CC BY
24
ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ УДК 535.372
СПЕКТРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ ПУРПУРНЫХ СЕРНЫХ БАКТЕРИЙ Chromatium sp. В ВОДНОЙ
СРЕДЕ
A.C. Милюков, C.B. Пацаева, В.И. Южаков, E.JI. Ростовцева*'
(.кафедра общей физики) E-mail: [email protected]
Проведено спежтросжопичесжое исследование с целью выяснения спектральных особенностей пурпурных фотосинтезирующих серных бажтерий рода Chromatium sp. для различных стадий развития жультуры и при изменении условий выращивания. Описаны возможности использования спежтров поглощения и люминесценции жлетож бажтерий для оценжи их численности в определенном диапазоне жонцентраций. Соотношения полос порфиринов и «синей» люминесценции могут применяться для оценжи физиологичесжого состояния жультуры.
Прибрежная зона морей в первую очередь подвержена антропогенным воздействиям, которые охватывают все новые акватории. Поэтому мониторинг этой зоны, в том числе биологический, важен с точки зрения контроля состояния биоты наиболее интенсивно загрязняемых акваторий и как звено фонового мониторинга биосферы [1].
Экологический мониторинг может быть эффективным при условии достаточной разветвленности сети станций наблюдения и регулярности поступления с них первичной информации. Список абиотических параметров для мониторинга достаточно традиционен: температура, соленость, концентрация основных элементов и т. п. С биотическими параметрами, прежде всего с обилием отдельных видов, ситуация гораздо сложнее. Для определения отдельных видов требуется участие квалифицированных специалистов. Попыткой обойти эту трудность является концепция видов-индикаторов, по состоянию которых судят об изменениях в сообществе. Для мониторинга особое значение приобретает разработка экспресс-методов, позволяющих судить о состоянии сообщества.
Методы спектрального анализа с успехом применяются для исследования фитопланктона [2-3] и определения растворенного органического вещества [4-6] в природной воде. Авторы сделали попытку применить спектральный анализ для учета численности и оценки состояния пурпурных серных бактерий, которые являются важной составляющей биоты прибрежных акваторий.
Объектом исследования данной работы стали пурпурные серные бактерии рода Ch.roma.tium. Пур-
пурные фотосинтезирующие бактерии широко распространены в природе. Они встречаются почти в каждом водном бассейне, а также в почве. Основными местами их обитания являются пресные и соленые водоемы, содержащие сероводород. В водоемах застойного типа, богатых органическими веществами, пурпурные бактерии развиваются в огромных количествах, образуя массовые скопления. Эти бактерии осуществляют фотосинтез, поглощая свет с длиной волны от 800 до 900 нм [7].
Наиболее часто встречаются в природных водах представители рода СЬготайит, которые растут в толще воды и образуют скопления на дне водоемов, легко адаптируясь к различному солевому составу воды, содержанию растворенного кислорода, концентрации органических веществ, температуре и рН. Эти микроорганизмы являются важным звеном в цепи превращения серы в различных водоемах. Благодаря их способности окислять сероводород водоемы очищаются от этого ядовитого соединения [8].
Применение спектральных методов для изучения физиологического состояния пурпурных серных бактерий в перспективе может служить инструментом биомониторинга водоемов, позволяющим быстро оценивать реакцию сообщества фототрофных бактерий на изменения физико-химических условий внешней среды.
Целью нашего исследования являлось выяснение спектральных особенностей пурпурных серных бактерий рода СЬготайит для различных стадий развития культуры и при изменении условий выращивания. Проводились измерения епек-
Биологический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова.
тров поглощения, возбуждения и испускания флуоресценции для культуры в различных фазах развития (экспоненциальной, стационарной и др.) и для культуры, выращенной при различном освещении. Спектры поглощения измерялись на спектрофотометре Specord М40 в области длин волн 200-900 нм. Спектры люминесценции при возбуждении на 270 и 390 нм регистрировались приборами Jobin Yvon 3CS и Perkin Elmer LS55 в спектральном диапазоне до 800 нм. Все измерения культур бактерий проводились в стандартных кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см.
Спектры поглощения культуры
Chromatium sp.
Спектры поглощения бактериальной культуры Chromatium sp., приведенные на рис. 1, имеют ярко выраженные максимумы поглощения протопорфири-на при Л = 390 нм и одной из форм бактериохлоро-филла (Бхл800) около Л = 800 нм. Цвет пурпурных серных бактерий определяется наличием кароти-ноидов, интенсивно поглощающих в сине-зеленой области спектра. Однако пики индивидуальных соединений каротиноидов не различимы на широком фоне поглощения других органических соединений и рассеяния клеток. В спектрах поглощения культуры in vivo, в отличие от экстрактов в органических растворителях, присутствует довольно интенсивное рассеяние света клетками. Вклад рассеяния увеличивается с уменьшением длины волны света и в УФ-области превалирует над поглощением пигментов клеток.
