПЦР. Поскольку выделение РНК в хорошем качестве в потоковом режиме выделения представляет собой очень сложную задачу, существует вероятность того, что РНК из образца может быть повреждена, и ПЦР станет недостаточно эффективной. Наличие ингибиторов ПЦР в образце биологического материала может быть причиной сомнительных (неопределённых) результатов. К ингибиторам ПЦР, источником которых может являться образец нуклеиновой кислоты, по результатам анализа рисков отнесены следующие вещества: гемоглобин, присутствующий в образце РНК в результате неполного удаления в ходе выделения РНК из образца биоматериала, содержащего примесь крови, а также изопропиловый спирт и метилацетат, присутствующие в образце РНК в результате неполного удаления промывочных растворов в ходе пробоподготовки. Примеси, содержащиеся в образце биоматериала, такие как слизь, кровь, элементы тканевого распада и воспаления, местные лекарственные препараты,
в том числе содержащиеся в назальных спреях и др. удаляются в ходе выделения нуклеиновой кислоты с использованием комплектов/наборов для пробоподготовки. Для снижения количества ингибиторов ПЦР необходимо соблюдать правила взятия биологического материала. При подозрении на наличие в образце большого количества ингибиторов ПЦР рекомендуется выбирать методы выделения нуклеиновых кислот, позволяющие максимально удалить ингибиторы ПЦР из образца, не рекомендуется использовать экспресс-методы выделения нуклеиновых кислот [24].
Диапазон вирусной нагрузки SARS-CoV-2 может варьировать в широких пределах от очень низких значений (104 и менее копий/мл) в биоматериале от лиц с бессимптомным носитель-ством и лиц на стадии выздоровления до крайне высоких значений (более 109 копий/мл) в биоматериале от пациентов с клинической картиной острой вирусной пневмонии. В связи с этим, при выполнении исследований в клинической лаборатории серьезную опасность представляет риск кросс-контаминации между образцами на всех этапах работы, особенно при аликвотировании и выделении РНК. Перекрестная контаминация высококопийным биоматериалом может приводить к появлению спорадических ложноположи-тельных результатов.
Для повышения чувствительности ПЦР-тест система должна содержать в своем составе внутренний контрольный образец, который добавляется во все пробы для контроля правильности выделения РНК и реакции обратной транскрипции [29]. Отсутствие такого контроля может также потенциально приводить к некоторому количеству ложноотрицательных результатов.
Положительным считают результат при обнаружении относительного числа копий хотя бы одной специфической последовательности РНК ЗЛЯЗ-СоУ-2 в образцах носоглотки или мокроты. Регулярное определение последовательности вируса в образцах из клинических материалов может быть полезным для мониторинга мутаций вирусного генома, способных повлиять на эффективность диагностических тестов, и указывает на наличие различных генотипов вируса в образцах верхних и нижних дыхательных путей пациента [30].
Секвенирование. Для пациентов с подозрением на СОУГО-19, в дополнение к традиционному ПЦР-анализу, используют стратегию макрогеномного обнаружения (mNGS), основанную на технологии секвенирования, с непосредственным извлечением нуклеиновых кислот всех микроорганизмов в зараженных образцах для высокопроизводительного секвенирования.
Путем сравнения специальной микробной базы данных с интеллектуальным алгоритмом анализа получают информацию о видах подозреваемых патогенных микроорганизмов и одновременно обнаруживают различные респираторные патогены, включая вирус SARS-CoV-2, обеспечивая более точную и всестороннюю картину заражения. Высокотехнологичное решение позволяет наблюдать за изменениями генома вируса и появлению новых мутаций и оперативно реагировать на них. Изменения генома вируса оказывают прямое влияние как на эффективность создаваемых вакцин и используемых методов диагностики и лечения, так и на его вирулентность и трансмиссивность [31]. Контролировать быстро меняющуюся ситуацию помогут мониторинг генетических изменений и своевременная передача данных в общую международную базу EpiCoV GISAID.
Технология секвенирования включает следующие этапы: экстракцию нуклеиновых кислот из образца биоматериала, секвенирование, биоинформационный анализ и получение результатов тестирования, их интерпретация.
Среди используемых протоколов секвенирования чаще всего в мире используется ARTIC Network, основанная на реагентах зарубежных производителей с длительными сроками поставки, что отражается на оперативности проведения исследований. Кроме того, глубина покрытия генома SARS-CoV-2 оказывается неравномерной, что снижает качество данных о некоторых областях генома. В России был создан консорциум (CoRGI), который разработал тест-систему Parseq Lab, прошедшую апробацию в ФГБУ «НИИ гриппа им А.А. Смородинцева» Минздрава России и выявила ряд преимуществ: за счет использования большего количества более коротких ампликонов, по сравнению с протоколом ARTIC Network, добиться более равномерного покрытия генома SARS-Cov-2; проанализировать больше образцов в 2 раза; сократить временные затраты на анализ; стандартизировать анализ данных; создать набор в основном отечественных реагентов; разработать специальное программное обеспечение для обработки данных используя адаптированное программное обеспечение; позволить существенно облегчить обработку данных, подвести анализ под единые алгоритмы и стандарты. Все это является базой для широкого внедрения секвенирования нового поколения геномов SARS-CoV-2 в различные научные и диагностические учреждения и лаборатории России [32].
Изотермическая амплификация. Альтернативный подход к амплификации специфического образца ДНК, который не требует изменения
температуры реакционной смеси, и поэтому называется изотермической амплификацией. Проведение изотермической амплификации требует намного меньше времени и не требует прибора -амплификатора, что делает методику особенно удобной для применения в нестационарных условиях и во время приема пациента. Преимущества методики: быстрый протокол, минимальное количество требуемого оборудования, надежное проведение реакции в присутствии ингибиторов полимерации, простая оптическая детекция прохождения реакции. Одним из нескольких существующих вариантов изометрической амплификации является LAMP-реакция - это метод специфической диагностики, который называется петлевая изотермальная амплификация RT-LAMP (reverse transcriptioncoupled - Loop-Mediated Isothermal Amplification) и позволяет проводить обратную транскрипцию и амплификацию в одной пробирке, без переноса жидкости. Сущность данного метода заключается в удвоении участка нуклеиновой кислоты с высокой специфичностью, эффективностью и скоростью в условиях постоянной температуры. Амплификацию проводят с помощью четырех - шести специально подобранных праймеров, что обеспечивает высокую специфичность реакции, так как они узнают 6 или 8 последовательностей-мишеней, что в 10 раз превышает чувствительность стандартной ПЦР [24].
Для LAMP-амплификации достаточно меньше 10 копий целевого участка в исходной реакционной смеси. И иногда из-за меньшей чувствительности к примесям и ингибиторам в качестве образца можно использовать даже грубые лизаты и биологические жидкости. Преимуществами метода петлевой изотермальной амплификации также являются: сокращение времени анализа образцов (более чем в 3 раза) за счет сокращения числа стадий предварительной подготовки. Конечные результаты анализа можно получить уже через 15 - 60 минут; простота - выполняется в один этап, легко визуализировать конечные продукты; экономическая эффективность - не требуется специальных дорогостоящих реагентов и оборудования [33] Сравнительная характеристика методов амплификации приведена в таблице 2.
