Образование пептидных соединений в эритроцитах человека в условиях гипергликемии и их действие на протеолитическую активность лейкоцитов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 577.3:612.111

ОБРАЗОВАНИЕ ПЕПТИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В ЭРИТРОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ ГИПЕРГЛИКЕМИИ И ИХ ДЕЙСТВИЕ НА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ

© 2013 С.Г. Васильева, Е.П. Мочалова, А.В. Исаева, Н.А. Кленова1

Обнаружено увеличение производства пептидных соединений эритроцитами человека при инкубации их в условиях гипергликемии (10 мМ/л) по сравнению с нормогликемией (5 мМ/л). При этом изменяется и спектр пептидных соединений, так как наблюдается изменение действия их на активность катепсина D лейкоцитов: в условиях нормогликемии выделяемые эритроцитами пептиды увеличивают активность катепсина D при дефиците кальция в среде, а в условиях гипергликемии, наоборот, ингибируют фермент в присутствии ионов кальция.

Ключевые слова: эритроциты, пептидные соединения, лейкоциты, протеоли-тическая активность.

Введение

Пептидная регуляция является одной из самых сложных и многофункциональных систем в живых организмах. Образование пептидов тканеспецифично и происходит в результате протеолитической деградации функционально важных клеточных белков: гемоглобина, актина и ряда ферментов [1—3]. Механизмы образования пептидных соединений в эритроцитах, закономерности их поступления в плазму крови и особенно их регуляторное действие остаются малоизучены. Исследованиями, проведенными ранее на кафедре биохимии СамГУ, было показано, что процесс образования пептидов в эритроцитах ускоряется под действием цАМФ и АТФ [4], снижается в условиях дефицита Са2+ и [5], что позво-

ляет предполагать участие в этом как протеасомных ферментов, так и каспаз. По-видимому, протеолитическая деградация гемоглобина и ряда других эритро-цитарных белков может осуществляться и в физиологических условиях за счет протеасомных протеаз, и в условиях реализации эриптоза, вызванного активацией неселективного кальциевого канала за счет каспазной активности. При этом спектр и количество регуляторных пептидных соединений могут значительно варьироваться. Реализация программы апоптозной гибели эритроцитов ускоряется

Васильева Софья Геннадьевна (sofia.vasiliewa@yandex.ru), Мочалова Екатерина Павловна (mochalova_ekaterina@lenta.ru), Исаева Анна Викторовна (antimo2008@rambler.ru), Кленова Наталья Анатольевна (klenova.ssu@yandex.ru), кафедра биохимии Самарского государственного университета, 443011, Российская Федерация, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.

в условиях гипергликемии, образование пептидных соединений, их спектр и биологическая активность при этом также могут изменяться. Поступающие в кровь пептиды могут оказывать непосредственное воздействие на лейкоциты, что может сказываться на их функциональной активности. В связи с распространением гипергликемических состояний: переедание, сахарный диабет — данные исследования являются актуальными как в фундаментальном, так и в научно-практическом отношении.

Целью данного исследования стало изучение процессов образования пептидов в эритроцитах человека в условиях гипергликемии и их влияния на протеолити-ческую активность лейкоцитов.

Материалы и методики

Фракции чистых эритроцитов и лейкоцитов получали из свежей донорской крови, предоставленной Самарской областной станцией переливания крови. Средний возраст доноров составил 27, 5 ± 7,4 года. Отмывку эритроцитов осуществляли после удаления плазмы вместе с лейкоцитарной пленкой трехкратно холодным раствором PBS, центрифугируя в режиме 600g в течение 10 минут. Лейкоциты выделяли из отобранной плазмы. Плазму с взвешенными клетками центрифугировали в течение 10 минут при 2000 об/мин. Осадок, состоящий из лейкоцитов и примеси эритроцитов, обрабатывали раствором 0,89 %-ного NH4C1 для разрушения эритроцитов и оставляли на 5 минут, после чего центрифугировали 3 минуты при 1000 об/мин. После удаления надосадочной жидкости осадок лейкоцитов промывали 3-4 раза охлажденным PBS [6].

Эритроцитарные пептиды получали после инкубации фракции чистых эритроцитов в течение 60 минут при 37 ° C с раствором Рингера-Локка в соотношении 1: 1 и периодическом осторожном перемешивании. Для создания дефицита Са2+ в инкубационной среде использовали раствор Рингера-Локка без добавления СаС12. Условия гипергликемии создавали добавлением 10 мМ глюкозы вместо стандартных 5 мМ в обычном растворе Рингера-Локка.

