CC BY
61
УДК 543.42.062
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЛАВОНОИДОВ ПО РЕАКЦИИ АЗОСОЧЕТАНИЯ С ТЕТРАФТОРОБОРАТОМ 4-НИТРОФЕНИЛДИАЗОНИЯ
В.А. Кудринская, С.Г. Дмитриенко, Ю.А. Золотое
(кафедра аналитической химии; e-mail: dmitrienko@analyt.chem.msu.ru)
В качестве реагента для спектрофотометрического определения флавоноидов предложен тетрафтороборат 4-нитрофенилдиазония (4-НФД). Показано, что в щелочной среде 4-НФД вступает в реакцию азосочетания с кверцетином, нарингенином, хризином, морином, рути-ном и нарингином с образованием окрашенных в желто-оранжевый цвет продуктов. Оптимизированы условия проведения спектрофотометрической реакции. Разработана методика спектрофотометрического определения флавоноидов с пределами обнаружения (1,5 -3,9)х 10 М (0,05 - 0,16 мкг/мл). Проведено определение кверцетина в лекарственных препаратах.
Ключевые слова: флавоноиды, тетрафтороборат 4-нитрофенилдиазония, азосо-четание, спектрофотометрическое определение.
Флавоноиды - широко распространенные природные антиоксиданты. Они содержатся во многих растениях [1-4], в чае, пиве, соках, винах [5-9]. Флавоноиды оказывают многостороннее воздействие на организм человека. Они обладают противовоспалительным, антигистаминным, антиоксидантным, проти-воотечным и противораковым действием, стабилизируют клеточные мембраны, тормозят процессы старения, положительно влияют на функцию сердечнососудистой системы [10, 11], поэтому их вводят в состав многих биологически активных добавок (БАД и некоторых лекарственных препаратов [1, 3, 12-14].
Для определения флавоноидов используют спектроскопические [12-21], хроматограф ические [2, 3, 5, 6, 8, 9], электрохимические [22-27], кинетические [28] методы анализа и капиллярный электрофорез [6, 29]. Наиболее простым и удобным в использовании является спектрофотометрический метод, который, в отличие от остальных, не требует дорогостоящего оборудования. Согласно "Руководству по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище" (Р 4.1.1672-03 от 30.06.2003) производные флавона (кверцетин, рутин, морин и хризин) определяют спектрофотометрическим методом в виде комплексов с алюминием (X = 415 нм), а производные флавана (нарингенин и нарингин) - в виде продуктов их взаимодействия с 2,4-динитрофенилгид-разином (X = 495 нм). При этом в БАД обычно регламентируется суммарное содержание производных
либо флавона, либо флавана. Недостатком этого подхода является невозможность одновременного определения суммарного содержания производных флавона и флавана. Поэтому представляется важным разработка новык методик определения этих соединений при совместном присутствии, которые позволили бы определять их суммарное содержание при проведении реакции с одним дериватизирующим реагентом.
В настоящей работе в качестве реагента для спектрофотометрического определения флавоноидов предложен тетрафтороборат 4-нитрофенилдиазония (4-НФД). Ранее этот реагент использовали для спектро-фотометрического определения различных ароматических аминов и фенолов [15]. Основная цель работы заключалась в изучении возможности использования 4-НФД в качестве реагента для спектрофотометри-ческого определения флавоноидов.
Экспериментальная часть
Объекты исследования, реагенты и аппаратура. Объектами исследования служили кверцетин (дигидрат, "Sigma", 98%), нарингенин ("Acros", 97%), морин (гидрат, "Acros"), хризин ("Acros", 99%), рутин ("Acros", 97%) и нарингин ("Acros", 97%). Исходные 0,001-0,01 М растворы этих соединений готовили растворением их точных навесок в ацетоне (кверцетин, нарингенин, хризин) или этаноле (рутин, морин, нарингин). Рабочие растворы готовили разбавлением исходных непосредственно
перед использованием. В качестве дериватизирую-щего реагента использовали 4-НФД, который синтезировали по методике, приведенной в [15]. Исходный раствор 4-НФД (1,25x10 М) готовили растворением точной навески реагента в воде. Карбонат натрия ("ч.д.а."), ацетон ("ч."), этанол ("х.ч.") и другие вещества, использованные в работе, не подвергали дополнительной очистке.