Длина волны, нм
Рис. 1. Спектры поглощения культуры Скго-тайит эр., выращенной в различных условиях
При разведении питательной средой культуры с известной численностью, установленной путем прямого счета [9], оптическая плотность монотонно падает во всем исследованном спектральном диапазоне. Последовательное разведение культуры пита-
тельной средой дало возможность оценить область применимости спектров поглощения для учета численности бактерий. Значение оптической плотности в области поглощения пигментов пурпурных бактерий — протопорфиринов (390 нм), каротиноидов (около 600 нм) и бактериохлорофилла (800 нм) — описывается линейной зависимостью от концентрации бактерий в воде вплоть до концентраций 6 млн клеток/мл (рис. 2). При больших концентрациях бактерий оседание клеток в процессе измерения не позволяет провести измерения корректно.
Рис. 2. Зависимость оптической плотности от численности бактерий
Сравнение оптической плотности семидневной культуры бактерий, выращенной в различных условиях (в темноте, при дневном свете и в люмино-стате), показывает (рис. 1), что более быстрый рост клеток в экспоненциальной фазе развития культуры происходит при большей интенсивности освещения.
Спектры люминесценции культуры
СкготаИит ер.
В спектре испускания культуры бактерий СкготаИит эр. можно выделить три главные полосы в УФ и видимой областях спектра:
— УФ-полоса триптофановых остатков белковых комплексов с максимумом при Л = 340^350 нм при возбуждении длиной волны короче 270 нм;
— широкая синяя полоса люминесценции клеток с максимумом при Л = 440 -=-450 нм;
— узкие полосы свечения порфириновых соединений с максимумом на 616 нм и 680 нм, максимум спектра возбуждения которых приходится на 390 нм.
Зависимость интенсивности люминесценции от численности клеток для различных полос испускания при возбуждении излучением с длиной волны 390 нм показана на рис. 3.
Для выяснения вопроса о применимости люминесцентного метода учета численности бактерий
Рис. 3. Зависимость интенсивности люминесценции культуры пурпурных бактерий в фазе экспоненциального роста от численности клеток для различных полос испускания
проводился эксперимент по разведению культуры бактерий питательной средой в известное число раз. Было обнаружено, что интенсивность свечения для всех трех полос флуоресценции при увеличении концентрации клеток в растворе сначала линейно возрастает, а затем выходит на насыщение (отклонение от линейного роста, иногда даже падает). Наличие предельной концентрации (около 2 млн клеток/мл), после которой интенсивность флуоресценции практически перестает расти, может быть обусловлено большим поглощением возбуждающего света и испущенного сигнала флуоресценции в концентрированном растворе (перепоглощение).
Таким образом, собственная флуоресценция пурпурных серных бактерий в водной среде может быть использована для их количественной диагностики, так как линейная зависимость интенсивности свечения и численности клеток наблюдается в определенном концентрационном диапазоне — для численности бактерий до 2 млн клеток/мл.
Интенсивность люминесценции зависит не только от численности клеток, но и от условия их выращивания. На рис. 4 приведены спектры люминесценции при возбуждении на длине волны 390 нм для культуры бактерий, выращенной в различных условиях — в темноте, при естественном освещении и в люминостате. На каждом графике для сравнения показаны спектры для культуры возраста 7 (экспоненциальная фаза роста) и 28 дней (стационарная фаза). Наибольшие значения интенсивности
Длина волны возбуждения 390 нм
Культура, выращенная tj 60 - при дневном освещении
м 40 - [ -возраст 7 дней
5 ] -возраст 28 дней
^ 20 -Jr
0 [—,-,-,-,-;-f^4-
400 450 500 550 600 650 700
Длина волны, нм
Рис. 4. Спектры флуоресценции культуры пурпурных бактерий, выращенной в различных условиях, в различном физиологическом состоянии
«синей» люминесценции и свечения порфиринов для семидневной культуры наблюдались для бактерий, выращенных в люминостате, а наименьшие — для бактерий, выращенных в темноте, что находится в хорошем согласии с соответствующими спектрами поглощения. Через 3 недели хранения проб при естественной освещенности концентрации клеток в пробах приблизительно выравниваются, что хорошо видно из спектров флуоресценции при сопоставлении «синей» люминесценции для различных проб. Также можно заметить, что с течением времени практически исчезает полоса свечения порфирино-вых пигментов при переходе в стационарную фазу развития.
