CC BY
9
medical & pharmaceutical
JOURNAL "PULSE"
2022. Vol.24. №5
CD
RESEARCH ARTICLE 3. Medical sciences
УДК 616.216.1-002.3
Corresponding Author: Mareev Gleb Olegovich - Professor of ENT Department of Saratov State Medical University named after V. I.
Razumovsky, Saratov
E-mail: dr-mareev@mail.ru
©Mareev G.O., Mareev O.V., Afonina O.I. - 2022
Received: 07.05.2022 | Accepted: 19.05.2022
Doi: http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-5-13-18
AUTOFLUORESCENCE SPECTRA OF A SPECIMEN OF NON-KERATINIZING LARYNGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA IN ACCORDANCE WITH A HISTOLOGICAL STUDY
Mareev G.O., Mareev O. V., Afonina O.I.
Saratov State Medical University named after V.I. Razumovski, Saratov, Russian Federation
СПЕКТРЫ АВТОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ МАКРОПРЕПАРАТА ПЛОСКОКЛЕТОЧНОГО НЕОРОГОВЕВАЮЩЕГО РАКА ГОРТАНИ В СООТВЕТСТВИИ С ГИСТОЛОГИЧЕСКИМ ИССЛЕДОВАНИЕМ
Мареев Г.О., Мареев О.В., Афонина О.И.
ФГБОУ ВО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского», г. Саратов, Российская Федерация
Abstract. The prevalence of oncological diseases of ear, nose and throat organs tends to increase in recent years. This paper describes a method for the early diagnosis of diseases of the pharynx and larynx, accompanied by epithelial dysplasia using autofluorescence spectroscopy. Fluorescence spectroscopy is a non-invasive, highly sensitive, versatile and relatively easy-to-use method that allows combined diagnostics and the ability to work in real time without tissue trauma. Its use in the diagnosis ofvarious diseases is due to the fact that during the development of pathologies, biochemical changes occur in the tissue, and, consequently, the relative content of the main fluorophores and chromophores changes, the morphological and histological parameters of the tissue change and, as a result, their contribution to the overall observed fluorescence spectrum fabrics. Fluorescence was started using an LGI-505 nitrogen laser (excitation wavelength 337nm, pulse repetition rate up to 1 kHz, pulse duration 6-10 ns). Registration of autofluorescence spectra carried out by usage a spectrum analyzer with fiber optic input LESA-7med. For the study, we used a sapecimen of the larynx obtained during laryngectomy wich previously histologically confirmed as laryngeal cancer. Biopsy performed in limited areas of the mucosa determined by the autofluorescence spectra analysis. Then a standard histological examination of biopsy samples were performed. A direct correlation was found between the results of autofluorescence spectroscopy and histological examination of identical localization areas of the object under study. Thus, squamous cell carcinoma is characterized, along with a general decrease in fluorescence intensity, by the shift of the main maximum of the spectrum in the region of435-455 nm. The low content of NADH in tumor cells, as well as dysproteinemia developing in malignant diseases, are the main reason for the decrease in the intensity of the autofluorescence spectrum.
Аннотация. Распространенность онкологических заболеваний ЛОР-органов имеет тенденцию к росту в последние годы. В исследовании описан способ ранней диагностики заболеваний глотки и гортани, сопровождающихся дисплазией эпителия с помощью автофлуоресцентой спектроскопии. Флуоресцентная спектроскопия - неинвазивный, высокочувствительный, универсальный и относительно простой в применении метод, допускающий комбинированную диагностику и возможность работы в реальном времени без травматизации ткани. Его использование в диагностике различных заболеваний обусловлено тем, что в процессе развития патологий происходят биохимические изменения в ткани, а, следовательно, меняется относительное содержание основных флуорофоров и хромофоров, изменяются морфологические и гистологические параметры ткани и, как результат, их вклад в общий наблюдаемый спектр флуоресценции ткани. Для возбуждения флуоресценции использовался азотный лазер ЛГИ-505 (длина волны возбуждения 337 нм, частота повторения импульсов до 1 кГц, длительность импульса 610 нс). Регистрация спектров автофлуоресценции проводилась с помощью спектроанализатора с оптоволоконным вводом LESA-7med. Для исследования нами использовался препарат гортани, полученный при ларингэктомии по поводу гистологически подтвержденного ранее рака гортани. В строго ограниченных участках слизистой, с которых снимались спектры автофлуоресценции, нами взята биопсия. Проводилось стандартное гистологическое исследование биоптатов Продемонстрирована прямая корреляция результатов автофлуоресцентной спектроскопии и гистологического исследования идентичных по локализации участков исследуемого объекта. Таким образом, в ходе работы нами установлено, что для плоскоклеточного рака характерно, наряду с общим уменьшением интенсивности флуоресценции, появление главного максимума спектра в области 435-455 нм. Низкое содержание НАДН в опухолевых клетках, а также развивающаяся при злокачественных заболеваниях
medical & pharmaceutical
JOURNAL "PULSE"
2022. Vol.24. №5
Key words: autofluorescence diagnostics, spectroscopy, tumors, laryngeal cancer, ENT oncology.