Спектры поглощения и оптическую плотность растворов регистрировали на спектрофотометре "СФ-103" ("Аквилон", Россия).
Результаты и их обсуждение
Оптимизация условий реакции азосочетания флавоноидов с 4-НФД
Предварительное переведение органических соединений в производные с целью усиления интенсивности окраски - известный прием в аналитической химии. В ряде случаев это позволяет существенно повысить чувствительность их определения.
Известно, что фенолы легко вступают в реакции азосочетания с ароматическими солями диазония с образованием интенсивно окрашенных продуктов. В большинстве случаев при выполнении определений раствор диазосоставляющей прибавляют к раствору определяемого фенола (азосоставляющей). Сочетание проводят при рН 7-9 [15]. В качестве диазосоставля-ющих при спектрофотометрическом определении различных фенолов особенно часто используют диазоти-рованные сульфаниловую кислоту и 4-нитроанилин, в частности тетрафтороборат 4-нитрофенилдиазония. Достоинствами 4-НФД являются его устойчивость в твердом виде и водных растворах, высокая скорость протекания реакции азосочетания и интенсивная окраска образующихся азосоединений.
В настоящей работе оценена возможность аналитического применения азосоединений флавоноидов в фотометрическом анализе. Наличие в молекулах флаво-ноидов фенольных групп обусловливает возможность их участия в реакциях азосочетания в качестве азосоставляющей. Однако реакцию взаимодействия тет-
рафторобората 4-нитрофенилдиазония с флавоноидами ранее не изучали.
Реакцию азосочетания флавоноидов с 4-НФД проводили в щелочной среде. О выходе продукта реакции судили по величине оптической плотности раствора. Добавление 4-НФД к растворам кверцетина и других флавоноидов сопровождалось быстрым усилением окраски и появлением оранжевого оттенка у растворов. В спектрах поглощения наблюдалось возникновение новой интенсивной полосы поглощения с максимумом при 425-435 нм в зависимости от природы флавоноида (рис. 1). Это свидетельствует о протекании реакции азосочетания флавоноидов с 4-НФД и об образовании соответствующих окрашенных азосоединений. Установлено, что максимальный выход азосоединений достигается в течение 5 мин. Образующиеся азосоединения устойчивы в водном растворе по крайней мере в течение 1 ч после получения. По аналогии с известными литературными данными о механизме взаимодействия фенолов с солями диазония [15] можно предположить, что флаво-ноиды вступают во взаимодействие с 4-НФД в соответствии со схемой (на схеме в качестве примера азосоставляющей приведен кверцетин).
В связи с наличием в молекуле нескольких реак-ционноспособных центров для каждого из флавоноидов возможно образование ряда продуктов азосочетания с близкими оптическими характеристиками.
С целью выбора оптимальных условий проведения реакции азосочетания на примере взаимодействия кверцетина с 4-НФД было изучено влияние концентраций карбоната натрия и 4-НФД (рис. 2) на выход продукта азосочетания и оптическую плотность раствора. Концентрацию 4-НФД выбрали равной
—з
1,5-10 М. В этом случае максимальный выход продукта имеет место при с(№2С03) > 0,2 М, поэтому в дальнейшем реакцию азосочетания проводили при с^^СО^ = 0,2 М, при этом время развития окраски реакционной смеси составляло около 5 мин.
В табл. 1 приведены значения молярных коэффициентов поглощения флавоноидов и их азосоединений в
С х е м а
Рис. 1. Спектры поглощения: а - флавоноидов (с = 5x10 М, растворитель - ацетон:вода = 1:4); б - продуктов их
взаимодействия с тетрафтороборатом 4-нитрофенилдиазония (с = 10 М, водный раствор, с
4-НФД
= 1,5x10 М,
с(Ка2С03) = 0,2 М), 1 - кверцетин, 2 - рутин, 3 - хризин, 4 - морин, 5 - нарингенин и 6 - нарингин
Рис. 2. Зависимость оптической плотности продукта азосочетания кверцетина с тетрафтороборатом 4-нитрофенилдиазония от концентрации: а - карбоната натрия (с4-НФд = 1,5х10-3 М); б - тетрафторобората 4-нитрофенилдиазония (с(Ка2С03) = 0,2 М), скверц = 6х10-6 М, Хмакс = 425 нм
оптимальных условиях. Максимумы поглощения в спектрах азосоединений флавоноидов находятся при 425-435 нм в зависимости от природы флавоноида, а значения молярных коэффициентов поглощения - в диапазоне (1,8-4,5)х104 л-моль-1-см-1 и превышают молярные коэффициенты поглощения исходных флаво-ноидов в 2-10 раз.
