CC BY
9ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия Б, 2003, том 45, № 10, с. ¡782-1786
УДК 541(515+64):543.422.25
СПЕКТРЫ ДВОЙНОГО ЭЛЕКТРОННО-ЯДЕРНОГО РЕЗОНАНСА И СТРУКТУРА МАКРОРАДИКАЛОВ В ОБЛУЧЕННОМ НАТУРАЛЬНОМ ШЕЛКЕ
© 2003 г. Н. Г. Квачадзе, Э. Е. Томашевский
Физико-технический институт им. А.Ф. Иоффе Российской академии наук 194021 Санкт-Петербург, Политехническая ул., 26 Поступила в редакцию 01.04.2003 г. Принята в печать 14.05.2003 г.
Осуществлена регистрация и проведен анализ спектров двойного электронно-ядерного резонанса макрорадикалов в облученных при комнатной температуре волокнах натурального шелка. Установлено, что в фиброине шелка происходит образование срединных радикалов разной структуры.
Определены константы СТВ для а- и 6-протонов в радикале -СН^-СОЫНСНСОЫН-СШ^-. Проведена оценка торсионных углов внутреннего вращения по связям Су-Сд и [Ч^-Сд в радикале.
Свободные радикалы в синтетических и природных полимерах, образующиеся в результате молекулярной деструкции, исследовали методом ЭПР-спектроскопии [1]. Для детального изучения макрорадикалов необходимо использование методики двойного электронно-ядерного резонанса (ДЭЯР), обеспечивающей высокое спектральное разрешение. Метод ДЭЯР применяли для исследования радикалов в облученных монокристаллах органических соединений, в том числе в аминокислотах и пептидах [2, 3], а также для изучения макрорадикалов в синтетических полимерах [4-6]. Настоящая работа предпринята с целью определения констант СТВ и выяснения строения срединных радикалов в натуральном шелке.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Спектры ДЭЯР регистрировали на лабораторном ДЭЯР-спектрометре 0-диапазона [7], работающем на частоте 35 ГГц. Спектры ДЭЯР [Н записывали путем сканирования по радиочастоте в диапазоне 45-100 МГц в условиях фиксированной настройки на одну из компонент спектра ЭПР и насыщающем уровне мощности СВЧ, поступающей в объемный резонатор. Радикалы создавали рентгеновским облучением нитей натурального шелка при комнатной температуре. Поглощенная доза излучения не превышала 20 кДж/кг.
E-mail: nina.kvachadze@mail.ioffe.ru (Квачадзе Нина Гура-мовна).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 и 2 показаны спектры ЭПР и ДЭЯР облученного натурального шелка, записанные при расположении оси волокон Ь вдоль и поперек магнитного поля Я. Спектры ЭПР аналогичны опубликованным в литературе и имеют форму
дублета, принадлежащего радикалу -МНСНСО-. Асимметрия спектра при Ь связана с анизотропией ^-тензора.
Спектры ДЭЯР 1Н оказались более сложными. Здесь наблюдается несколько полос поглощения от радикалов разного строения. Наиболее интенсивная линия, изменяющая свое положение в спектре ДЭЯР в зависимости от ориентации волокон в магнитном поле, отвечает радикалу в котором неспаренный электрон взаимодействует с а-протоном. Две другие менее интенсивные линии на частотах 80 и 87 МГц следует приписать радикалам и в которых неспаренный электрон взаимодействует только с р-протонами.
Радикалы и различаются по релаксационным характеристикам и реакционной способности. Интенсивность линий спектра ДЭЯР радикалов и Яр по-разному зависит от температуры. При нагревании облученных образцов или их облучении УФ-светом рекомбинация радикалов Яр происходит быстрее, чем 11а. Отношение интен-сивностей линий ДЭЯР на разных частотах изменяется. Вместе с тем наблюдали некоторое увели-
СПЕКТРЫ ДВОЙНОГО ЭЛЕКТРОННО-ЯДЕРНОГО РЕЗОНАНСА 1783
25 Гс
-Я
Рис. 1. Спектры ЭПР облученных волокон натурального шелка в 2-диапазоне. 1 2 -¿1 Я.