диспротеинемия являются основной причиной снижения интенсивности спектра автофлуоресценции.
Ключевые слова: автофлуоресцентная диагностика, спектроскопия, опухоли, рак гортани, ЛОР-онкология.
Введение. По данным Московского научно-исследовательского онкологического института им. П. А. Герцена ежегодно в период наблюдения с 2007 г по 2017год заболеваемость злокачественными заболеваниями гортани и глотки неуклонно растет (Таблица 1), при этом распространенность запущенных стадий также увеличивается (Таблица 2) [1].
Таблица 1 Распространенность злокачественных заболеваний гортани и глотки в России на 100.000 населения на 2017 год
Орган 2QQ7 год 2Q17 год
Глотка 1Q,1 12,Q
Гортань 29,2 3Q,4
Table 1
Prevalence of malignant diseases of the larynx and pharynx in Russia per 100,000 population in 2017
Organ 2QQ7 year 2Q17 year
pharynx 1Q,1 12,Q
larynx 29,2 3Q,4
Таблица 2
Динамика удельного веса больных раком глотки и гортани в соответствии со стадией процесса (%)
Орган 1-2 стадия 4 стадия
2QQ7 год 2Q17 год 2QQ7 год 2Q17n^
глотка нет данных 16,5 38,8 44,2
гортань 34,8 39,3 16,Q 2Q,1
Table 2
Dynamics of the proportion of patients with cancer of the pharynx and larynx in accordance with the stage of the process (%)
Organ 1-2 stage 4 stage
2QQ7 year 2Q17 year 2QQ7 year 2Q17 year
pharynx no data 16,5 38,8 44,2
larynx 34,8 39,3 16,Q 2Q,1
Как видно из приведенных данных, несмотря на некоторую положительную динамику, в подавляющем большинстве случаев первично диагностируются запущенные формы, которые являются прогностически неблагоприятными для больного. Помимо деонтологического аспекта, онкологические больные нуждаются в проведении дорогостоящего комбинированного лечения, которое чаще всего заканчивается инвалидностью, что приводит к значительным расходам и потере квалифицированного трудового потенциала.
Для справки: на 2020 год рынок отечественных противоопухолевых препаратов в России оценивается в 76 миллиардов рублей, многие препараты иностранного производства недоступны [2]. Это делает терапию онкологических заболеваний дорогостоящей и доступной далеко не всем в ней нуждающимся.
Анализ приведенных данных диктует необходимость совершенствования методов ранней диагностики рака гортани глотки, тем более что слизистые оболочки этих органов хорошо обозримы при рядовых медицинских осмотрах оториноларинголога. В этом аспекте значительные перспективы связаны с привлечением в медицину лазерных технологий, которые могут быть использованы на диагностическом этапе [3].
Качественно новый подход к диагностике рака появился с открытием биологически активных веществ, обладающих способностью
флуоресцировать. Более 100 лет назад, из природного сырья были выделены порфирины. Первые исследования биологической активности порфиринов провел Хаусман в 1909 году на веществе, выделенном из крови и получившему название гематопорфирин. Автором установлено, что добавление этого вещества в культуру простейших, увеличивало ее чувствительность к свету. Другой исследователь Бетц в 1913 году продемонстрировал подобный эффект на себе. Он ввел внутривенно солевой раствор
гематопорфирина и после короткой экспозиции на солнце наблюдал четкое проявление сенсебилизирующего действия: увеличение пигментации, шелушение кожи, отек. Способность молекул порфиринов избирательно накапливаться в опухолевых тканях была установлена в 1942 году (Auler) при исследованиях злокачественных опухолей молочных желез мышей. В 1948 году учеными Figge, Weiland было отмечено, что эффект аккумуляции экзогенных порфиринов проявлялся в быстро пролиферирующих и регенерирующих тканях и особенно в опухолях. Это послужило началом целенаправленных работ по диагностике и лечению онкологических заболеваний.