Методика определения флавоноидов
Для построения градуировочных графиков готовили серию растворов, содержащих от 2Х10-6 до 2х10-5 М флавоноида. К каждому раствору добавляли последовательно по 5 мл 1 М раствора карбоната натрия,
-2
3 мл 1,25 х10 М раствора 4-НФД и воду до объема 25 мл. Измеряли оптическую плотность растворов при 425-435 нм в зависимости от природы флавоноида. Метрологические характеристики методик определения приведены в табл. 2. Пределы обнаружения, рассчитанные по 38-критерию, составляют 0,06; 0,05; 0,1; 0,12; 0,05 и 0,16 мкг/мл для кверцетина, наринге-нина, хризина, рутина, морина и нарингина соответственно. Как следует из вышесказанного, методика не уступает по чувствительности другим известным спектрофотометрическим методикам определения флавоноидов [12, 17-20] и позволяет определять эти вещества на уровне (1,5-3,9)х 10 М или 0,05-
0,16 мкг/мл; методика отличается простотой и эксп-рессностью. Правильность спектрофотометрических методик определения отдельных флавоноидов была проверена методом "введено - найдено" на модельных растворах (табл. 3).
Определение кверцетина в лекарственных препаратах
Для оценки возможности практического применения методики проведено определение кверцетина в лекарственных препаратах "Липофлавон", "Корвитин" и "Кверцетин".
Препарат "Липофлавон" применяется в офтальмологии. "Липофлавон" производства ЗАО "Биолек", г. Харьков, Украина, представляет собой лиофилизо-ванный порошок для приготовления глазных капель -аморфную массу светло-желтого цвета с характерным запахом. Форма выпуска препарата - смесь 27,5 мг лецитина, 0,75 мг кверцетина и лактозы во флаконе № 1 и 0,9%-й изотонический раствор хлори-
Т а б л и ц а 1
Значения молярных коэффициентов поглощения флавоноидов (растворитель - ацетон:вода = 1:4) и их азосоединений (водный раствор, с4-нфд = 1,5х10_3 М, с(Ка2С03) = 0,2 М)
Вещество Молярный коэффициент поглощения, вмакс (^макс, ИИ), л-молЪ-1Хм-1
флавоноид азосоединение
Кверцетин 2,0х104 (365) 3,9х104 (425)
Нарингенин 5,4х103 (305) 3,5х104 (430)
Хризин 1,1 х104 (315) 1,8х104 (425)
Рутин 1,8х104 (350) 3,8х104 (430)
Морин 1,0х104 (380) 4,5х104 (435)
Нарингин 3,0х103 (325) 2,5х104 (435)
да натрия во флаконе № 2. Поскольку лецитин и лактоза не вступают в реакцию азосочетания с 4-НФД, то предварительного выделения кверцетина из препа-
Т а б л и ц а 2
Метрологические характеристики спектрофотометрических методик определения флавоноидов с тетрафтороборатом 4-нитрофенилдиазония, с4-нфд = 1,5х10-3 М, с(№2С0з) = 0,2 М, ДОС - диапазон определяемых содержаний, Смин - предел обнаружения
Определяемое вещество Уравнение градуировочного графика (мМ) ДОС, М (мкг/мл) С„ин, M (мкг/мл)
5,4х10-7 - 1,6-10-5 1,810-7
Кверцетин y = 38,8 с (0,18 - 5,41) (0,06)
6,0х10-7 - 1,2-10-5 2,0-10-7
Нарингенин y = 34,7 с (0,16 - 3,27) (0,05)
11,7х 10-7 - 1,610-5 3,910-7
Хризин y = 17,8 с (0,30 - 4,07) (0,1)
5,5х10-7 - 1,2-10-5 1,810-7
Рутин y = 38,1 с (0,36 - 7,97) (0,12)
4,6х10-7 - 1,2-10-5 1,510-7
Морин y = 45,1 с (0,14 - 3,63) (0,05)
Нарингин y = 24,6 с 8,4х10-7 - 1,6-10-5 (0,49 - 9,29) 2,8-10-7 (0,16)
Т а б л и ц а 3
Проверка правильности методики определения флавоноидов методом "введено-
найдено" (n = 3, P = 0,95).