Соотношения интенсивностей полос в максимуме порфиринов /,, и «синей» люминесценции I,
Молодая культура Зрелая культура
Концентрация, % /р, отн. ед. If, отн. ед. Ip/'f /р, отн. ед. If, отн. ед. h/h
10 14 26 0.54 8 35 0.22
15 24 40 0.60 13 56 0.23
22 25 45 0.55 10 44 0.23
33 18 48 0.38 14 87 0.16
50 33 58 0.57 11 49 0.22
Следовательно, на интенсивность полосы флуоресценции порфиринов для культуры Chro-matium sp. оказывает влияние не только различная освещенность, но также фаза развития культуры. При «старении» культуры сильно уменьшается интенсивность свечения порфиринов, и при этом меняется соотношение интенсивностей полос порфиринов и «синей» люминесценции клеток [10, 11].
Проводились специальные эксперименты с культурами различного возраста, в которых было обнаружено, что соотношение интенсивностей УФ полосы и «синей» люминесценции клеток при «старении» культуры возрастает почти в 2 раза. В то же время соотношение полос порфиринов и «синей» люминесценции, наоборот, при старении культуры значительно падает — в 2.5 раза (таблица). Эти соотношения могут применяться для оценки физиологического состояния культуры клеток.
Основные результаты и выводы
1. Спектры поглощения и люминесценции клеток бактерий могут быть использованы для оценки численности бактерий ш vivo в водной среде в определенном диапазоне концентраций клеток:
— значение оптической плотности в области поглощения пигментов пурпурных бактерий — протопорфиринов (390 нм) и бактериохлорофилла (800 нм) — описывается линейной зависимостью от концентрации бактерий в воде вплоть до концентраций 6 млн клеток/мл;
— флуоресценция пурпурных бактерий в области свечения триптофановых остатков (350 нм) при возбуждении длиной волны 270 нм и «синей» люминесценции клеток (450 нм) при возбуждении длиной волны 390 нм может быть использована для оценки численности пурпурных серных бактерий до концентрации 2 млн клеток/мл.
2. Сравнение спектрально-люминесцентных свойств культуры пурпурных серных бактерий, выращенных при различном освещении, показало, что численность бактерий в экспоненциальной фазе роста наибольшая для культуры, выращенной в люминостате, и наименьшая для культуры, выращенной в темноте. Через 3 недели содержания при естественном освещении в стационарной фазе концентрации бактерий становятся близкими, но меняется соотношение пигментов в клетках, что
проявляется изменением отношения интенсивностей полос.
3. Эксперименты с культурами в разной фазе роста показали, что соотношение полос порфиринов и «синей» люминесценции могут применяться для оценки физиологического состояния культуры пурпурных серных бактерий.
На основе полученных закономерностей в дальнейшем могут быть разработаны методы экспрессного экологического мониторинга.
Литература
1. Михайловский Г.Е., Лившиц A.B. Биологический мониторинг прибрежных вод Белого моря. М., 1990.
2. Фадеев В.В., Бунин Д.К., Венедиктов П.С. // Квант, электрон. 1996. 23, № 11. С. 963.
3. Маслов Д.В., Фадеев В.В., Литвинов H.H. // Вестн. Моск. ун-та. Физ. Астрон. 2002. № 1. С. 34 (Moscow University Phys. Bull. 2002. N 1. P. 30).
4. Пацаева C.B., Фадеев В.В., Южаков В.И. и др. // Вестн. Моск. ун-та. Физ. Астрон. 1992. 33, № 5. С. 38 (Moscow University Phys. Bull. 1992. 47, N 1. P. 35).
5. Пацаева C.B., Филиппова Е.М., Южаков В.И. и др. // Вестн. Моск. ун-та. Физ. Астрон. 1991. 32, № 4. С. 76 (Moscow University Phys. Bull. 1991. 46, N 4. P. 73).
6. Пацаева C.B., Чубарое В.В., Южаков В.И. и др. // Вестн. Моск. ун-та. Физ. Астрон. 1991. 32, № 6. С. 71 (Moscow University Phys. Bull. 1991. 46, N 6. P. 66).
7. Кондратьева E.H. Фотосинтезирующие бактерии и бактериальный фотосинтез. М., 1972.
8. Заварзин Г.А., Колотилова H.H. Введение в природоведческую микробиологию. М., 2001.
9. Разумов A.C. // Микробиология. 1932. 1, № 2. С. 131.
10. Милюков А. С., Пацаева C.B., Ростовцева Е.Л., Южаков В. И. II Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005». Секция «Физика». Физический факультет МГУ. Москва. 10-15.04.2005. 1. С. 61.
11. Агеев Д.В., Пацаева C.B., Южаков В.И., Ростовцева Е.Л. II Физические проблемы экологии (экологическая физика). 2004. № 12. С. 129.
Поступила в редакцию 01.03.06