В настоящее время известно множество биохимических компонентов, молекулы которых обладают способностью флуоресцировать -эндогенные флуорофоры.
Одним из методов диагностики в онкологии является спектральный анализ, который, уже на современном этапе идет наряду с гистологическим исследованием и позволит улучшить
medical & pharmaceutical
JOURNAL "PULSE"
2022. Vol.24. №5
специфичность цитологического скрининга злокачественных опухолей. Благодаря высокой селективной чувствительности, этот метод позволяет определить содержание различных метаболитов в тканях человека и связать их присутствие с состоянием метаболизма в норме и патологии [4, 5].
Цель настоящего исследования - выявить прямую корреляцию результатов автофлуоресцентной спектроскопии и гистологического исследования идентичных по локализации участков исследуемого объекта.
Материалы и методы. В нашем исследовании макропрепарата гортани, с заведомо известным гистологическим диагнозом плоскоклеточный неороговевающий рак использовался один из методов диагностики - флуоресцентная спектроскопия. Флуоресцентная спектроскопия -неинвазивный, высокочувствительный,
универсальный и относительно простой в применении метод, допускающий
комбинированную диагностику и возможность работы в реальном времени без травматизации ткани. Его использование в диагностике различных заболеваний обусловлено тем, что в процессе развития патологий происходят биохимические изменения в ткани, а, следовательно, меняется относительное содержание основных флуорофоров и хромофоров, изменяются морфологические и гистологические параметры ткани и, как результат, их вклад в общий наблюдаемый спектр флуоресценции ткани.
Исследование проводилось через 1 час после удаления органа. Препарат максимально отмыт от следов крови физиологическим раствором. Спектры автофлуоресценции снимались в участках слизистой гортани, которые после исследования были отправлены на гистологический анализ. Для возбуждения флуоресценции использовался азотный лазер ЛГИ-505 (1) (длина волны возбуждения 337 нм, частота повторения импульсов до 1 кГц, длительность импульса 6-10 нс). Регистрация спектров автофлуоресценции проводилась с помощью спектроанализатора с оптоволоконным вводом LESA-7med (7).
Волоконно-оптический зонд (3), представляет собой световод с двумя отводами. Один из них -центральное освещающее волокно, служит для подвода излучения к поверхности образца (рис.2). Вокруг центрального волокна размещены 6 световодов, предназначенных для сбора флуоресценции. Расстояние от центра освещающего волокна до центров принимающих волокон составляет 260 - 290 мкм. Собирающие люминесценцию волокна собраны во второй отвод, соединенный со спектроанализатором. Их торцы
собраны в вертикальную линейную структуру, имитирующую входную щель спектрального прибора.
Результаты и обсуждение. В данном исследовании будет рассмотрен препарат гортани, полученный при ларингэктомии по поводу гистологически подтвержденного рака гортани. Макроскопическая картина препарата: на разрезе имеется новообразование светло-серого цвета, плотной консистенции, с неровными краями, бугристой поверхностью, участками некроза, визуально занимающее весь правый желудочек, большую часть подскладочного пространства справа. На левую половину гортани визуально опухоль не переходила. Исследуемые области препарата условно можно разделить на следующие зоны:
1. Визуально неизмененная слизистая (надгортанник, правая истинная голосовая складка, правая ложная голосовая складка).
2. Визуально различимая зона перехода опухоли в
здоровую слизистую (подскладочное пространство справа, межскладочная область).
3. Зона явного опухолевого роста (правый желудочек, правая подголосовая область).
Общая спектрограмма препарата гортани представлена на Рисунке 1.
В строго ограниченных участках слизистой, с которых снимались спектры автофлуоресценции, взята биопсия. Проводилось стандартное гистологическое исследование биоптатов, результатом которого стали представленные материалы:
1. Надгортанник: отек хряща надгортанника, элементов опухолевого роста не найдено (Рис. 2).
2. Правая ложная голосовая складка: в присланном материале обнаружены очаги гиперплазии плоского эпителия, элементов опухолевого роста не найдено (Рис. 3).
3. Правая истинная голосовая складка: гиперплазия желез, отек слизистой. Элементов опухолевого роста не выявлено (Рис. 4).
4. Правый желудочек: в присланном материале обнаружен плоскоклеточный ороговевающий рак (Рис. 5).
5. Межскладочное пространство: отек, гиперплазия желез слизистой оболочки. Элементов опухолевого роста не найдено (Рис. 6).