Определяемое вещество мкг/мл sr
введено найдено
Кверцетин 2,7 2,9±0,4 0,05
Нарингенин 1,6 1,6±0,1 0,03
Хризин 1,5 1,6±0,2 0,04
Рутин 4,0 3,9±0,3 0,03
Морин 1,8 1,9±0,2 0,04
Нарингин 3,5 3,7±0,5 0,05
рата не требовалось. Лекарственную форму (0,0307 г порошка "Липофлавона" - содержимое флакона № 1) растворяли в 2,5 мл ацетона с добавлением 0,1 мл 1 М раствора карбоната натрия и воды до объема 25 мл. Для определения брали аликвотную часть этого раствора. Методом градуировочного графика найдено, что в лекарственном препарате содержится 0,7±0,1 мг кверцетина (я= 0,05), что согласуется с данными, заявленными производителем (0,75 мг на 1 флакон № 1).
Лекарственный препарат "Корвитин" применяется в кардиологии. "Корвитин" (ЗАО НПЦ "Борщаговский химико-фармацевтический завод", г. Киев, Украина), представляет собой лиофилизованный порошок для приготовления раствора для инъекций. Форма выпуска препарата - смесь 0,5 г корвитина с гидроксидом натрия. Корвитин является комплексом кверцетина с повидоном (поливинилпирролидоном), 0,5 г корвитина содержат 0,05 г кверцетина в пересчете на безводное вещество и 0,45 г повидона с молекулярной массой 7100-11000 в пересчете на безводное вещество. Лекарственную форму (0,01 г порошка "Корвитина") растворяли в 5 мл ацетона с добавлением воды до объема 50 мл. Для определения брали аликвотную часть этого раствора. Методом градуировочного графика найдено, что в лекарственном препарате содержится 0,052±0,003 г кверцетина (я = 0,03). Это согла-
суется с данными, заявленными производителем (0,05 г на 1 флакон).
Лекарственный препарат "Кверцетин" применяется для лечения воспалений. "Кверцетин" (ЗАО НПЦ "Борщаговский химико-фармацевтический завод", г. Киев, Украина) представляет собой гранулы желтого цвета с зеленоватым оттенком для приготовления геля или суспензии, содержащие смесь кверцетина с яблочным пектином, глюкозой и сахарозой. Форма выпуска препарата - гранулы в пакетах по 2 г, 100 г гранул содержат 4 г кверцетина. Лекарственную форму (0,025 г гранул "Кверцетина") растворяли в 5 мл ацетона с добавлением 0,1 мл 1 М раствора карбоната натрия и воды до объема 50 мл. Для определения брали аликвотную часть этого раствора. Методом градуировочного графика найдено, что в лекарственном препарате содержится 3,9±0,4 г кверцетина (яг = 0,04) в пересчете на 100 г препарата, что также согласуется с данными, заявленными производителем (4 г на 100 г гранул).
Таким образом, проведенные исследования показали возможность использования тетрафторобората 4-нитрофенилдиазония в качестве спектрофотомет-рического реагента для определения флавоноидов. Разработанная методика отличается низкими пределами обнаружения, простотой и хорошей воспроизводимостью.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Беликов В. Г. Фармацевтическая химия. Ч. 2. Специальная фармацевтическая химия. Пятигорск, 2003. С. 457.