Биологические микрочипы. Еще одним способом обнаружения коронавируса является тест на основе микрочипов. Биологические микрочипы представляют собой совокупность ячеек, расположенных на поверхности стекла или пластика. На матрице-подложке биочипа расположено множество ячеек с гидрогелем (диаметр ячейки около 100 мкм, на одном квадратном сантиметре размещается до тысячи ячеек). В ячейках содержатся молекулы-зонды (фрагменты ДНК,
2021 т 11 № 2 крымскии журнал экспериментальной и клиническои медицины
Таблица 2
Сравнительная характеристика ПЦР и LAMP
Характеристика ПЦР LAMP
Предварительный этап денатурации нуклеиновой кислоты (НК) Необходим Не нужен
Температурный режим Требует термоциклирования Изотермический (обычно 65°C)
Специфичность Средняя (2 праймера) Высокая (4-6 праймеров)
Чувствительность к примесям Высокая Как правило, требуется выделение НК Более низкая Выделение НК требуется не всегда
Степень амплификации 109 раз (30 циклов) 109-1010 раз
Время реакции 45 мин - > 3 ч 5 - 60 мин
Приборы Дорогой амплификатор Недорогой термоблок, термостат или водяная баня
РНК-матрица Предварительный этап обратной транскрипции, дополнительный фермент обязателен Обратная транскрипция при той же температуре, дополнительный фермент необязателен
Визуальные методы детекции Нет Есть
РНК, белки). Каждая ячейка является аналогом микропробирки, в которой происходит реакция между молекулами-зондами и молекулами исследуемой пробы [34].
Когда молекулы подходят друг к другу как ключ к замку, происходит гибридизация - соединение молекул с помощью химических связей. Ячейка, в которой произошла реакция, флуоресцирует, потому что пробу предварительно обрабатывают светящейся меткой. С помощью обратной транскриптазы РНК коронавируса продуцирует кДНК, меченную специфическими зондами. Затем эти меченные кДНК помещаются в лунки и гибридизуются с твердофазными олигонуклеотидами, закрепленными на микрочипе с последующей промывкой для удаления свободных ДНК. В результате РНК коронавиру-са может быть определена путем исследования специфических зондов [35].
Технология CRISPR. Перспективным направлением в диагностике COVID-19 являются тесты, основанные на методе CRISPR (clustered regularly interspaced short palindrom ic repeats), например, SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing - специфический высокочувствительный ферментативный репортер разблокировки). CRISPR - система представляет собой локусы бактерий, архей и вирусов, состоящие из прямых повторяющихся последовательностей, которые разделены уникальными по своей структуре спейсерами. Тесты основаны на способности системы CRISPR узнавать специфические геномные участки и вырезать их с помощью нуклеаз - Cas-белков. Метод SHERLOCK основан на использовании
Cas13 для детекции РНК вируса в концентрации от 10 - 100 молекул РНК на микролитр [36]. Исследователи, работающие с этой технологией, считают, что в дальнейшем возможно применение платформы SHERLOCK вместо специфических ПЦР-анализов. Тест имеет высокую аналитическую специфичность и чувствительность и позволяет проводить количественное определение геномной РНК. Время от загрузки материала до получения результата 5 - 30 минут. Постановка метода в данном варианте требует очень высокой чистоты реагентов и окружающего пространства в связи с возможным перекрестным загрязнением гетерогенными нукле-азами, существенно искажающими результаты исследования. В данный момент этой технологией тестировались только образцы очищенной вирусной РНК, поэтому адаптировать метод для тестирования реальных клинических образцов ещё предстоит [37 - 39].
Иммунохимические методы определения антигенов. При возникновении ситуаций, в которых методы амплификации нуклеиновых кислот недоступны, либо их применение клинически нецелесообразно ввиду длительного времени выполнения, для диагностики инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, допускается использование иммунохимических экспресс-тестов, которые позволяют непосредственно выявлять в секрете дыхательных путей белки вируса, синтезирующиеся в ходе репликации. Большинство таких тест-систем основаны на называемой сэндвич-схеме иммуноанализа с применением латерального проточного метода. Устройство состоит из пластиковой тест-кассеты с лунками
для образца и буфера, полоски с мембраной на основе нитрата целлюлозы с нанесенной на ней тестовой линией (сорбированы специфические антитела против комплексов определяемого антигена с конъюгированными антителами), а также контрольной линией (сорбированы специфические антитела против конъюгированных антител). Благодаря удобству применения и короткому времени, которое необходимо для выполнения теста, такие экспресс-тесты могут способствовать переходу к децентрализованным схемам проведения тестирования пациентов, у которых возникают первые симптомы заболевания, за счет расширения масштабов тестирования и увеличения темпов диагностической работы. Однако, эти тесты имеют меньшую чувствительность по сравнению с методами амплификации нуклеиновых кислот. Согласно исследованиям, при использовании данных тестов для анализа образцов материала из верхних дыхательных путей наблюдался крайне большой разброс чувствительности в диапазоне 0 - 94% [40 - 49], тогда как специфичность оставалась стабильно высокой (более 97%). Наилучшая эффективность применения наблюдаются у пациентов с высокой вирусной нагрузкой (значение С <25 или >106 копий вирусного генома/мл), как правило, находящихся на предсимптомной (1-3 дня до появления симптомов) или в начале манифестной (первые 5-7 дней болезни) стадии заболевания [50; 51]. Спустя 5-7 дней от момента появления симптомов заболевания имеется высокая вероятность снижения вирусной нагрузки у пациентов, и при обследовании с использованием иммунохимических экспресс-тестов возрастает вероятность получения ложноотрица-тельных результатов [10].
Для правильной интерпретации результатов диагностических экспресс-тестов и принятия рациональных мер необходимо располагать сведениями о распространенности заболевания по данным эпиднадзора, так как эта информация определяет прогностическую ценность положительного и отрицательного результата. Меньшая, по отношению к методам амплификации нуклеиновых кислот, ожидаемая чувствительность этих экспресс-тестов не позволяет их применять для скрининга. Однако возможность быстрого (в течение 20 минут) получения результата, при высокой специфичности, возможно идентифицировать носителя инфекции в случае получения положительного результата и приступить к соответствующим лечебным и противоэпидемиологическим мероприятиям. Отрицательный результат такого экспресс-теста должен быть обязательно перепроверен в исследовании методом амплификации нуклеи-
новых кислот. Объем накопленных в настоящее время фактических данных в отношении эффективности и практического применения иммуно-химических экспресс-тестов для определения в исследуемом материале вируса 8ЛЯ8-СоУ-2 недостаточен и требует дальнейшего изучения.
Серологические методы включает набор технических приемов: иммунохроматографиче-ский анализ (ИХА), иммуноферментный анализ (ИФА), иммунохемилюминесцентный анализ (ИХЛА), определение вируснейтрализующих антител.
Инфекция СОУГО-19 может быть обнаружена косвенно - путем изучения иммунного ответа организма человека на проникновение вирус 8ЛЯ8-СоУ-2. Чтобы ответить на вопрос, подвергался ли человек воздействию 8ЛЯ8-СоУ-2 и развился ли у него иммунный ответ, используют тесты на выявление антител к данному вирусу. В их основе лежат методы иммуноферментного анализа, иммунохроматографии и их аналогов, появившиеся позже молекулярно-генетических методов выявления 8ЛЯ8-СоУ-2, так как для их разработки требуются знания о тех белках вируса 8ЛЯ8-СоУ-2, на которые реагирует иммунная система человека. Но для этого необходимо время, чтобы изучить строение вируса.
Серологические исследования целесообразно осуществлять с диагностической, эпидемиологической, лечебной и профилактической целями.
Диагностическая цель использования серологических методов исследования: во-первых если клиническое и эпидемиологическое подозрение на СОУГО-19 у пациента существует и продолжает сохраняться, но ПЦР-исследование не проводилось или дало отрицательный либо неопределенный результат, то для доказательной оценке состояния патологического процесса у пациента и объективного клинического диагноза необходимо определение различных антител - ^М, IgG, ^А к вирусу 8ЛЯБ-СоУ-2; во-вторых - для оценки уровня антител к вирусу у медицинского персонала, работающего с больными СОУГО-19 необходимо определение ^М, IgG, ^А.