50 у0
90 V, МГц
Рис. 2. Спектры ДЭЯР 'Н макрорадикалов в волокнах натурального шелка. Т = -140°С; а -£ II Я,б-£±Я.
чение эффективности регистрации ДЭЯР радикалов что могло быть вызвано уменьшением межрадикального взаимодействия из-за гибели близко расположенных радикалов или их миграции.
По спектрам ДЭЯР были определены константы СТВ для радикалов и Яр. Измерения спектров ДЭЯР для оценки констант СТВ радикала Яа проводили после рекомбинации значительной части радикалов Яр.
Радикал /?а
Фиброин натурального шелка состоит в основном из периодически повторяющейся последовательности аминокислотных остатков [-С1у-А1а-С1у-А1а-01у-5ег-]. При отщеплении атома водорода от метиленовой группы глицина образуется срединный макрорадикал
О На Ну
Н811*1 нр о я2 н82
в котором Я, и Я2 являются группами -СН3 и(или) -СН2ОН. В зарегистрированных спектрах ДЭЯР проявляется СТВ неспаренного электрона с различными протонами радикала. В отчетливой форме линии ДЭЯР выделяются для ос- и 5-протонов.
(х-Протон
Компоненты тензора СТВ а-протона были определены по значениям резонансных частот на границе полосы ДЭЯР при Ы.Н и частоте, соответствующей высокочастотному склону линий ДЭЯР при ¿|| Я. Для главных значений тензора анизотропного СТВ получены величины Ва = +26.3, +0.4 и -26.7 МГц. Ось наибольшего положительного значения проходит вдоль связи Са-На, ось меньшего положительного значения - вдоль 2р-орбита-ли неспаренного электрона. Изотропная компонента тензора СТВ Аа = -48.3 ± 1 МГц.
Ширина линии ДЭЯР а-протона при Ь || Я, измеренная на уровне полувысоты сигнала ДЭЯР, равна 2.5-3 МГц. В облученных монокристаллах ширина линий для а- и (5-протонов составляет 0.1- 0.2 МГц. Относительно большая ширина полос ДЭЯР радикалов в фиброине натурального
1784 КВАЧАДЗЕ, ТОМАШЕВСКИЙ
v, МГц
Рис. 3. Участок спектра ДЭЯР макрорадикалов Яа в волокнах натурального шелка. Т = 18°С, Ь || Н.
шелка связана с неупорядоченностью в расположении радикалов. Средний угол разориентации радикалов 11а относительно оси волокон натурального шелка лежит в пределах 15°-20°.
Необходимо отметить, что полученные значения констант Ва и Ла радикала Яа практически совпадают с соответствующими величинами для тензора СТВ а-протона радикала СН3СОМНСНСООН в ]М-ацетилглицине [8, 9]. Это означает, что распределение спиновой плотности в левой части этих радикалов примерно одинаково, следовательно, близки значения констант СТВ для р- и 5-протонов.
Ъ-Протоны
Возникновение СТВ с 6-протонами характерно для радикалов, содержащих амидную группу [8-11]. На рис. 3 показан участок спектра ДЭЯР в области свободного протонного резонанса У0, записанный для улучшения разрешения при комнатной температуре. Как видно, расположенные симметрично относительно У0 полосы двойного резонанса имеют явную подструктуру. Реконструкция полос позволяет выделить в них три линии, две из которых шириной около 1 МГц с расщеплениями в 7 и 9 МГц можно приписать 6,- и 62-протонам радикала Величина расщепления между линиями у+ и у_ в спектре ДЭЯР определя-
ется изотропной "а" и анизотропной "Ь" компонентами СТВ
у+ - у_ = [а + Ь]
Анизотропная составляющая СТВ для 5-про-
тонов в радикалах -СН2С01ЧНС НСН2- [5] и
СНзСОЫНС НСООН [9] невелика. Приняв Ь = 1 МГц, получим для 6Г и 62-протонов следующие значения изотропных компонент СТВ: а51 = 6 и а52 = 8 МГц.