После инкубации пробы центрифугировали при 500g в течение 10 минут. В су-пернатанте определяли содержание пептидов по методу Лоури. Часть супернатан-та смешивали с суспензией лейкоцитов в соотношении 1 : 1 и инкубировали при 37 °С 10 минут. Контрольные пробы содержали вместо супернатанта среду Рингера-Локка (как с СаС12, так и без). Содержание пептидов определяли также внутри эритроцитов после их депротенирования 10 %-ной ТХУ кислотой в соотношении 1 : 3. Степень гликозилированности белков мембран эритроцитов определяли с помощью метода, описанного Б.И. Фельдкореном с соавт. (1991) [7].

Для определения активности катепсина D в лейкоцитах и нейтральных протеаз в эритроцитах использовали модифицированный метод Ансона [8].

Результаты и их обсуждение

Определение количества пептидов в инкубационной среде и внутри эритроцитов показало, что в условиях гипергликемии содержание пептидных соединений в инкубационной среде достоверно возрастает, тогда как внутри эритроцитов наблюдается лишь тенденция к повышению в условиях инкубации в присутствии

ионов кальция (табл. 1). Возможно, что дефицит ионов кальция в инкубационной среде в условиях гипергликемии потенцирует данный процесс.

Известно, что условия гипергликемии сопровождаются неферментативным гли-кированием гемоглобина и мембранных белков эритроцитов [9], что может являться причиной возрастания содержания пептидов в инкубационной среде (табл. 1). Механизмы регуляции деградации гемоглобина в настоящее время не изучены, возможно, маркировкой для протеолитического расщепления может служить степень гликозилирования белка. При проходе пептидных соединений через мембрану они укорачиваются, то есть подвергаются протеолитическому расщеплению [2].

Таблица 1

Содержание пептидов в инкубационной среде и эритроцитах в различных условиях инкубации, мкг/мл

Условия Инкубационная среда Эритроциты

инкубации Рингера-Локка Рингера-Локка, Рингера-Локка Рингера-Локка,

без СаС12 полный состав без СаС12 полный состав

Нормогликемия, 66,7±4,6 72,6±4,7 109,0±10,6* 109,2±7,6*

5 мМ/л п = 20 п = 20 п = 19 п = 17

Гипергликемия, 87,4±4,7** 86,7±4,5° 108,7±5,1* 115,6±6,3*

10 мМ/л п = 22 п = 20 п = 17 п = 14

*Р < 0,01 по отношению к инкубационной среде; **Р < 0,01 по отношению к нормогликемии; оР<0,05 по отношению к нормогликемии.

Отсутствие достоверного увеличения количества пептидов внутри клеток в условиях гипергликемии, возможно, связано с увеличением скорости их выхода из эритроцитов из-за повреждения мембран гликированием мембранных белков и образованием белковых агрегатов, повышающим проницаемость мембраны. Определение степени гликозилированности мембранных белков эритроцитов показало, что она увеличивается в условиях гипергликемии на 46-47 % (табл. 2).

Таблица 2

Степень гликозилированности белков мембран эритроцитов (СГБ, у. е.) и активность нейтральных протеаз (АНП, мкг/ мгИЪ в час)

Показатель Нормогликемия, 5 мМ/л Гипергликемия, 10 мМ/л

без СаС12 полный состав без СаС12 полный состав

СГБ, у.е. п = 10 38,1±4,9 40,4±5,6 56,0±5,7* 59,0±6,2*

АНП, мкг/мг НЬ в час, п = 6 2,55±0,85 1,90±0,56 1,77±0,55 3,65±0,87

* Р < 0,05 по отношению к нормогликемии.

Также можно отметить четко выраженную тенденцию к увеличению активности нейтральных протеаз в условиях гипергликемии и присутствия кальция в инкубационной среде, так как большинство данных ферментов кальцийзависимы.

Исследование активности катепсина Б в лейкоцитах показало, что она снижается в условиях гипергликемии (табл. 3).

Таблица 3

Активность катепсина D лейкоцитов после инкубации с эритроцитарными пептидами

Условия Инкубация лейкоцитов Инкубация лейкоцитов

инкубации с пептидами эритроцитов без добавления пептидов

Среда без Среда с Среда без Среда с

СаС12 СаС12 СаС12 СаС12

1. Нормоглике- 5,44±0,44** 5,51±0,66 3,61±0,61 6,06±0,53

мия, 5 мМ/л,

n=8

2. Гиперглике- 0,89±0,19* 0,51±0,10** 0,76±0,12* 1,23±0,26*

мия, 10 ММ/л,

n=8

*Р < 0,01 по отношению к нормогликемии; **Р < 0,05 по отношению к пробам без пептидов.