В эпидемиологических исследованиях серологические методы используются: для обследования популяции и определения доли переболевших, перенесших инфекцию без симптомов, не контактировавших с возбудителем (определение IgG); при оценке инфицированности контактных при отсутствии обнаружения РНК вируса и т.д.
Для решения профилактических задач серологические методы применяются: при разработке, испытаниях и контроле эффективности вакцин (определение IgG) и оценки состояния коллективного иммунитета в регионе.
В лечебных целях результаты серологических тестов помогают идентифицировать потенциальных доноров реконвалесцентной плазмы (один из методов лечения тяжелых больных COVID-19) [30].
Иммунохроматографический анализ (ИХА). Быстрыми методами определения сывороточных антител для выявления вирусных белков являются Point-of-care (РОС) - «прикроватные» тесты с использованием метода ИХА (RDT (боковой по-ток)/иммунохроматографический анализ). В POC - тестах могут выявляться IgG или IgG и IgM, или общие антитела в сыворотке, плазме, цельной крови и/или слюне. Важные преимущества - возможность использования капиллярной крови, быстрое исполнение. В зависимости от реагентов выявляют антитела IgG, IgM и IgA. Иммунохроматогра-фические экспресс-тесты нашли широкое применение в местах оказания медицинской помощи, они используются в диагностике COVID-19 для качественного выявления антител и указывают только на наличие или отсутствие антител IgM и IgG против SARS-CoV-2. Портативность тест-кассеты и быстрота исполнения (результат в течение 10-30 минут) делают эти тесты удобными для использования в point-of-care, начиная с 3-го дня появления симптомов заболевания. Результаты иммунохроматографического теста не должны использоваться в качестве единственного критерия для диагностики инфекции COVID-19, особенно при отрицательных результатах.
Иммуноферментный анализ (ИФА/ELISA). Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА/ ELISA) в диагностике COVID-19 на текущий период времени разработан в качественном и количественном вариантах. В качестве материала для ИФА-исследования используют образцы сыворотки или плазмы крови. В результате положительной реакции образуется окрашенный продукт окисления, производящий результирующий сигнал, отражающий наличие специфических антител в образце пациента. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию в образце антител к SARS-CoV-2. При диагнозе COVID-19 методом ИФА наиболее часто определяют наличие у пациента антитела IgM или IgG к SARS-CoV-2, это самый чувствительный тест определения антител в сыворотках крови.
Иммунохемилюминесцентный анализ (CLIA/ ИХЛА). ИХЛА является аналогом ИФА. В диагностике у пациентов с COVID-19 позволяет определить количественный уровень содержания антител IgM или IgG к штамму SARS-CoV-2 коронавируса в клиническом образце (сыворотке, гепаринизи-рованной или цитратной плазме) на автоматизированных анализаторах. Принцип реакции: двух-стадийный сэндвич-метод.
Лабораторные тесты методами ELISA/ИФА (иммуноферментный анализ) и CLIA/ИХЛА (иммунохемилюминесцентный анализ) для выявления антител требуют обученного персонала и специального оборудования. Используются в лабораторных условиях, обеспечивая высокий уровень качества и незаменимы при массовом скрининге. Существуют разнообразные решения, варьирующие по аналитическим характеристикам чувствительности и специфичности, уровня автоматизации, операционной эффективности, производительности, скорости выдачи результатов, подключению к информационным решениям и пр.
Интерпретация результатов. Определение уровня антител в диагностике СОУГО-19 позволяет определить различные фазы инфекционного процесса (рис. 3) [52]. ^А начинают формироваться и доступны для детекции примерно со 2 дня от начала заболевания, достигают пика через 2 недели и сохраняются длительное время. ^М начинают выявляться примерно на 7-е сутки от начала заражения, достигают пика через неделю и могут сохраняться в течение 2-х месяцев и более.
Примерно с 3-й недели или ранее определяются IgG к 8АЯ8-СоУ-2 [53]. Активная фаза
Рис. 3. Результаты выявления антигенов и антител на различных этапах инфекционного процесса COVID-19 [52].
устанавливается при выявлении диагностически значимого уровня ^А или ^М в единственном образце или значимым нарастанием уровня IgG в парных сыворотках, взятых с интервалом в 2-4 недели. Фаза сероконверсии характеризуется тем, что антитела могут не выявляться в первичном образце, но выявляются во взятых через несколько дней образцах. Если концентрация ^А и ^М существенно снижается (падение титра в 2-4 раза) во время выздоровления, при сохраняющихся IgG через 2 недели после курса лечения и позднее позволяет говорить о фазе реконвалес-
ценции. Перенесенная инфекция характеризуется персистенций IgG без роста его уровня в парных сыворотках и отсутствие ^А и ^М. Определение уровня IgG в высоких титрах через 4 недели после вакцинации позволяет подтвердить наличие поствакцинального иммунитета [54].
Серологическая диагностика особенно важна для пациентов с легкой и средней степенью тяжести заболевания с поздними проявлениями симптомов - через две недели после попадания вируса. Кроме того, определение антител становится важным инструментом для понимания степени распространения СОУГО-19 среди населения и выявления лиц, обладающих иммунитетом и потенциально «защищенных» от заражения (оценка иммунного статуса популяции) [55].
Как правило, обнаружение специфических антител после заражения 8ЛЯ8-СоУ-2 указывает на то, что существует стимуляция антигена, которая не всегда связана с развитием инфекционного процесса, поэтому этот метод является эффективным дополнением к обнаружению нуклеиновых кислот и является лишь косвенным доказательством проникновения в организм ЗЛШ-СоУ-2.
Потенциальной проблемой описанных методов диагностики является вероятность получения ложноположительных результатов за счет иммунного ответа на другие коронавирусы, поскольку все вирусные белки в определенной степени будут вызывать реакцию образования антител. Не исключаются и ложноотрицатель-ные ответы, которые могут быть при исследовании биологических образцов, взятых на серо-негативном этапе развития инфекции, или при обследовании пациентов со сниженным иммунитетом. Ложноположительные и ложноотрица-тельные результаты могут также появляться при нарушении правил проведения лабораторных исследований на всех этапах.
Для минимизации ложноположительных результатов рекомендуется ввести алгоритм последовательного тестирования пациентов, у которых получены первоначальные положительные результаты на антитела классов ^М/^А или IgG, с использованием другого теста. С этой целью необходимо использовать тест-систему с максимальными чувствительностью и специфичностью, а также с одновременным выявлением антител классов ^А, ^М, IgG, которая будет играть роль референтной (верифицирующей) тест-системы. В качестве такой тест-системы может использоваться тест-система для выявления рецептор-связывающего домена поверхностного гликопротеина S у 8ЛЯБ-СоУ-2.
Определение вируснейтрализующих антител. Анализ «нейтрализации антител» приме-
няется для определения наличия у пациента эффективных (вируснейтрализующих) антител и защитного иммунитета против COVID-19, так как дает количественную информацию о способности антител пациента. В сыворотке крови людей, иммунизированных или перенесших вирусное заболевание, обнаруживаются антитела, способные нейтрализовать инфекционные свойства вируса. Эти антитела выявляются при смешивании сыворотки с соответствующим вирусом и последующем введении этой смеси в культуру клеток. На основании отсутствия ци-топатического действия вируса судят о нейтрализующей способности антител. Эта реакция в условиях in vitro широко используется для определения вида или типа вируса и титра нейтрализующих антител на этапе идентификации вируса в вирусологическом методе. Метод исследования трудоемкий, по времени занимает до 5 дней, не рекомендуется в качестве обычной диагностической процедуры. В диагностике COVID-19 применяют 2 типа нейтрализаци-онных тестов: вирус-нейтрализационный тест (VNT), такой как plaque-reduction neutralization (PRNT)/нейтрализация бляшкообразования или микро-нейтрализация, когда используется SARS-CoV-2 вирус из клинического изолята или рекомбинант SARS-CoV-2 expressing reporter proteins; а также псевдовирус-нейтрализацион-ный тест (pVNT), при котором используется ре-комбинантный псевдовирус (подобно vesicular stomatitis virus, VSV) с инкорпорированным S белком SARS-CoV-2. Результат анализа нейтрализации антител демонстрирует способность плазмы или сыворотки пациента, перенесшего COVID-19, оказывать нейтрализующее действие на вирус в условиях живой культуры in vitro. В настоящее время этот метод применяется, главным образом, для научных целей [56, 57].
