CC BY
11
son of c-GTH and a gonadotropin from Acipenser stel-latus pall // Gen. Comp. Endocrinol. 29(4), (1976), 498505.
3. F. Franks, in: G.J. Morris, A. Clarke (Eds.). Effects of Low Temperature on Biological Membranes // Academic Press, London., 1981, pp. 3-19.
4. D.E. Hare and C.M. Sorensen. Interoscillator coupling effects on the OH stretching band of liquid water // J. Chem. Phys. 96(1), (1992), 13.
5. V. Konyukhov, A. Prokhorov, V. Tikhonov, V. Fai-sulaev. Rotationally selective condensation of heavy water in a supersonic carbon dioxide jet // JETP Lett. 43, (1986), 85.
6. S. M. Pershin. Two-liquid water // Physics of Wave Phenomena 13(4), (2005), 192-208.
7. S.M. Pershin. Harmonic oscillations of the concentration of H-bond in liquid water // Laser Physics 16(7), (2006), 1-7.
8. S. M. Pershin. Harmonic oscillations of the concentration of H-bonds in liquid water // Laser Physics 16(8), (2006), 1184-1190.
9. R.T. Pfaff, Y. Agca, Jun Liu, E. J.Woods, A. T. Peter, and J. K. Critser. Cryobiology of Rat Embryos I: Determination of Zygote Membrane Permeability Coefficients for Water and Cryoprotectants, Their Activation Energies, and the Development of Improved Cryopres-ervation Methods // Biology of Reproduction 63, (2000), 1294-1302.
10. F. P. Simione. Cryopreservation Manual, M.S. In cooperation with Nalge Nunc International Corp., Nalge Nunc International Corp., 1998.
СПЕКТРЫ ПЕПТИДНЫХ СОЕДИНЕНИИ, ВЫДЕЛЯЕМЫХ В ИНКУБАЦИОННУЮ СРЕДУ ЭРИТРОЦИТАМИ ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ ГИПЕРГЛИКЕМИИ
Садыхова Анна Викторовна1, Кленова Наталья Анатолиевна1, Лебедева Елена Алексеевна2
Аспиранты,
'Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Са-
марский государственный университет, Кафедра биологической химии (профессор Фролов Ю.П!)
2 Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет»
SPECTR'S OF PEPTIDE COMPOUNDS LEAVING INTO THE INCUBATION MEDIUM OF HUMAN'S ERYTHROCYTES IN
HYPERGLYCEMIA CONDITIONS
Sadykhova Anna1, Klenova Natalia1, Lebedeva Elena2
АННОТАЦИЯ
Проведено изучение общего количества и спектра пептидных соединений, поступающих в инкубационную среду Рингера-Локка из эритроцитов человека донорской крови после 60-ти минутной инкубации их при 3 7°С в условиях содержания глюкозы 5 мМ/л (нормогликемия) и 10 мМ/л (гипергликемия), а также при инкубации в условиях нормоглике-мии эритроцитов пациентов с сахарным диабетом I типа. Общее содержание пептидов в инкубационной среде эритроцитов из донорской крови в условиях гипергликемии выше на 19%, при изучении эритроцитов из крови пациентов с сахарным диабетом I типа общее содержание пептидов в инкубационной среде достоверно не отличалось от условий нормогликемии для эритроцитов из крови доноров, однако внутри эритроцитов было обнаружено превышение количества пептидов более, чем в 2,5 раза. Изучение спектра пептидных соединений методом капиллярного электрофореза выявило изменение спектра пептидов, выделяемых эритроцитами человека в инкубационную среду, как в условиях гипергликемии, так и у пациентов с сахарным диабетом I типа.
ABSTRACT
The study of the total number and range ofpeptide compounds entering the incubation medium Ringer-Locke from human erythrocytes of blood after 60 min incubation at 37 ◦ C in glucose 5 mmol/1 (normoglycemia) and 10 mmol/1 (hyperglycemiya) as well as the incubation of red blood cells in normoglycemia patients with I type diabetes. The total content of the peptides in the incubation medium donors in hyperglycemia above 19%, in patients with I type diabetes total peptides in the incubation medium was not significantly different from those of normoglycemia donors, but in erythrocytes was found to exceed the number ofpeptides more than 2.5 times. Study the spectrum of the peptide compounds by capillary electrophoresis has revealed change of the spectrum of peptides allocated to human erythrocytes of the into the incubation medium, both in the conditions hyperglycemia and for and at patients with I type diabetesAlpha
ВВЕДЕНИЕ эритроцитах человека [3, 4]. Авторами показано, что про-
Пептидная регуляция является одной из важней- теолиз гемоглобина в эритроцитах приводит к образова-
ших и многофункциональных систем у всех живых орга- нию около 50 пептидов, обладающих различной биологи-
низмов. Образование регуляторных пептидов тканеспеци- ческой активностью. Кроме того, процесс генерации
фично и представляет собой результат протеолитической пептидов проходит двуступенчато: эндопептидазами, а за-
деградации ряда функционально важных белков: гемогло- тем экзопептидазами. Это косвенно подтверждает то, что
бина, актина, ряда внутриклеточных ферментов в про- протеолитический комплекс ферментов в эритроцитах мо-
теосомах [1, 2]. жет быть частично представлен сохранившимися катали-
Было обнаружено образование пептидных соедине- тическими протеасомными субъединицами. Возможно
ний, являющихся фрагментами гемоглобина и актина в также частичное сохранение ряда регуляторных механизмов, обнаруживаемых в протеасомах других клеток [1, 2].