6. Визуальная зона перехода опухоли в здоровую слизистую (подскладочное пространство справа): обнаружен плоскоклеточный ороговевающий рак (рис.7).
7. Центральная часть опухоли (подскладочное пространство справа): плоскоклеточный ороговевающий рак (рис.8).
medical & pharmaceutical
JOURNAL "PULSE"
2022. Vol.24. №5
8. С целью проведения интерпретации спектров автофлуоресценции мы построили
относительные спектры, разделив спектры с различных участков на спектр заведомо непораженной ткани - спектр надгортанника. Результаты приведены на рисунке 9.
Можно отметить, что наряду с общим уменьшением интенсивности флуоресценции по мере развития злокачественного новообразования наблюдается смещение максимальной
интенсивности в спектре от 408-410 нм для нормы до 435-455 нм в случае новообразования. По мере продвижения к центру опухоли смещение становится все более выраженным. В клеточной массе плоскоклеточного рака крайне малое количество коллагена и эластина - основных флуорофоров соединительной ткани, которые флуоресцируют при длине волны возбуждения 337,1 нм. Клетки плоскоклеточного рака содержат кератиновые включения, не характерные для клеток здоровой слизистой. Однако кератин является хромофором, интенсивность флуоресценции которого крайне мала, поэтому его наличие не приводит к значительному повышению
интенсивности автофлуоресценции опухолевой массы. Для центральной зоны зрелой плоскоклеточной злокачественной опухоли характерна низкая митотическая активность, низкое содержание дыхательных ферментов. Перестройка в биоэнергетических процессах клетки (преобладание анаэробного гликолиза) приводит к уменьшению концентрации окисленных форм дыхательных коферментов НАДН и НАДФН. Флуоресценция белков и коферментов НАДН, НАДФН находится в области длин волн 450-460 нм, и возбуждается излучением 337,1 нм. Низкое содержание НАДН в опухолевых клетках, а также развивающаяся при злокачественных заболеваниях диспротеинемия также являются причиной снижения интенсивности спектра автофлуоресценции. Как уже отмечалось, спектр автофлуоресценции состоит в совокупности из автофлуоресценции флуорофоров как самой слизистой оболочки, так и флуорофоров подлежащих тканей.
Таким образом, для плоскоклеточного рака характерно, наряду с общим уменьшением интенсивности флуоресценции, появление главного максимума спектра в области 435-455 нм.
ОО 500
Длина волны нм
Рис.1 - Рак гортани, спектрограмма препарата гортани ex Рис.2.
Гистологическая
картина,
соответствующая спектру 1.
Fig.1 - Laryngeal cancer, spectrogram of an ex vivo larynx Fig.2 - Histological image corresponding to
preparation.
spectrum 1.
Рис.3 - Гистологическая картина, соответствующая спектру 2.
Fig.3 - Histological image corresponding to spectrum 1.
Рис.4 - Гистологическая картина, соответствующая спектру 3. Fig.4 - Histological image corresponding to spectrum 3.
medical & pharmaceutical
JOURNAL "PULSE"
2022. Vol.24. №5
Рис.5 - Гистологическая картина, соответствующая спектру 4.
Fig.5 - Histological image corresponding to spectrum 4.
Рис.6 - Гистологическая картина, соответствующая спектру 5. Fig.6 - Histological image corresponding to spectrum 5.
Рис.7 - Гистологическая картина, соответствующая спектру 6.
Fig. - Histological image corresponding to spectrum 6.
Рис.8 - Гистологическая картина, соответствующая спектру 7 Fig.8 - Histological image corresponding to spectrum 7.
1.4 —г
_0
11,2-
О
1
III
S 1.0-
"
1
ф
т 0,8-
ь.
тс
(U т 0.5-
_ü
1
ф 0,4-
■ч
< >
0,2-
X
о
0,0-
Ложная голосо&а
связка гр ан ни нал область зона ПЕрЕхода опухол ь
400
500
600
Длина волны, нм
Рис.9 - Относительный спектр аутофлуоресценции участков гортани ex vivo Fig.9 - Relative spectrum of autofluorescence of areas of the larynx ex vivo.
Заключение. Построенные нами относительные спектры автофлуоресценции, выявляют четкую корреляцию с результатами гистологического исследования: локализации, где обнаружены очаги плоскоклеточного рака имеют интенсивность автофлуоресценции приблизительно в пять раз ниже, чем интенсивность флуоресценции гистологически неизмененной области. Подозрительные участки, но гистологически неизмененные имеют интенсивность автофлуоресценции сравнимую со здоровой тканью. В этом случае небольшое снижение интенсивности может быть связано с гистологическими проявлениями местного воспаления. Прямая корреляция автофлуоресцентной спектроскопии и стандартного гистологического исследования может служить критерием достоверности метода.