В России в настоящее время зарегистрировано 327 различных тест-систем для выявления SARS-CoV-2, включая контрольные материалы для подтверждения воспроизводимости и правильности определения SARS-CoV-2. На 276 тест-систем, из которых, установлен срок государственной регистрации до 01.01.2022 года, пролонгирована временная регистрация до 1 мая 2022 г. Должны быть внесены поправки в постановление Правительства РФ №507 от 15 апреля 2020 года, регламентирующее временный порядок обращения тест-систем. В перечень входят:
• 69 наборов реагентов для качественного и количественного выявления антител к SARS-CoV-2, методом иммуно-ферментного анализа, среди которых: иммуноферментноe выявление специфических антител класса IgG (32 набора);
иммуноферментное выявление специфических иммуноглобулинов класса IgM (19 наборов); иммуноферментное выявление специфических иммуноглобулинов класса IgA (5 наборов); иммуноферментное выявление суммарных антител IgG/IGM (9 наборов); иммуноферментное выявление суммарных антител IgM-IgG-IgA (4 набора).
• 66 наборов реагентов для иммунохро-матографического выявления антител к SARS-CoV-2, (быстрые тесты), среди которых: иммунохроматографический анализ для качественного обнаружения общих антител IgM и IgG (63 набора); иммунохроматографический анализ для качественного обнаружения антител IgG (2 набора); метод латерального потока (1 набор).
• 89 наборов реагентов для выявления антител иммунохемилюминесцентным методом, среди которых: иммунохемилю-минесцентный метод выявления антител класса IgG (21 набор); иммунохемилю-минесцентный метод выявления антител класса IgM (19 наборов); иммунохемилю-минесцентный метод выявления общих антител класса IgM/IgG (20 наборов).
• 38 наборов контрольных материалов для подтверждения воспроизводимости и правильности качественного определения антител класса (IgG)/(IgM).
• 44 набора реагентов для выявления антигена SARS CoV-2, среди которых: экспресс-тесты для обнаружения антигена вируса SARS-CoV-2 в мазках из носоглотки методом иммунохроматографического анализа (37 набора); иммуноферментное определение нуклеокапсидного антигена SARS-CoV-2 (3 набора).
• 2 набора реагентов для иммунодиагно-стического определения антигена усиленной хемилюминесценции (2 набора).
• 2 набора контрольных материалов для качественного определения антигена ну-клеокапсидного белка SARS-CoV-2 (2 набора).
• 50 наборов реагентов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 методом ПЦР, включая контрольные материалы для подтверждения воспроизводимости и правильности определения мРНК SARS-CoV-2 [58].
Перспективные методы лабораторной диагностики. Специалисты НМИЦ гематологии и НИИ имени Л. Пастера в Санкт-Петербурге создаются тесты, чтобы выявлять Т-лимфоциты, за-
щищающие от СОУГО-19, даже при отсутствии антител. Технология позволит подтверждать перенесенную коронавирусную инфекцию в спорных случаях и будет использована для оценки эффективности вакцинации от СОУГО-19. Известно, что Т-лимфоциты хранят информацию о ранее выявленных иммунной системой в организме антигенах и формируют долговременный иммунитет к перенесенным инфекционным заболеваниям, особенно это характерно для вирусных инфекций. Проведенные исследования показали, что Т-лимфоциты, специфичные к 8АЯ8-Соу-2 обнаруживаются у людей, которые перенесли инфекцию бессимптомно и не выработали антитела, их выявляют в образцах крови, взятых еще до пандемии. Это связано с перекрестным иммунитетом, вызванным ранее перенесенными циркулировавшими коронавирусными инфекциями. У переболевших, особенно легко и бессимптомно не вырабатываются антитела, а Т-лимфоциты присутствуют. Исследования показывают, что уже через полгода у значительной части переболевших количество антител сильно снижается, а у некоторых они исчезают. Т-клеточный ответ потенциально сохраняется гораздо дольше, но провести скрининг сложно, из-за технических трудностей - отсутствия простого метода определения специфических Т-лимфоцитов. Для этого разрабатывается тест-система. Эта технология основана на методе выявления реагирующих на вирус Т-лимфоцитов, конкретным набором фрагментов коронавирус-ных белков, не дающих ложно-позитивную реакцию Т-клеток [59].
Другой тест для оценки клеточного иммунитета пациенту относится к варианту аллерго-логического метода, когда внутрикожно вводят специальный искусственный антиген к коро-навирусу, после чего наблюдают за реакцией. Образование папулы, как при реакции Манту, означает положительный результат, то есть у пациента есть Т-клеточный иммунитет. На интенсивность иммунной реакции указывает размер образовавшейся припухлости, которую медицинский работник измеряет линейкой и принимает решение о необходимости вакцинации [60].
Таким образом, существуют различные специфические методы лабораторной диагностики СОУГО-19. Какие использовать из этих методов для клинической и эпидемиологической диагностики, чаще определяется не объективными критериями: патогенезом заболевания или эпидемической ситуацией, а возможностями лабораторной службы в конкретном регионе и территории. Поэтому на качество и достоверность лабораторного исследования влияют не существующий арсенал методов, который со-
временный, хорошо технически оснащенный и научно-обоснованный, а конкретно для каждого региона организация лабораторной службы, ее оснащенность и подготовленность специалистов проводить исследования на современном методическом уровне.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Методы лабораторной диагностики являются основными в установлении специфического происхождения заболеваний, особенно это важно при диагностике инфекционных заболеваний. Современный уровень достоверной лабораторной диагностики достаточно высокий и основан на современных методах в основе которых лежат достижения науки в молекулярной биологии, генетике, иммунологии, биотехнологии, микробиологии, вирусологии, физики, химии и т.д. Эти достижения как раз и позволили достаточно быстро обеспечить расшифровку этиологической причины новой коронавирус-ной инфекции. Однако, как и имеющийся исторический опыт было показано, что без широкого использования в каждой стране современной лабораторной базы, оснащенной современными технологиями не решит проблемы широкого использования лабораторных методов только силами крупных научно-исследовательских центров. Огромное количество больных в разном клиническом состоянии и носителей инфекции требует мощной и широко территориально разпо-ложенной лабораторной базы в каждом регионе страны на уровне области или крупного города, а также овладение специалистами лабораторной службы методическими и техническими приемами многих лабораторных методов.
Мировой опыт этиологической диагностики СОУГО-19 доказывает необходимость сочетания молекулярно-генетических и специфических иммунологических лабораторных тестов. Для их проведения выпускаются в разных странах, в том числе и в Российской Федерации, как наборы, предназначенные для лабораторного использования, так и тест-системы, и устройства, позволяющие проводить диагностику инфицирования ЗЛЯЗ-СоУ-2 вне лабораторий, на месте оказания помощи, т.е. необходим спектр методов и арсенал технических приемов для разных видов диагностики. Происходящая пандемия, вызванная СОУГО-19, не только подтвердила, но и показала необходимость обратить внимание на состояние лабораторной службы в структуре каждого региона.