Наличие регуляции процесса производства пептидов в эритроцитах подтверждается полученными нами ранее данными о зависимости уровня производства пептидов в эритроцитах человека от количества цАМФ, состояния рецепции и возраста клеток, а также от содержания ионов кальция и магния в инкубационной среде, то есть данный процесс подвержен значительной регуляции [5, 6].
Возможным механизмом регуляции протеолитиче-ских ферментов протеасом кроме фосфорилирования может служить процесс гликозилирования протеосомных белков или самого гемоглобина.
Таким образом, представляет определенный интерес исследование изменений пула генерируемых пептидов в условиях гипергликемии, сопровождающей течение сахарного диабета, особенно, в связи с тем, что из эритроцитов в кровь попадают пептидные соединения, обладающие определенной биологической активностью [7]. Изменение спектра биологически активных соединений в условиях избытка глюкозы в крови может сопровождаться определенными регуляторными сдвигами гомеостаза.
Основными методами, применяемыми авторами при исследовании спектра эритроцитарных пептидов является ВЭЖХ и электрофорез в ПААГ [2,3].
В настоящее время мало работ, посвященных изучению спектра пептидных соединений методом капиллярного электрофореза, который отличается высокой эффективностью, большой производительностью и точностью [8].
Целью данного исследования стало изучение общего количества и спектра пептидных соединений, выделяемых эритроцитами человека в инкубационную среду в условиях гипергликемии и нормогликемии, а также эритроцитами пациентов с сахарным диабетом I типа методом капиллярного электрофореза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В проведенных исследованиях использовалась све-жезабранная венозная кровь доноров и пациентов с сахарным диабетом I типа. Количество исследуемых образцов составило порядка 25 в каждой изучаемой группе. Средний возраст доноров составил 28,4±1,7 лет, пациентов 25,8 ±1,7 лет с длительностью заболевания 3-5 лет. Средний уровень глюкозы в крови пациентов составил 6,59 ±0,92 мМоль. Свежая донорская кровь любезно предоставлена Самарской Областной стацией переливания крови. Фракцию чистых эритроцитов получали после первичного центрифугирования в режиме 500g, 10 минут и удаления плазмы и лейкоцитарной пленки. Далее осуществляли 4-х кратное отмывание холодным раствором PBS, t +4 °С в том же режиме центрифугирования, каждый раз удаляя верхний слой, содержащий лейкоциты. Чистоту полученных фракций эритроцитов проверяли микроскопически после окраски мазков по Романовскому. Пробы помещали в пробирки, обработанные силиконовой жидкостью (Sigma). Далее проводили инкубацию эритроцитов в растворе Рингера-Локка (нормогликемия - 5 мМ/л глюкозы; гипергликемия - 10 мМ/л глюкозы) в соотношении 1:1, при 37°С в течение 60 минут, при периодическом осторожном перемешивании каждые 5 минут (во избежании гемолиза). Затем инкубационную среду отделяли центрифугированием в том же режиме. Эритроциты депро-теонировали с помощью 10%-ной ТХУ кислоты в соотношении 1:3 и центрифугировали при 1000g 15 минут.
В инкубационной среде и надосадочной жидкости определяли содержание пептидных соединений по методу Лоури [7]. Спектр пептидов исследовали в инкубационной
среде (без протеонирования) методом капиллярного электрофореза на приборе «Капель 105М» с СФ-детектором и системой жидкостного охлаждения, кварцевые капилляры с внутренним диаметром 75 мкм и эффективной длиной 50 см, ООО. Люмекс, г.Санкт-Петербург. Для кондиционирования ежедневно перед работой капилляр последовательно промывали следующим образом: 10 минут дистиллированной водой, 5 мин раствором 0,5 М соляной кислоты, 5 мин дистиллированной водой, 5 мин раствором 0,5 М гидроксида калия, 5 мин дистиллированной водой. Перед каждым анализом капилляр промывали раствором ведущего электролита (0,1 М боратный буфер, рН 9,17) в течение 10 минут. Детектирование проводили в УФ области света при длине волны 254 нм, что позволяет выявить пептиды, содержащие остатки ароматических аминокислот, а также в условиях высокой концентрации пептидных соединений регистрировать и не содержащие таковых, использовали гидродинамический способ ввода пробы. Полученные электрофореграммы обрабатывали при помощи программного обеспечения «Эльфоран».