Величина изотропного расщепления на 5-про-тонах обусловлена переносом некоторой доли спиновой плотности через амидные группы. Можно предположить, что угловая зависимость изотропного СТВ 5-протонов описывается уравнением такого же типа, как и (5-протонов:
а& = Л5со8205 = А5со82(32 ± <р8)
Здесь 0д - угол между направлением 2ря-орбитали углеродного атома Су или 2р-орбитали атома и проекцией связи С§-Н8 на плоскость, перпендикулярную связи Су-С8 или 1Чу-С5, <р - соответствующий конформационный угол.
Для оценки конформационных углов предположим, что коэффициенты А& для 5-протонов, расположенных в левой и правой частях радикала Яа, одинаковы и имеют такое же значение, как и для 5-метильной группы в радикалах Г^-ацетилг-
СПЕКТРЫ ДВОЙНОГО ЭЛЕКТРОННО-ЯДЕРНОГО РЕЗОНАНСА
1785
лицина. При величине А8 = 16.8 МГц [9] константам изотропного СТВ с 5-протонами as = 6-8 МГц удовлетворяют значения углов 0 в пределах от 43° до 53°. Отсюда следует, что углы внутреннего вращения <р по связям Су-С8 и Ny-Cg достигают величины 14°-21°. Таким образом, в макрорадикалах Ra имеет место отклонение от идеально плоской транс-конфигурации. Этот результат находится в соответствии с представлениями о конформации полипептидных цепей и строении фиброина шелка. Полипептидные цепи фиброина расположены антипараллельно друг другу и образуют структуры в форме складчатых слоев [12].
Амидные протоны
В работе [9] методом ДЭЯР были исследованы облученные монокристаллы обычного и дейте-рированного N-ацетилглицина, что позволило идентифицировать линии двойного резонанса слабо взаимодействующих протонов. Для амид-
ного протона в радикале CH3CONHCHCOOH получены следующие главные значения тензора анизотропного СТВ: = +7.9, -3.9 и -4.0 МГц при величине изотропной компоненты А^=-5 МГц. Эти значения можно принять как характеристики СТВ с амидным протоном HNp левой части макрорадикала Ra в натуральном шелке. СТВ с более удаленным от Са амидным протоном HNy в правой части радикала должно быть слабее. В спектре ДЭЯР, зарегистрированном при расположении волокон натурального шелка вдоль магнитного поля (рис. 3), к амидным протонам HNp и HNy отнесены линии с расщеплениями в 4.4 и 1.0 МГц.
Радикалы Rß
Радикалы Rß, не содержащие а-протона, образуются при облучении волокон натурального шелка при комнатной температуре в меньших концентрациях, чем радикалы Ra. Можно полагать, что радикалы Rß также являются срединными и возникают вследствие отщепления атомов водорода от аланинового, серинового или других аминокислотных остатков белка:
NH . СО
уа
«PI ^
Здесь X - атом Н или заместители -ОН, -PhOH и т.д.
Величина изотропного расщепления на (3-про-тоне в одном из радикалов равна ар = 52 МГц, в другом Rp2 - ар = 66 МГц. Определить константы СТВ с другими протонами в радикалах Rp, и Rp2 не представлялось возможным из-за сложности и невысокого разрешения спектров ДЭЯР облученного натурального шелка.
Радикал Rp¡
Радикал Rp, имеет аланиновое строение, а полоса ДЭЯР в районе 80 МГц обусловлена СГВ с протонами Р-метильной группы. Это утверждение основано на результатах измерений спектров облученных поликристаллических образцов N-ацетилаланина. При комнатной температуре в N-ацетилаланине
образуются радикалы CH3CONH-C(CH3)-COOH. Нами была осуществлена регистрация спектров ДЭЯР этих радикалов. Оказалось, что полоса ДЭЯР (J-метильной группы в радикалах N-ацетилаланина по положению в частотной шкале идентична полосе ДЭЯР радикалов Rpt в натуральном шелке.