На современном этапе рекомендуемый алгоритм лабораторной специфической диагностики СОУГО-19 включает выявление РНК ЗЛЯЗ-СоУ-2 (тест-система, ориентированная на две/
три мишени генома вируса) методом ОТ-ПЦР/ изотермальная амплификация и серологическое исследование на специфические антитела IgM, IgG, IgA. Интерпретация результатов исследований методами амплификации нуклеиновых кислот и определения антител к SARS-CoV-2 должна проводиться с учетом анамнеза, эпидемиологических и клинических данных.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ryu S., Chun B. C. An interim review of the epidemiological characteristics of 2019 novel coronavirus. Epid. He alth. 2020;42:2020006. doi:10.4178/epih.e2020006.
2. Wu F., Zhao S., Yu B., Chen Y. M., Wang W., Song Z. G., Hu Y., Tao Z. W., Tian J. H., Pei Y. Y., Yuan M. L., Zhang Y .L., Dai F. H., Liu Y., Wang Q. M., Zheng J. J., Xu L., Holmes E. C., Zhang Y. Z. A new coronavirus associated with human respiratory diseasein China. Nature. 2020;579(7798):265-269. doi:10.1038/s41586-020- 2008-3.
3. Gorbalenya A. E. Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus - The species and its viruses,a statement of the Coronavirus Study Group. Available at February 11, 2020; Accessed: February 13, 2020. doi:10.1101/2020.02.07.937862.
4. World Health Organization. Coronavirus disease 2019 (COVID-19) Situation Report - 48. World Health Organization. Available at: https:// www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/ situationreports/20200308-sitrep-48-covid19. pdf?sfvrsn =16f7 ccef.
5. CDC. 2019 Novel Coronavirus, Wuhan, China: 2019 Novel Coronavirus (2019-nCoV) in the U. S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Available at: https://www.cdc. gov/coronavirus/2019- ncov/cases-in-us.html.
6. Otto M A. Wuhan Virus: What Clinicians Need to Know. Medscape Medical News. January 27, 2020. Available at: https://www.medscape.com/ viewarticle/924268.
7. World Health Organization. Novel Coronavirus (2019-nCoV). Novel Coronavirus (2019-nCoV) Situation Report11 (31 January 2020). Available at: https://www. who.int/docs/defaultsource/coronaviruse/ situation-reports/20200131-sitrep-11-ncov. pdf?sfvrsn=de7c0f7_4.
8. Временные методические рекомендации. Профилактика, диагностика и лечение новой короновирусной инфекции (COVID-19). Министерство здравоохранения Российской Федерации. Версия 11. Москва, 2021.
9. WHO. Coronavirus disease (COVID-19) technical guidance: Surveillance and case definitions. Electronic resource. Available at: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus2019/technicalguidance /surveillance-and-case-definitions.
10. Временное руководство по лабораторной диагностике COVID-19 в условиях пандемии: Методические рекомендации № 89. М.: ГБУ «НИИОЗММ ДЗМ», 2020.
11. China's CDC releases first image of new coronavirus, shares genetic info with Japan, Thailand. Electronic resource. Available at: https:// amp.ibtimes.sg/chinas-cdc-releases-first-image-new-coronavirus-shares-genetic-info-japan-thailand-38238.
12. Kim J. M., Chung Y. S., Jo H. J. Identification of Coronavirus Isolated from a Patient in Korea with COVID-19.Osong Public Health and Research Perspectives. 2020. 11(1):3-7. doi:10.24171/j. phrp.2020.11.1.02.
13. Drosten C., Gunther S., Preiser W. et al. Identifi cation of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N. Engl. J. Med. 2003;348:1967-1976. doi:10.1056/ NEJMoa030747.
14. Sims A. C., Baric R. S., Yount B. Severe acute respiratory syndrome coronavirus infection of human ciliated airway epithelia: role of ciliated cells in viral spread in the conducting airways of the lungs. J. Virol. 2005; 79: 15 511-524. doi: 10.1128/ JVI.79.24.15511-15524.2005.
15. de Wilde A. H., Raj V. S., Oudshoorn D., Bestebroer T. M., van Nieuwkoop S., Limpens R. W. MERS-coronavirus replication induces severe in vitro cytopathology and is strongly inhibited by cyclosporin A or interferon-alpha treatment. J. Gen. Virol. 2013;94 (Pt 8):1749-1760. doi:10.1099/ vir.0.052910-0.
16. Cottam E. M., Whelband M. C., Wileman T. Coronavirus NSP6 restricts autophagosome expansion. Autophagy. 2014;10(8):1426-4141. doi:10.4161/auto.29309.
17. He L., Ding Y., Zhang Q. Expression of elevated levels of pro-infl ammatory cytokines in SARSCoV-infected ACE2+ cells in SARS patients: relation to the acute lung injury and pathogenesis of SARS. J. Pathol. 2006;210:288-297. doi:10.1002/ path.2067.
18. Yan H., Xiao G., Zhang J. SARS coronavirus induces apoptosis in Vero E6 cells. J. Med. Virol. 2004;73:323-331. doi:10.1002/jmv.20094.
19. Tan Y. J., Fielding B. C., Goh P-Y. Overexpression of 7a, a protein specifi cally encoded by the severe acute respiratory syndrome coronavirus, induces apoptosis via a caspase-
dependent pathway. J. Virol. 2004;78:14043-14047. doi: 10.1128/JVI.78.24.14043-14047.2004.
20. Law P. T., Wong C. H., Au T. C. The 3a protein of severe acute respiratory syndrome associated coronavirus induces apoptosisin Vero E6 cells. J. Gen. Virol. 2005; 86: 1921-1930. doi. org/10.1099/vir.0.80813-0.
21. Corman V. M., Landt O., Kaiser M., Molenkamp R., Meijer A., Chu D. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by realtime RT-PCR. Eurosurveillance. 2020;25(3):2431. doi:10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.
22. Zhou P., Yang X.-L., Wang X.-G., Hu B., Zhang L., Zhang W. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020;579(7798):270-273. doi: 10.1038/s41586-020-2012-7.
23. National Institute for Viral Disease Control and Prevention (China). Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus. Beijing: National Institute for Viral Disease Control and Prevention (China); 21 Jan 2020.Chinese. Available at: http://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/ t20200121_211337.htm.
24. Хайтович А. Б., Ткач А. В. Молекулярно-генетические методы диагностики инфекционных заболеваний: методическое пособие. Симферополь: Издательский дом КФУ; 2021.
25. U.S. Department of Health & Human Services (2020) Real-Time RT-PCR Panel for Detection 2019-Novel Jan 2020. Available at: https://www.cdc.gov/coronavirus/ 2019-ncov/ downloads/rt-pcr-panel-for-detection-instructions. pdf. Accessed 28 Jan 2020 Coronavirus. 24.
26. U.S. Department of Health & Human Services (2020) 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-time rRT-PCR Panel Primers and Probes. 24 Jan 2020. Available at: https://www. cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/downloads/rt-pcr-panel-primer-probes.pdf Accessed 28 Jan 2020.
27. Мавзютов А. Р., Гарафутдинов Р. Р., Хали-кова Е. Ю. и др. Проблемные аспекты диагностики коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 с помощью обратно-транскрипционной ПЦР. Биомика. 2020;12(4):564-590. doi:10.31301/2221-6197.bmcs.2020-50.
28. В Роспотребнадзоре создали тест для определения количества коронавируса в биоматериале. Available at: https://news.rambler. ru/science/46003652/ ?utm_content=news_ media&utm_medium = read_more&utm_ source=copylink.
29. В Роспотребнадзоре создали тест для определения количества коронавируса в биоматериале. Available at: https://news.rambler.ru/ science/46003652-v-rospotrebnadzore-sozdali-
test-dlyaopredeleniya-kolichestva-koronavirusa-v-biomateriale/.
30. Набор реагентов «ПЦР-РВ-2019-nCov». Available at: https://www.syntol.ru/catalog/nabory-reagentov-dlya-ptsr-v-realnom-vremeni/nabor-reagentov-ptsr-rv-2019-ncov.html.