Так как активность протеолитических ферментов является одним из показателей функционального состояния данных клеток [10], вероятно, гипергликемия способствует ухудшению функций лейкоцитов в этих условиях. Десятиминутная инкубация клеток с пептидами эритроцитов, выделенных в среду в условиях нор-могликемии, выявляет повышение активности катепсина D в пробах, не содержащих кальция. Однако при гипергликемии наблюдается достоверное снижение активности в условиях присутствия ионов кальция. Так как в условиях гипергликемии мы наблюдали увеличение содержания пептидов в инкубационной среде (табл. 1), можно предположить, что в присутствии Са2+ среди выделяемых пептидов появляются соединения, ингибирующие катепсин D, а в условиях нормо-гликемии в отсутствии Са2+ в спектре выделяемых пептидов есть активирующие данный фермент.

Полученные данные вносят вклад в изучение механизмов производства пептидов эритроцитами человека и обнаружение их регуляторных свойств. Обнаруженное изменение количества и спектра пептидов в условиях гипергликемии, а также зависимость этого процесса от уровня ионов кальция позволяют предполагать важность изучения данных процессов, так как состояние гипергликемии сопровождает различные патологические нарушения как углеводного обмена, так и эндокринные заболевания. Влияние пептидных соединений на протеолитическую активность лейкоцитов указывает на важность спектра пептидных соединений, выделяемых эритроцитами, в реализации иммунных реакций организма человека.

Литература

[1] Шатаева Л.К., Хавинсон В.Х., Ряднова И.Ю. Пептидная саморегуляция живых систем (факты и гипотезы). СПб.: Наука, 2003. 222 с.

[2] Карелин А.А., Иванов В.Т. Пептидомика — новое направление постгеномных технологий // Вестник РАН. 2005. Т. 75. № 2. С. 139-156.

[3] Фрагменты функциональных белков в переживающей культуре эритроцитов человека / М.М. Филиппова [и др.] // Биоорганическая химия. 2008. Т. 34. № 2. С. 160-170.

[4] Кленов Р.О., Кленова Н.А. Действие цАМФ на образование пептидов в эритроцитах человека в зависимости от возраста клеток // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2010. Т. 149. № 6. С. 644-648.

[5] Исаева А.В., Кленов Р.О., Кленова Н.А. Влияние дефицита кальция и магния на содержание пептидных соединений в эритроцитах человека при инкубации in vitro // Вестник СамГУ. Естественнонауч. серия. 2011. № 8(89). С. 179-183.

[6] Шепотиновский В.И., Микашинович З.И. Диагностическая ценность определения активности гексокиназы в лейкоцитах больных ишемической болезнью сердца // Лаб. дело. 1979. № 11. С. 674-676.

[7] Фельдкорен Б.И., Осипова Е.И., Коцедуб Т.П. Исследование параметров метода определения гликозилированных белков сыворотки крови // Лаб. дело. 1991. № 5. С. 56-58.

[8] Лизосомы. Методы исследования / пер. с англ.; под ред. Дж. Дингла. М.: Мир, 1980. 344 с.

[9] Голенок В.А., Ханыкина И.В. Гликозилированные протеиды и реологические свойства эритроцитов при нарушениях углеводного обмена // Лаб. дело. 1988. № 2. С. 3-8.

[10] Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз. Екатеринбург: Изд-во УрО РАН, 2001. 288 с.

Поступила в редакцию 3/XI/2012;

в окончательном варианте — 3/XI/2012.

PRODUCTION OF PEPTIDE COMPOUNDS IN HUMAN ERYTHROCYTES AT HYPERGLYCEMIA AND THEIR EFFECT ON THE PROTEOLYTIC ACTIVITY OF LEUKOCYTE

© 2013 S.G. Vasiljeva, E.P. Mochalova, A.V. Isaeva, N.A. Klenova2

An increase in the production of peptide compounds in human erythrocytes incubated by them in conditions of hyperglycemia (10 mmol/L) compared with normoglycemia (5 mmol/L) is found. At that the spectrum of peptide compounds changes, since a change of their action on the activity of cathepsin D leukocytes: in normoglycemia allocated erythrocytes peptides increase the activity of cathepsin D with calcium deficiency in the environment, and in conditions of hyperglycemia, on the contrary inhibit the enzyme in the presence of calcium ions.

Key words: erythrocytes, peptide connections, leukocytes, proteolytic activity.

Paper received 3/XI/2012. Paper accepted 3/XI/2012.

2Vasilieva Sofia Gennadyevna (sofia.vasiliewa@yandex.ru), Mochalova Ekaterina Pavlovna (mochalova_ekaterina@lenta.ru), Isaeva Anna Viktorovna (antimo2008@rambler.ru), Klenova Natalia Anatolyevna (klenova.ssu@yandex.ru), the Dept. of Chemistry, Samara State University, Samara, 443011, Russian Federation.