Работа осуществляется при финансовой поддержке проекта РФФИ 13-03-97013 р_Поволжье_а.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Общее содержание пептидов в инкубационной среде эритроцитов из крови доноров в условиях гипергликемии оказалось выше на 19%, чем при нормогликемии. В инкубационной среде эритроцитов из крови пациентов с сахарным диабетом I типа общее содержание пептидов достоверно не отличалось от условий нормогликемии, но наблюдалось высокая вариабельность данного показателя. Возможно, это обусловлено, во-первых, относительно нормальным содержанием глюкозы в крови пациентов, а также значительной разницей анамнеза больных, дозой принимаемого инсулина и маркой препарата (табл.). Следует отметить, что общее содержание компонентов в инкубационных средах, которые определяются по методу Лоури оказывалось достаточно высоким (60-90 мкг/мл).
Определение количества пептидов в эритроцитах показало, что у пациентов с сахарным диабетом I типа их значительно больше, чем у доноров. Уровень превышения составил более 250% (табл.).
Усиление процессов протеолиза внутри эритроцитов у больных сахарным диабетом может быть обусловлено наличием в циркулирующей популяции большего процента поврежденных клеток, что в свою очередь может быть объяснено как повреждением мембранных белков процессами неферментативного гликирования, так и повреждением рецепции клеток препаратами инсулина, адсорбированием на поверхности эритроцитов дериватов инсулина и комплексов антиген-антитело [9]. Малый выход пептидов в инкубационную среду, возможно, связан с нарушением процессов транспорта пептидов через поврежденную мембрану эритроцитов у больных сахарным диабетом I типа.
Отсутствие отличий в содержании пептидов в инкубационной среде, однако, сопровождается значительным изменением спектров компонентов, содержащих ароматические группировки в своем составе. Анализ усредненных электрофореграмм показал, что у доноров при инкубации в условиях нормогликемии обнаруживается один высокий пик компонента, выходящего на 5-й минуте элюирования (возможно, более малой молярной массы), а также много низких пиков среди которых два высоких пика (возможно, большей молярной массы), выходящие между 13-14-ой и 17-18-ой минутами (рис.1). При инкубации донорских эритроцитов в условиях гипергликемии спектр данных соединений менялся: среди
коротких пиков в наибольшем количестве регистрируются два пика регистрируемых между 2-3-ой и 3-4-ой минутами, а также одним средним пиком (ближе к 4-ой минуте элюирования) и одним высоким (ближе к 5-ой минуте элюирования) (рис.2).
У пациентов с сахарным диабетом I типа нами были обнаружены в инкубационной среде также только рано выходящие соединения, содержащие ароматические группировки, которые регистрировались двумя малыми пиками (между 3-5-ой минутами элюирования) и одним высоким на 6-ой минуте элюирования (рис.3). Можно заметить, что электрофореграммы компонентов инкубационных сред донорских эритроцитов в условиях гипергликемии схожи с таковыми у инкубационных сред эритроцитов пациентов с сахарным диабетом I типа. Таким образом, гликозилирование мембранных белков и гемоглобина эритроцитов может способствовать изменению спектра компонентов, выделяемых клетками в инкубационную среду.
Присутствие в составе данных компонентов соединений с высокой биологической активностью может оказывать существенное влияние на регуляцию процессов го-меостаза у пациентов с сахарным диабетом I типа. Кроме того, повышение уровня глюкозы в крови характерно при многих физиологических ситуациях: постсорбционный период, острый и хронический стресс, эмоциональное напряжение и др. Возможно, что в данных условиях будет меняться спектр, а соответственно и биологическая активность, генерируемых эритроцитами в кровь биологически активных соединений, что будет сопровождаться изменениями регуляции процессов жизнедеятельности.
БЛАГОДАРНОСТИ. Авторы выражают искреннюю признательность заведующей кафедрой физической химии и хроматографии Самарского государственного университета Онучак Л.А. за возможность проведения капиллярного электрофореза проб, а также главным врачам
и сотрудникам Самарской областной станции переливания крови и Самарского областного диабетического центра за предоставление материалов для исследования.
Список использованных источников
1. Цимоха А.С. Протеасомы: участие в клеточных процессах // Цитология. 2010. Т.52. №4. С.277-300.