31. Interim Guidelines for COVID-19 Antibody Testing in Clinical and Public Health Settings, CDC. May, 2020. Available at: www.cdc.gov/ coronavirus/2019-ncov/lab/resources/antibody-tests-guidelines.html.
32. Хайтович А. Б. Коронавирусы (таксономия, структура вируса). Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. 2020;10(3):69-81. doi:10.37279/2224-6444-2020-10-3-69-81.
33. Первая отечественная тест-система для секвенирования полного генома коронавируса SARS-CoV-2. Available at: https://genetics-info.ru/ news/pervaya-otechestvennaya-test-sistema-dlya-sekvenirovaniya-polnogo-genoma-koronavirusa-sars-cov-2-/.
34. Zhang Y., Odiwuor N., Xiong J., Sun L., Nyaruaba R. O., Wei Н., Tanner N. A. Rapid Molecular Detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) Virus RNA Using Colorimetric LAMP. doi:10.110 1/2020.02.26.20028373.
35. Ласточкина О. В., Горелова П. В. Биологические микрочипы - новый уровень лабораторных исследований. Аналитика. 2017;5(36):76-86. doi: 10.22184/2227-572X.2017.36.5.76.86.
36. Hardick J., Metzgar D., Risen L. et al. Initial performance evaluation of a spotted array Mobile Analysis Platform (MAP) for the detection of influenza A/B, RSV, and MERS coronavirus, Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2018;91:245-247. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2018.02.011.
37. Wright A. V., Nunez J. K., Doudna J. A. Biology and applications of CRISPR systems:harnessing nature's toolbox for genome engineering. Cell. 14;164(1-2):29-44. doi: 10.1016/j.cell.2015.12.035.
38. Gootenberg J. S., Abudayyeh O. O., Lee J. W. Nucleic acid detection with CRISPRCas13a/ C2c2, Science. 2017;356(6336):438-442. doi: 10.1126/science.aam9321.
39. Freije C. A., Myhrvold C., Boehm C. K. et al., Programmable inhibition and detection of RNA viruses using Cas13, Mol. Cell. 2019;76:826-837. doi: 10.1016/j.molcel.2019.09.013.
40. Gootenberg J. S., Abudayyeh O. O., Kellner M. J. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6, Science. 2018; 360(6387):439-444. doi:10.1126/ science.aaq0179.
41. Porte L., Legarraga P., Vollrath V., Aguilera X., Munita J. M., Araos R. Evaluation of novel
antigen-based rapid detection test for the diagnosis of SARS-CoV-2 in respiratory samples. Int J Infect Dis. 2020:S1201-9712(20)30405-7. doi: 10.1016/j. ijid.2020.05.098.
42. Diao B., Wen K., Chen J., Liu Y., Yuan Z., Han C. Diagnosis of Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Infection by Detection of Nucleocapsid Protein. medRxiv. 2020:2020.03.07.20032524. doi:10.1101/2020.03. 07.20032524.
43. Lambert-Niclot S., Cuffel A., Le Pape S., VauloupFellous C., Morand-Joubert L., Roque-Afonso A. M. et al. Evaluation of a Rapid Diagnostic Assay for Detection of SARS-CoV-2 Antigen in Nasopharyngeal Swabs. J Clin Microbiol. 2020;58(8). doi:10.1128/JCM.00977-20.
44. Mertens P., De Vos N., Martiny D., Jassoy C., Mirazimi A., Cuypers L. Development and Potential Usefulness of the COVID-19 Ag Respi-Strip Diagnostic Assay in a Pandemic Context. Front Med (Lausanne). 2020;7:225-234. doi: 10.3389/fmed.2020.00225.
45. Blairon L., Mokrane S., Wilmet A., Dessilly G., Kabamba-Mukadi B., Beukinga I. Large-scale, molecular and serological SARS-CoV-2 screening of healthcare workers in a 4-site public hospital in Belgium after COVID-19 outbreak. J Infect. 2020:S0163- 4453(20)30514-4. doi: 10.1016/j. jinf.2020.07.033.
46. Mak G. C., Cheng P. K., Lau S. S., Wong K. K., Lau C. S. , Lam E. T. Evaluation of rapid antigen test for detection of SARS-CoV-2 virus. Journal of clinical virology : the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 2020;129:104500. doi: 10.1016/j.jcv.2020.104500.
47. Nagura-Ikeda M., Imai K., Tabata S. , Miyoshi K., Murahara N., Mizuno T. et al. Clinical evaluation of selfcollected saliva by RT-qPCR, direct RT-qPCR, RT-LAMP, and a rapid antigen test to diagnose COVID-19. J Clin Microbiol. 2020:JCM.01438-20. doi: 10.1128/JCM.01438-20.
48. Omi K., Takeda Y., Mori M. SARS-CoV-2 qRT-PCR Ct value distribution in Japan and possible utility of rapid antigen testing kit. medRxiv. doi: 10.1101/2020.06.16.20131243.
49. Scohy A., Anantharajah A., Bodeus M., KabambaMukadi B., Verroken A., Rodriguez-Villalobos H. Low performance of rapid antigen detection test as frontline testing for COVID-19 diagnosis. J Clin Virol. 2020;129:104455. doi: 10.1016/j.jcv.2020.104455.
50. Weitzel T., Legarraga P., Iruretagoyena M., Pizarro G., Vollrath V., Araos R. et al. Head-to-head comparison of four antigen-based rapid detection tests for the diagnosis of SARS-CoV-2 in respiratory samples. bioRxiv. doi:10.1101/2020.05.27.119255.
51. Weiss A., Jellingsо M., Sommer M. A. Spatial and temporal dynamics of SARS-CoV-2 in COVID-19 patients: A systematic review and metaanalysis. EBioMedicine. 58:102916. doi:10.1016/j. ebiom.2020.102916.
52. Arons M. M., Hatfield K. M., Reddy S. C., Kimball A. , James A. , Jacobs J. R. et al. Presymptomatic SARS-CoV-2 Infections and Transmission in a Skilled Nursing Facility. New England Journal of Medicine. 2020;382(22):2081-2090. doi: 10.1056/NEJMoa2008457.
53. Sethuraman N., Jeremiah S. S., Ryo A. Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2. JAMA. May 6.2020. doi:10.1001/jama.2020.825.
54. Хайтович А. Б., Ермачкова П. А. Патогенез COVID-19. Таврический медико-биологический вестник. 2020;23(4):112-131.
55. Zhou P., Yang X.-L., Wang X.-G., Hu B., Zhang L., Zhang W. et al. Discovery of a novel coronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in 2 humans and its potential bat origin. bioRxiv. 2020. doi:10.1038/s41586-020-2012-7.
56. Subbaraman N. Coronavirus tests: researchers chase new diagnostics to fight the pandemic. Nature. 2020. doi:10.1038/d41586-020-00827-6.
57. Wu F. , Wang A, Liu M., Wang Q. , Chen J., Xia S. et al. Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in a COVID-19 recovered patient cohort and their implications. medRxiv.2020. doi: 10.1101/2020.03.30.20047365.
58. Перечень тест-систем для выявления ко-ронавируса 2 (SARS-CoV-2) в России. Электронный ресурс. Available at: https://intermedika.ru/ article/polnyj-perechen-diagnosticheskih-testov-dlja.
59. В России создают тест на определение Т-клеточного иммунитета к коронавирусу. Available at: https://blood.ru/smi-o-nas/2016-v-rossii-sozdayut-test-na-opredelenie-t-kletochnogo-immuniteta-k-koronavirusu.html.
60. Кожная проба покажет наличие клеточного иммунитета. Электронный ресурс. Available at: https://www.pasteurorg.ru/article/261/3395/ Areg-Totolyan-Kozhnaya-proba-pokazhet-nalichie-kletochnogo-immuniteta.