REFERENCES БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
[1] Vlasov, V.P. Malignant neoplasms of the respiratory system / Vlasov V.P., Ivanov Y.S., Chudakov A.V. // Derzhavin Forum. 2020.Vol. 4. No. 15, pp. 165-172. [2] Kalinina N. The market is driven by the state segment. Remedium. 2020; (9): 18-20. https://doi.org/10.21518/1561-5936-2020-9-18-20 [1] Власов, В.П. Злокачественные новообразования дыхательной системы / Власов, В.П., Иванов Я.С., Чудаков А.В. // Державинский форум. 2020. Т. 4. № 15. С. 165-172.
medical & pharmaceutical
JOURNAL "PULSE"
2022. Vol.24. №5
[3] Allakhverdieva, G.F. Possibilities of ultrasound examination in the diagnosis of tumors of the larynx and laryngopharynx / Allakhverdieva G.F., Sinyukova G.T., Danzanova T.Yu., Kovaleva E.V., Saprina O.A., Gudilina E.A. // Tumors of the head and neck. 2019.Vol. 9. No. 2.P. 17-28.
[4] Mareev, O. V. Possibilities of autofluorescent diagnostics of laryngeal and pharyngeal cancer / Mareev O.V., Pravdin A.B., Afonina O.I., Filina E.V. // Bulletin of otorhinolaryngology. 2008. No. 1. S. 39-42.
[5] Chernova, S., Pravdin A, Tuchin V. On polarized collimated transmittance of tissue-like phantom / Chernova, S., Pravdin A, Tuchin V. // Proc. SPIE. - 1997. - Vol. 2981. - P. 230-234.
[2] Калинина Н. Рынком движет госсегмент. Ремедиум. 2020;(9): 18-20. https://doi.org/10.21518/1561-5936-2020-9-18-20
[3] Аллахвердиева, Г.Ф. Возможности ультразвукового исследования в диагностике опухолей гортани и гортаноглотки / Аллахвердиева Г.Ф., Синюкова Г.Т., Данзанова Т.Ю., Ковалева Е.В., Саприна О.А., Гудилина Е.А. // Опухоли головы и шеи. 2019. Т. 9. № 2. С. 17-28.
[4] Мареев, О.В. Возможности автофлуоресцентной диагностики рака гортани и глотки / Мареев О.В., Правдин А.Б., Афонина О.И., Филина Е.В. // Вестник оториноларингологии. 2008. № 1. С. 39-42.
[5] Chernova, S., Pravdin A, Tuchin V. On polarized collimated transmittance of tissue-like phantom / Chernova, S., Pravdin A, Tuchin V. // Proc. SPIE. -1997. - Vol. 2981. - P. 230-234.
Вклад авторов: Мареев О.В. — концепция и дизайн исследования; Мареев Г.О. —анализ полученных данных, написание текста; Афонина О.И. — разработка методики исследования, сбор и обработка материалов, написание текста.
Информация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Mareev GO. - SPIN ID: 5502-4395; ORCID ID: 0000-0002-7240-5651
Mareev O.V. - SPIN ID: 1250-9662; ORCID ID: 0000-0002-5906-8080
Afonina O.I. - SPIN ID: 3595-8851; ORCID ID: 0000-0002-5118-1812
For citation: Mareev G.O., Mareev O.V., Afonina O.I. AUTOFLUORESCENCE SPECTRA OF A SPECIMEN OF NON-KERATINIZING LARYNGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA IN ACCORDANCE WITH A HISTOLOGICAL STUDY // Medical & pharmaceutical journal «Pulse». - 202 2. - Vol.24. №5. - pp. 13-18. Doi: http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-5-13-18.
Для цитирования: Мареев Г.О., Мареев О.В., Афонина О.И. СПЕКТРЫ АВТОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ МАКРОПРЕПАРАТА ПЛОСКОКЛЕТОЧНОГО НЕОРОГОВЕВАЮЩЕГО РАКА ГОРТАНИ В СООТВЕТСТВИИ С ГИСТОЛОГИЧЕСКИМ ИССЛЕДОВАНИЕМ // Медико-фармацевтический журнал "Пульс". - 2022. - Т.24. №5. - С. 13-18. Doi: http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-5-13-18.