Радикал R^
Радикалу Rp2 удовлетворяет структура с магнитно
неэквивалентными ^-протонами >Са-СрНр1Нр2Х. Конформацию радикала можно установить, исходя из угловой зависимости констант изотропного СТВ
ар = Apcos20p
Значение коэффициента Ар было оценено на основании данных, полученных для радикалов в полиамидах [5]. Предполагалось, что величина Ар для радикалов в натуральном шелке должна быть несколько меньше, чем в полиамидных радикалах из-за перераспределения спиновой плотности по двум амидным группам. В качестве меры уменьшения взято отношение констант Аа для а-прото-нов в радикалах натурального шелка и ПА-6 [5]. Такая оценка дает значение Ар = 108 МГц.
Измеренной величине расщепления ар = 66 МГц на одном из протонов Нр, радикала Rp2 соответст-
1786
КВАЧАДЗЕ, ТОМАШЕВСКИЙ
вует двугранный угол между 2р-орбиталью не-спаренного электрона и плоскостью СцСрН^, равный 0t = 39°. Для другого протона Нр2 угол 02 = 81°, значение а$2 = 2.7 МГц, следовательно, полоса ДЭЯР должна находиться в частотной области удаленных протонов. Положение заместителя X (ОН, PhOH) характеризуется углом 03 = = 21°. Угловое положение заместителей в радикалах Rß2 отражает особенности структурного строения белковых молекул в натуральном шелке.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Милинчук В.К., Клиншпонт Э.Р., Пшежецкий С.Я. Макрорадикалы. М.: Химия, 1980.
2. КаюшинЛ.П., Пулатова М.К., Кривенко В.Г. Свободные радикалы и их превращения в облученных белках. М.: Атомиздат, 1976.
3. Handbook of ESR / Ed. by Poole C.P., Farach H.C. New York: AIP Press, 1994.
4. Квачадзе Н.Г., Томашевский Э.Е. // Высокомолек. соед. Б. 1995. Т. 37. № 10. С. 1788.
5. Квачадзе Н.Г., Горшкова ИЛ., Томашевский Э.Е. // Высокомолек. соед. А. 1996. Т. 38. № 8. С. 1314.
6. Томашевский Э.Е., Квачадзе Н.Г. // Высокомолек. соед. А. 2001. Т. 43. № 7. С. 1194.
7. Томашевский Э.Е., Квачадзе Н.Г. // Приборы и техника эксперимента. 1988. № 6. С. 112.
8. Saxebol G., Melo Т.В., Henriksen Т. // Radiat. Res. 1972. V. 51. P. 31.
9. Chako V.P., McDowell, Singh B.C. // J. Chem. Phys. 1980. V. 79. №9. P. 5228.
10. Levingston R., Zeldes H. // J. Chem. Phys. 1967. V. 47. № 10. P. 4173.
11. Чувылкин Н.Д., Счастнев П.В., Алманов А.Г., Цветков Ю.Д. // Теорет. и эксперим. химия. 1970. Т. 6. № 3. С. 359.
12. МецлерД. // Биохимия. М.: Мир, 1980. Т. 1.
Electron Nuclear Double Resonance Spectra and the Structure of Macroradicals in Irradiated Silk
N. G. Kvachadze and E. E. Tomashevskii
loffe Physicotechnical Institute, Russian Academy of Sciences, Politekhnicheskaya ul. 26, St. Petersburg, 194021 Russia
Abstract—Electron nuclear double resonance spectra of macroradicals in silk fiber irradiated at room temperature were recorded and analyzed. It was found that central radicals of various structures are produced in silk
fibroin. The HFC constants were measured for the a- and 5-protons of the radical -CHRj-CONHCHCONH-CHR2-. The torsion angles of internal rotation about Cy-Cg and Ny-C8 in the radical were estimated.