2. DingX.-P., Qi J., Chang Y.-X., Mu L.-L., Zhu D.-N., Yu B.-Y. // J. Chromatogr. A. 2009. 1216. P. 2204.
3. Mesbah M. K., Khalifa S. I., El-Gindy A., Tawfik K. A. // II Farmaco. 2005. 60. P. 583.
4. Davis W. B. // Anal. Chem. 1947. 19. P. 476.
5. TarolaA. M., Giannetti V. // Chromatographia. 2007. 65. P. 367.
6. WangS.-P., HuangK.-J. // J. Chromatogr. A. 2004. 1032. P. 273.
7. Molinelli A., Weiss R., Mizaikoff B. // J. Agric. Food. Chem. 2002. 50. P. 1804.
8. Jella P., Rouseff R., Goodner K., Widmer W. // J. Agric. Food Chem. 1998. 46. P. 242.
9. CareriM., Elviri L., Mangia A., Musci M. // J. Chromatogr. A. 2000. 881. P. 449.
10. Manach C., Regerat F., Texier O., Agullo G., Demigne C., Remesy C. // Nutr. Res. 1996. 16. P. 517.
11. Wei B. L, Lu C. M., Tsao L. T, Wang J. P., Lin C. N. // Planta Med. A. 2001. 67. P. 745.
12. Kuntic V., Pejic N., Micic S., Vukojevic V, Vujuc Z., Malesev D. // J. Serb. Chem. Soc. 2005. 70. P. 753.
13. Pejic N., Kuntic V., Vujuc Z., Micic S. // Il Farmaco. 2004. 59. P. 21.
14. Hassan H. N. A., Barsoum B. N., Habib I. H. I. // J. Pharm. Biomed. Anal. 1999. 20. P. 315.
15. Коренман И. М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений. М., 1970.
16. BaranowskaI., RarogD. // Talanta. 2001. 55. P. 209.
17. DowdL. E. // Anal. Chem. 1959. 31. P. 1184.
18. Kaushal G. P., Sekhon B. S., Bhatia I. S. // Mikrochim. Acta [Wien]. 1979. 1. P. 365.
19. Barnum D. W. // Anal. Chim. Acta. 1977. 89. P. 157.
20. Kuntic V., Blagojevic S., Malesev D., Radovic Z., Bogavac M. // Monatshefte Chemie. 1998. 129. P. 41.
21. Зелъцер Л. E., Талипов Ш. Т., Морозова Л. А. // ЖАХ. 1981. 36. P. 1477.
22. LinX.-Q, He J.-B, ZhaZ.-G. // Sens. Act. B. 2006. 119. P. 608.
23. Xiao P., Zhou Q., Xiao F., Zhao F., Zeng B. // Int. J. Electrochem. Sci. 2006. 1. P. 228.
24. Zhang S, Dong S., Chi L., He P., Wang Q, Fang Y. // Talanta. 2008. 76. P. 780.
25. Freitas K. H. G., Medeiros R. A., Fatibello-Filho O. // Anal. Lett. 2009. 42. P. 881.
26. Pedrosa V. A., MalaguttiA. R., Mazo L. H., AvacaL. A. // Anal. Lett. 2006. 39. P. 2737.
27. Adam V., MikelovaR., Hubalek J., HanustiakP., BeklovaM., Hodek P., Horna A., Trnkova L., 1. Stiborova M., Zeman L., KizekR. // Sensors. 2007. 7. P. 2402.
28. Kostic D. A., Mitic S. S., Miletic G. Z. // J. Serb. Chem. Soc. 2004. 69. P. 477.
29. XuX., Ye H., Wang W, Chen G. // J. Agric. Food Chem. 2005. 53. P. 5853.
Поступила в редакцию 20.01.10
SPECTROPHOTOMETRIC DETERMINATION OF FLAVONOIDS BY THE REACTION WITH (4-NITROPHENIL)DIAZONIUM TETRAFLUOROBORATE
V.A. Kudrinskaya, S.G. Dmitrienko, Yu.A. Zolotov
(Division of Analytical Chemistry)
(4-Nitrophenil)diazonium tetrafluoroborate (4-NPD) has been suggested as a reagent for the spectrophotometric determination of flavonoids. It has been shown that in alkaline medium 4-NPD enters into the diazotization reaction with quercetin, naringenin, chrysin, morin, rutin and naringin to form peach-coloured products. The conditions for the spectrophotometric reaction have been optimized. Spectrophotometric method for the determination of flavonoids with detection limits (1.5 -3.9)-10"7 M (0.05 - 0.16 ^g/mL) has been developed. Quercetin has been determined in some pharmaceutical compositions.
Key words: flavonoids, (4-nitrophenil)diazonium tetrafluoroborate, diazotization, spectrophotometric determination.
Сведения об авторах: Кудринская Вера Александровна - аспирант кафедры аналитической химии химического факультета МГУ (vera_d@rambler.ru); Дмитриенко Станислава Григорьевна - профессор кафедры аналитической химии химического факультета, докт. хим. наук (dmitrienko@analyt.chem.msu.ru); Золотое Юрий Александрович - зав. кафедрой аналитической химии химического факультета МГУ, академик, (zolotov@analyt.chem.msu.ru).