2. Сорокин А.В., Ким Е.Р., Овчинников Л.П. Протеа-сомная система деградации и процессинга белков //Успехи биологической химии. 2009. Т.9. С. 3-76.
3. Карелин А.А., Иванов В.Т. Пептидомика - новое направление постгеномных технологий // Вестник Российской академии наук. 2005. Т. 75. № 2. С. 139148.
4. М.М. Филиппова, Д.П. Хачин, О.В. Сазонова и др. Фрагменты функциональных белков в переживающей культуре эритроцитов человека // Биоорганическая химия. - 2008. - т.34. - №2. - С. 160-170.
5. Кленов Р.О., Кленова Н.А. Действие цАМФ на образование пептидов в эритроцитах человека в зависимости от возраста клеток // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2010. Т.149. № 6. С.644-648.
6. Исаева А.В., Кленов Р.О., Кленова Н.А. Влияние дефицита кальция и магния на содержание пептидных соединений в эритроцитах человека при инкубации in vitro //Вестник СамГУ. Ест.-науч.серия. 2011. №8.(89) С.179-183.
7. Шатаева Л.К., Хависон В.Х., Ряднова И.Ю. Пептидная саморегуляция живых систем (факты и гипотезы). - Изд-во СПб.: Наука, 2003. - 222с.
8. Niya Dan, Ravindran Ganesan, Keith G. Flood, David Tsai, Van D. Determination of enantiomers in a synthetic argininal peptide using capillary zone electrophoresis and high-performance liquid chromatography// Journal of Chromatography A. 2000. V.891. P.115-127.
9. А.Г. Голубев Изнанка метаболизма //Биохи-мия.1996. Т.61. №11. С. 38-41.
Таблица
Содержание пептидных соединений, мкг/мл_
Условия инкубации Эритроциты Инкубационная среда
нормогликемия (доноры) 109,2±7,6 72,6±4,7
гипергликемия (доноры) 115,6±6,3 86,7±4,5*
Пациенты с сахарным диабетом I типа 305,4±25,9* 64,9±12
Примечание: *P<0,01
Рис.1. Усредненная электрофореграмма пептидных соединений, выделенных эритроцитами доноров в инкубационную
среду (условия нормогликемии)
1
о
0 1 2 3 4 5 6
мин
Рис.2. Усредненная электрофореграмма пептидных соединений, выделенных эритроцитами доноров в инкубационную
среду (условия гипергликемии)
16 14 12 10 8 6 4 2 0
01 23456789 10
мин
Рис. 3 Усредненная электрофореграмма пептидных соединений, выделенных эритроцитами пациентов с сахарным диабетом I типа в инкубационную среду (условия нормогликемии)
О БИОЛОГИЧЕСКИХ И ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕДИКТОРАХ КЛИМАТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ В АНТАРКТИКЕ
Самышев Эрнест Зайнуллинович
Доктор биол. наук, профессор, зав. отделом функционирования морских экосистем, Институт морских
биологических исследований (ИМБИ) РАН, г. Севастополь
Минкина Наталья Иосифовна Канд. биол. наук, ст. науч. сотр., ИМБИ РАН Чудиновских Елена Сергеевна вед. инженер ИМБИ РАН
В отношении прибрежной зоны Антарктиды исследования, проводимые разными странами, свидетельствуют о «наложении» на фактор потепления климата фактора загрязнения.
Современными исследованиями выявлено интенсивное загрязнение антарктической экосистемы тяжелыми металлами [7, р. 592; 8, р. 119; 2, с. 178; 10, р. 409, 12, р. 143; 11, р. 409; 18. р. 357 и др.], которое оказалось сопоставимо с таковым в наиболее эксплуатируемых человечеством морских акваториях.
Предыдущими исследованиями в районе Украинской Антарктической станции «Академик Вернадский» (УАС) нами было обнаружено повышенное содержание тяжелых металлов в донных осадках и в грунтах о-вов Аргентинского архипелага, выявлена аккумуляция тяжелых
СО
t t 1 са ю (О .. " . о о СО - f (N 1 ■Я ■ .1 > ■ ■ 1
о
с 1 л
00 00 см
* *
л 1 .....................г
В отношении пелагиали антарктической зоны океана ярким примером климатических изменений в ней (потепления) в 70-е - 80-е годы прошлого столетия является проникновение массового представителя макропланктона - сальпы Томпсона - в ареал антарктического криля (Euphausia superba) [16, р. 1881]. По данным разных авторов [13, р. 897; 9, р. 415; 6, р. 132;14, р. 33; 1, с. 882] эти туникаты благодаря высокой пищевой активности и численности способны создавать существенную конкуренцию растительноядным планктерам, в т.ч. антарктическому крилю, а косвенно - негативно сказываясь на численности большинства потребителей последнего (рыб, птиц, головоногих, млекопитающих).