REFERENCES
1. Ryu S., Chun B. C. An interim review of the epidemiological characteristics of 2019 novel coronavirus. Epid. He alth. 2020;42:2020006. doi:10.4178/epih.e2020006.
2. Wu F., Zhao S., Yu B., Chen Y. M., Wang W., Song Z. G., Hu Y., Tao Z. W., Tian J. H., Pei Y. Y., Yuan M. L., Zhang Y. L., Dai F. H., Liu Y., Wang Q. M., Zheng J. J., Xu L., Holmes E. C., Zhang Y. Z. A new coronavirus associated with human
respiratory diseasein China. Nature. 2020.03 Feb;579(7798):265-269. doi: 10.1038/s41586-020-2008-3.
3. Gorbalenya A. E. Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus - The species and its viruses,a statement of the Coronavirus Study Group. Available at February 11, 2020; Accessed: February 13, 2020. doi.org/10.1101/2020.02.07.937862.
4. World Health Organization. Coronavirus disease 2019 (COVID-19) Situation Report - 48. World Health Organization. Available at: https:// www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/ situationreports/20200308-sitrep-48-covid19. pdf?sfvrsn =16f7 ccef.
5. CDC. 2019 Novel Coronavirus, Wuhan, China: 2019 Novel Coronavirus (2019-nCoV) in the U. S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Available at: https://www.cdc. gov/coronavirus/2019- ncov/cases-in-us.html.
6. Otto M A. Wuhan Virus: What Clinicians Need to Know. Medscape Medical News. January 27, 2020. Available at https://www.medscape.com/ viewarticle/924268.
7. World Health Organization. Novel Coronavirus (2019-nCoV). Novel Coronavirus (2019-nCoV) Situation Report11 (31 January 2020). Available at: https://www. who.int/docs/defaultsource/coronaviruse/ situation-reports/20200131-sitrep-11-ncov. pdf?sfvrsn=de7c0f7_4.
8. Temporary guidelines.Prevention, diagnosis and treatment of new coronovirus infection (COVID-19). Ministry of Health of the Russian Federation. Version 11. Moscow, 2021 (In Russ).
9. WHO. Coronavirus disease (COVID-19) technical guidance: Surveillance and case definitions. Electronic resource. Available at: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus 2019/technicalguidance/surveillance-and-case-definitions.
10. Interim guidelines for laboratory diagnostics of COVID-19 in the context of a pandemic: Methodological recommendations No. 89. Moscow: SBU «NIIOZMM DZM», 2020 (In Russ).
11. China's CDC releases first image of new coronavirus, shares genetic info with Japan, Thailand. Electronic resource. URL: https:// amp.ibtimes.sg/chinas-cdc-releases-first-image-new-coronavirus-shares-genetic-info-japan-thailand-38238.
12. Kim J. M., Chung Y. S., Jo H. J. et al. Identification of Coronavirus Isolated from a Patient in Korea with COVID-19.Osong Public Health and Research Perspectives. 2020. 11(1):. 3-7. doi.org/10.24171/j.phrp.2020.11.1.02
13. Drosten C., Gunther S., Preiser W. et al. Identifi cation of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N. Engl. J. Med. 2003; 348: 1967-1976. doi: 10.1056/ NEJMoa030747.
14. Sims A. C., Baric R. S., Yount B. et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus infection of human ciliated airway epithelia: role of ciliated cells in viral spread in the conducting airways of the lungs. J. Virol. 2005;79:15 511-524. doi: 10.1128/JVI.79.24.15511-15524.2005.
15. de Wilde A. H., Raj V. S., Oudshoorn D., Bestebroer T. M., van Nieuwkoop S., Limpens R. W. et al. MERS-coronavirus replication induces severe in vitro cytopathology and is strongly inhibited by cyclosporin A or interferon-alpha treatment. J. Gen. Virol. 2013;94(Pt 8):1749-1760. doi:10.1099/vir.0.052910-0
16. Cottam E. M., Whelband M. C., Wileman T. Coronavirus NSP6 restricts autophagosome expansion. Autophagy. 2014; 10 (8):1426-4141. doi: 10.4161/auto.29309.
17. He L., Ding Y., Zhang Q. Expression of elevated levels of pro-infl ammatory cytokines in SARSCoV-infected ACE2+ cells in SARS patients: relation to the acute lung injury and pathogenesis of SARS. J. Pathol. 2006;210:288-297. doi: 10.1002/ path.2067.
18. Yan H., Xiao G., Zhang J. SARS coronavirus induces apoptosis in Vero E6 cells. J. Med. Virol. 2004;73:323-331. doi:10.1002/jmv.20094.
19. Tan Y-J., Fielding B. C., Goh P-Y. et al. Overexpression of 7a, a protein specifi cally encoded by the severe acute respiratory syndrome coronavirus, induces apoptosis via a caspase-dependent pathway. J. Virol. 2004;78:14043-14047. doi: 10.1128/JVI.78.24.14043-14047.2004.
20. Law P. T., Wong C. H., Au T. C. The 3a protein of severe acute respiratory syndrome associated coronavirus induces apoptosisin Vero E6 cells. J. Gen. Virol. 2005; 86: 1921-1930. doi. org/10.1099/vir.0.80813-0.
21. Corman V. M., Landt O., Kaiser M., Molenkamp R., Meijer A., Chu D. et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by realtime RT-PCR. Eurosurveillance. 2020;25(3):2431. doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.
22. Zhou P., Yang X.-L., Wang X.-G., Hu B., Zhang L., Zhang W. et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020;579(7798):270-273. doi: 10.1038/s41586-020-2012-7
23. National Institute for Viral Disease Control and Prevention (China). Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus. Beijing: National Institute for Viral Disease Control and Prevention (China); 21 Jan 2020.
Chinese. Available from: http://ivdc.chinacdc.cn/ kyjz/202001/t20200121_211337.htm
24. Khaitovich A. B., Tkach A.V. Molecular-genetic methods for the diagnosis of infectious diseases: a methodological guide. Simferopol: KFU Publishing House, 2021(In Russ.).
25. U.S. Department of Health & Human Services (2020) Real-Time RT-PCR Panel for Detection 2019-Novel Jan 2020. Available at: https://www.cdc.gov/coronavirus/ 2019-ncov/ downloads/rt-pcr-panel-for-detection-instructions. pdf (accessed 28 Jan 2020Coronavirus. 24).
26. U.S. Department of Health & Human Services (2020) 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-time rRT-PCR Panel Primers and Probes. 24 Jan 2020. Available at: https://www. cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/downloads/rt-pcr-panel-primer-probes.pdf (accessed 28 Jan 2020).
27. Mavzyutov A. R., Garafutdinov R. R., Khalikova E. Yu. et al. Problematic aspects of the diagnosis of SARS-CoV-2 coronavirus infection by back-transcriptional PCR. Biomics. 2020;12(4):564-590. doi:10.31301/2221-6197. bmcs.2020-50 (In Russ.).
28. Rospotrebnadzor has created a test to determine the amount of coronavirus in biomaterial. Electronic resource. URL: https://news.rambler.ru/ science/46003652/? Utm_content = news_media & utm_medium = read_more & utm_source = copylink (In Russ.).
29. Rospotrebnadzor has created a test to determine the amount of coronavirus in biomaterial. Available at: https://news.rambler.ru/ science/46003652-v-rospotrebnadzore-sozdali-test-dlya opredeleniya-kolichestva-koronavirusa-v-biomateriale (In Russ.).
30. Set of reagents «PCR-RV-2019-nCov». Available at: https://www.syntol.ru/catalog/nabory-reagentov-dlya-ptsr-v-realnom-vremeni/nabor-reagentov-ptsr-rv-2019-ncov.html (In Russ.).
31. Interim Guidelines for COVID-19 Antibody Testing in Clinical and Public Health Settings, CDC (May, 2020). Available at: www.cdc.gov/ coronavirus/2019-ncov/lab/resources/antibody-tests-guidelines.html.
32. Khaitovich A. B. Coronaviruses (taxonomy, structure of the virus). Crimean Journal of Experimental and Clinical Medicine. 2020;10(3):69-81. doi: 10.37279/2224-6444-2020-10-3-69-81(In Russ.).
33. The first domestic test system for sequencing the complete genome of the SARS-CoV-2 coronavirus. Available at: https://genetics-info.ru/ news/pervaya-otechestvennaya-test-sistema-dlya-sekvenirovaniya-polnogo-genoma-koronavirusa-sars-cov-2-/(In Russ.).
34. Zhang Y., Odiwuor N., Xiong J., Sun L., Nyaruaba R. O., Wei H., Tanner N. A. Rapid Molecular Detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) Virus RNA Using Colorimetric LAMP. doi:10.110 1/2020.02.26.20028373.
35. Lastochkina O. V., Gorelova P. V. Biological microchips - a new level of laboratory research. Analytics.2017; 5(36):76-86. doi: 10.22184/2227-572X.2017.36.5.76.86 (In Russ.).
36. Hardick J., Metzgar D., Risen L. Initial performance evaluation of a spotted array Mobile Analysis Platform (MAP) for the detection of influenza A/B, RSV, and MERS coronavirus, Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2018;91:245-247. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2018.02.011.
37. Wright A. V., Nunez J. K., Doudna J. A. Biology and applications of CRISPR systems:harnessing nature's toolbox for genome engineering. Cell 14;164(1-2):29-44. doi: 10.1016/j. cell.2015.12.035.
38. Gootenberg J. S., Abudayyeh O. O., Lee J. W. et al. Nucleic acid detection with CRISPRCas13a/ C2c2, Science. 2017;356(6336):438-442. doi: 10.1126/science.aam9321.
39. Freije C. A., Myhrvold C., Boehm C. K. Programmable inhibition and detection of RNA viruses using Cas13, Mol. Cell. 2019;76:826-837. doi: 10.1016/j.molcel.2019.09.013.
40. Gootenberg J. S., Abudayyeh O. O., Kellner M. J. et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6, Science.2018; 360(6387):439-444. doi: 10.1126/ science.aaq0179.
41. Porte L., Legarraga P., Vollrath V., Aguilera X., Munita J. M., Araos R. Evaluation of novel antigen-based rapid detection test for the diagnosis of SARS-CoV-2 in respiratory samples. Int J Infect Dis. 2020:S1201- 9712(20)30405-7. doi: 10.1016/j. ijid.2020.05.098.
42. Diao B., Wen K., Chen J., Liu Y., Yuan Z., Han C. Diagnosis of Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Infection by Detection of Nucleocapsid Protein. medRxiv. 2020:2020.03.07.20032524. doi:10.1101/2020.03. 07.20032524.
43. Lambert-Niclot S., Cuffel A., Le Pape S., VauloupFellous C., Morand-Joubert L., Roque-Afonso A. M. et al. Evaluation of a Rapid Diagnostic Assay for Detection of SARS-CoV-2 Antigen in Nasopharyngeal Swabs. J Clin Microbiol. 2020;58(8). doi:10.1128/JCM.00977-20.
44. Mertens P., De Vos N., Martiny D., Jassoy C., Mirazimi A., Cuypers L. Development and Potential Usefulness of the COVID-19 Ag Respi-Strip Diagnostic Assay in a Pandemic Context. Front Med (Lausanne). 2020;7:225-234. doi: 10.3389/fmed.2020.00225.
45. Blairon L., Mokrane S., Wilmet A., Dessilly G., Kabamba-Mukadi B., Beukinga I. et al. Large-scale, molecular and serological SARS-CoV-2 screening of healthcare workers in a 4-site public hospital in Belgium after COVID-19 outbreak. J Infect. 2020:S0163- 4453(20)30514-4. doi: 10.1016/j.jinf.2020.07.033.
46. Mak G. C., Cheng P. K., Lau S. S., Wong K. K., Lau C. S. , Lam E. T. et al. Evaluation of rapid antigen test for detection of SARS-CoV-2 virus. Journal of clinical virology : the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 2020;129:104500 doi: 10.1016/j.jcv.2020.104500.
47. Nagura-Ikeda M., Imai K., Tabata S. , Miyoshi K., Murahara N., Mizuno T. et al. Clinical evaluation of selfcollected saliva by RT-qPCR, direct RT-qPCR, RT-LAMP, and a rapid antigen test to diagnose COVID-19. J Clin Microbiol. 2020:JCM.01438-20. doi: 10.1128/JCM.01438-20.
48. Omi K., Takeda Y., Mori M. SARS-CoV-2 qRT-PCR Ct value distribution in Japan and possible utility of rapid antigen testing kit. medRxiv. doi: 10.1101/2020.06.16.20131243.
49. Scohy A., Anantharajah A., Bodeus M., KabambaMukadi B., Verroken A., Rodriguez-Villalobos H. Low performance of rapid antigen detection test as frontline testing for COVID-19 diagnosis. J Clin Virol. 2020;129:104455. doi: 10.1016/j.jcv.2020.104455.
50. Weitzel T., Legarraga P., Iruretagoyena M., Pizarro G., Vollrath V., Araos R. et al. Head-to-head comparison of four antigen-based rapid detection tests for the diagnosis of SARS-CoV-2 in respiratory samples. bioRxiv. doi. org/10.1101/2020.05.27.119255.
51. Weiss A., Jellingso M., Sommer M. A. Spatial and temporal dynamics of SARS-CoV-2 in COVID-19 patients: A systematic review and metaanalysis. EBioMedicine. 58:102916. doi:10.1016/j. ebiom.2020.102916.
52. Arons M. M., Hatfield K. M., Reddy S. C., Kimball A. , James A. , Jacobs J. R. et al. Presymptomatic SARS-CoV-2 Infections and Transmission in a Skilled Nursing Facility. New England Journal of Medicine. 2020;382(22):2081-2090. doi: 10.1056/NEJMoa2008457.
53. Sethuraman N., Jeremiah S. S., Ryo A. Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2 JAMA. May 6.2020. doi:10.1001/jama.2020.825.
54. Khaitovich A. B., Ermachkova P. A. Pathogenesis of COVID-19. Tavrichesky medico-biological Bulletin. 2020;23(4):112-131 (In Russ.).
55. Zhou P., Yang X.-L., Wang X.-G., Hu B., Zhang L., Zhang W. Discovery of a novel coronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in 2 humans and its
potential bat origin. bioRxiv. 2020. doi: 10.1038/ s41586-020-2012-7.
56. Subbaraman N. Coronavirus tests: researchers chase new diagnostics to fight the pandemic. Nature. 2020. doi:10.1038/d41586-020-00827-6.
57. Wu F., Wang A, Liu M., Wang Q. , Chen J., Xia S. Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in a COVID-19 recovered patient cohort and their implications. medRxiv.2020. doi:10.1101/20 20.03.30.20047365.
58. List of test systems for detecting coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in Russia. (In Russ.). Available
at: https://intermedika.ru/article/polnyj-perechen-diagnosticheskih-testov-dlja.
59. A test is being created in Russia to determine T-cell immunity to coronavirus. (In Russ.). Available at: https://blood.ru/smi-o-nas/2016-v-rossii-sozdayut-test-na-opredelenie-t-kletochnogo-immuniteta-k-koronavirusu.html.
60. A skin test will show the presence of cellular immunity. (In Russ.). Available at: https://www. pasteurorg.ru/article/261/3395/Areg-Totolyan-Kozhnaya-proba-pokazhet-nalichie-kletochnogo-immuniteta
